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儿茶素对huvecs细胞胆固醇蓄积及SREBP-2基因表达的影响

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海峡药学 2021年第8期33卷 11-14页

作者：彭颖潘薇韩燕慧朱平平彭玲芳丁岚南华大学药学院肿瘤微环境响应药物研究湖南省重点实验室湖南衡阳421001

目的探讨儿茶素对huvecs细胞内胆固醇蓄积以及对SREBP-2基因表达的影响。方法60μmol·L^(-1)儿茶素处理体外培养huvecs细胞24 h后,采用MTT法检测细胞活性,采用油红O染色法观察细胞内脂质蓄积,酶法测定细胞内胆固醇水平,qRT-PCR检测基因... 详细信息

目的探讨儿茶素对huvecs细胞内胆固醇蓄积以及对SREBP-2基因表达的影响。方法60μmol·L^(-1)儿茶素处理体外培养huvecs细胞24 h后,采用MTT法检测细胞活性,采用油红O染色法观察细胞内脂质蓄积,酶法测定细胞内胆固醇水平,qRT-PCR检测基因SREBP-2表达。结果与对照组比较,Chol∶MβCD处理组细胞增殖率降低,细胞内脂滴明显增加,游离胆固醇、总胆固醇含量增加。经儿茶素共孵育后,与Chol∶MβCD组比较细胞增殖率增加,细胞内脂滴显著减少,游离胆固醇、总胆固醇含量降低,SREBP-2 mRNA表达显著降低。结论儿茶素可减少huvecs细胞内胆固醇蓄积,其作用机制可能与调节SREBP-2的表达有关。

关键词：儿茶素胆固醇蓄积 SREBP-2 huvecs细胞

恙虫病东方体TSA、HtrA蛋白抗原性探究及其感染小鼠细胞因子风暴的初步研究

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恙虫病东方体TSA、HtrA蛋白抗原性探究及其感染小鼠细胞因子风暴...

作者：温萌安徽医科大学

学位级别：硕士

恙虫病是由节肢动物传播的革兰阴性专性细胞内细菌恙虫病东方体引起的严重威胁公共卫生安全的人畜共患病。其在亚太地区广泛流行,从阿富汗延伸到中国、朝鲜、西南太平洋岛屿和澳大利亚北部,每年导致100万人患病,威胁着全球近10亿人的健... 详细信息

恙虫病是由节肢动物传播的革兰阴性专性细胞内细菌恙虫病东方体引起的严重威胁公共卫生安全的人畜共患病。其在亚太地区广泛流行,从阿富汗延伸到中国、朝鲜、西南太平洋岛屿和澳大利亚北部,每年导致100万人患病,威胁着全球近10亿人的健康。非洲和南美国家的血清学证据表明,该疾病的地理范围和风险群体的人口可能更大。我国属于恙虫病重点疫区之一,发病率较高,死亡率在1.4%-6%之间严重威胁我国人民的健康。既往研究提示,恙虫病在我国北纬31°以南的广大地区流行,具有显著的季节特征,以夏季型为主。自1986年首次报道恙虫病在山东流行以来,新疫区不断形成和扩散,该类地区流行季节也与南方地区不同,为秋冬季,导致疾病特点发生了较大变化,恙虫病东方体的遗传背景、致病特点、毒力强度也可能发生了变异,并且逐渐向致病力较强的菌株发展。立克次体类疾病主要引起发热、皮疹、淋巴结肿大等症状,其临床特征不能有效区别于其他发热性疾病,常误诊导致病情加重,从而引发多器官损害等致命性疾病。鉴于恙虫病东方体在常规实验室条件下难以稳定培养和传代,对实验室培养条件和实验人员的要求较高,该菌株的培养不仅需要大量的正常细胞来获取分离菌株,而后续的相关研究更需要大量的纯化菌株,以上等综合原因使得国内研究者较少,而国际上对于恙虫病的致病机理研究极其稀少,目前我国对其致病机制的研究也尚属空白,因此建立经济且快速的诊断方法至关重要。本研究试图建立一种灵敏度与特异性相对较高且易于操作的恙虫病快速诊断方法,同时为了从根本上消灭恙虫病东方体感染,寻找合适的靶点来进行疫苗的开发,本研究通过建立小鼠动物模型来模拟疾病的感染过程,以期为恙虫病的防治提供一定的借鉴意义。本课题着重开展了四个部分的研究:第一部分研究根据恙虫病东方体外膜蛋白TSA以及HtrA基因序列设计特异性引物,构建TSA、HtrA基因的克隆与原核表达载体,进行两种蛋白的诱导表达及条件优化。结果显示构建了TSA及HtrA蛋白体外稳定表达的大肠杆菌菌株,同时纯化得到较高的蛋白浓度,为后续的进一步实验奠定了基础。第二部分研究初步建立恙虫病东方体病原检测方法,胶体金快速检测方法:将保存的能够用稳定表达TSA、HtrA蛋白的大肠杆菌菌株复苏,进行蛋白诱导表达纯化,体外获得纯度较高的蛋白后,利用胶体金进行标记,并对所建立的方法进行初步评价,结果显示利用临床确诊标本及健康人的标本进行验证,发现该方法具有较高的准确性,且大大缩短了检测时间与检测成本。免疫荧光抗原片检测方法:将保存的恙虫病东方体菌种复苏,感染L929细胞,制备细胞悬液后抗体孵育制作检测抗原片,初步结果显示该方法成本较低且具有良好的准确性。第三部分初步研究TSA、HtrA的抗原性,分别用两种蛋白刺激huvecs细胞,观察TSA、HtrA对huvecs细胞表型的影响,同时利用荧光定量PCR检测相关细胞因子的变化。结果显示,与对照组相比实验组的相关细胞因子水平显著升高。第四部分恙虫病东方体感染小鼠模型的构建及其引起的细胞因子风暴:首先将保存的恙虫病东方体菌株复苏,感染L929细胞多次优化培养条件使其能够大量克隆。收集细胞培养物反复多次进行细胞破碎后进行差速离心超纯后得到高浓度的立克次体悬液,最终进行定量浓度为1×10copies/μl,通过腹腔接种途径感染I型干扰素敲除小鼠及天然免疫缺陷TLR4小鼠,记录小鼠体征、体温、体重等基本信息,同时采集血液和脏器标本。通过病理切片HE染色、荧光定量PCR、免疫组织化学染色等方法进行相关指标检测,结果显示与对照组相比,I型干扰素敲除实验组的小鼠的活动度等指标在感染后的第八天出现显著变化,且在感染后的第十天发生死亡,TLR4受体天然缺陷组的小鼠活动度及状态未见明显差异,同时结合HE染色、免疫组化结果,实验组小鼠出现明显的炎症细胞浸润,细胞炎性因子水平较高。本研究成功于体外表达了恙虫病东方体两种特异性蛋白,初步建立了基于恙虫病东方体TSA蛋白的胶体金快速检测方法和免疫荧光抗原片法的临床诊断,为临床实验室确诊恙虫病及立克次体类疾病提供了快速有效的技术手段。TSA、HtrA蛋白对huvecs细胞产生致病性,为进一步探究立克次体类胞内菌的致病机制奠定了基础,而小鼠模型的建立,肺部及脾脏的损伤由于恙虫病东方体感染后的患者表现类似,可作为恙虫病东方体致病性研究的体内模型,结合不同小鼠模型的情况对立克次体感染动物的致病性进行初步探究。

关键词：恙虫病东方体立克次体胶体金检测 TSA蛋白 HtrA蛋白细胞实验动物模型 huvecs细胞

黄芪多糖对过氧化氢诱导的内皮细胞损伤的保护作用

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中药药理与临床 2015年第5期31卷 75-78页

作者：韩镕徽鲁美丽胡进王洪新辽宁医学院心脑血管药物研究重点实验室锦州121001

目的:观察黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)对过氧化氢(H2O2)诱导的人脐静脉内皮细胞huvecs损伤的保护作用及其可能的作用机制。方法:不同浓度的黄芪多糖孵育内皮细胞1h后加入400μmol/L的H2O2继续培养24h,用MTT法检测细胞活性;... 详细信息

目的:观察黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)对过氧化氢(H2O2)诱导的人脐静脉内皮细胞huvecs损伤的保护作用及其可能的作用机制。方法:不同浓度的黄芪多糖孵育内皮细胞1h后加入400μmol/L的H2O2继续培养24h,用MTT法检测细胞活性;DAPI/PI双染法观察细胞形态并统计细胞凋亡率;硝酸还原酶法测定NO释放量;Western blot法测定Cu/Zn-SOD蛋白表达。结果:H2O2模型组细胞活性较之空白对照组下降42.87%,细胞核皱缩形态不规则化,细胞凋亡率升高了7倍、NO释放量降低42.96%,Cu/Zn-SOD蛋白表达下降45.31%;与模型组相比黄芪多糖各剂量组可不同程度改善这些变化,其中黄芪多糖1μg/ml组作用最为明显,其细胞活性和NO释放量分别增加24.96%、32.13%,细胞凋亡率降低36.02%,Cu/Zn-SOD蛋白表达升高37.14%。结论:黄芪多糖可能通过影响内皮细胞NO释放量和Cu/Zn-SOD蛋白表达,改善细胞NO与氧自由基的平衡发挥保护作用。

关键词：黄芪多糖 huvecs细胞氧化应激 NO Cu/Zn-SOD

丹参酮ⅡA(TanⅡA)对内皮细胞的氧化损伤及凋亡的影响

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中药药理与临床 2017年第1期33卷 41-45页

作者：朱海燕王宇光马增春汤响林谭洪玲肖成荣陈志武高月安徽医科大学基础医学院药理学教研室合肥230032 军事医学科学院放射与辐射医学研究所北京100850

目的:观察丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对人脐静脉内皮细胞氧化损伤所致凋亡的保护作用机制研究。方法:不同浓度的丹参酮ⅡA预处理细胞24 h再给与4×10-4mol/L H_2O_2处理3 h。CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测凋亡,ROS和线粒体膜电位值;高内... 详细信息

目的:观察丹参酮ⅡA(Tan ⅡA)对人脐静脉内皮细胞氧化损伤所致凋亡的保护作用机制研究。方法:不同浓度的丹参酮ⅡA预处理细胞24 h再给与4×10-4mol/L H_2O_2处理3 h。CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测凋亡,ROS和线粒体膜电位值;高内涵筛选技术检测AIF;Cell Death Detection ELISA试剂盒检测DNA fragment。结果:丹参酮ⅡA(5、10、20×10-6mol/L)可以浓度依赖性的抑制H_2O_2诱导的内皮细胞损伤,TanI IA抑制H_2O_2引起的细胞凋亡降低被升高的ROS值,升高H_2O_2抑制的线粒体膜电位。同时可以抑制H_2O_2诱导的AIF的核转移并且H_2O_2引起的DNA fragment具有减轻作用。结论:丹参酮ⅡA可以减轻H_2O_2诱导的内皮细胞氧化损伤及凋亡,并且主要是通过抑制AIF核内转移实现的。

关键词：丹参酮ⅡA huvecs细胞氧化损伤凋亡 AIF

三七总皂苷对过氧化氢损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用研究

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中药药理与临床 2015年第1期31卷 69-71页

作者：侯立静孙付军张荔李贵海山东省中医药研究院济南250014

目的：观察三七总皂苷（PNS）对过氧化氢损伤人脐静脉内皮细胞（huvecs）LDH释放量、胞内SOD活性的影响,研究其对受损细胞粘附分子ICAM-1及MCP-1 mRNA表达的影响,探讨三七总皂苷对huvecs的保护作用及其在动脉粥样硬化中作用的可能机制... 详细信息

目的：观察三七总皂苷（PNS）对过氧化氢损伤人脐静脉内皮细胞（huvecs）LDH释放量、胞内SOD活性的影响,研究其对受损细胞粘附分子ICAM-1及MCP-1 mRNA表达的影响,探讨三七总皂苷对huvecs的保护作用及其在动脉粥样硬化中作用的可能机制。方法：三七总皂苷预孵育细胞4h后,加入300μmol/L H2O2,继续培养24h,MTT法检测细胞活力,采用试剂盒测定LDH释放量、SOD酶活力,荧光实时定量PCR（RT-PCR）法检测三七总皂苷作用下内皮细胞ICAM-1及MCP-1 mRNA的表达。结果：三七总皂苷在25~100μg/ml浓度范围内可显著提高受损细胞活力,并能显著降低LDH漏出率,提高胞内SOD酶活力;RT-PCR结果表明H2O2组内皮细胞表达的ICAM-1和MCP-1 mRNA明显高于正常细胞组,而同时加入50及100μg/ml的三七总皂苷后两者mRNA表达明显下降。结论：三七总皂苷可保护血管内皮细胞免受H2O2的损害,改善受损细胞氧化指标,降低参与动脉粥样硬化相关细胞因子表达,从而预防和治疗动脉粥样硬化。

关键词：三七总皂苷 huvecs细胞动脉粥样硬化 ICAM-1 MCP-1

1-磷酸鞘氨醇后适应对人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

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中国药理学通报 2016年第2期32卷 184-189页

作者：李蒙蒙王雨晴张丽志娄建石温克天津医科大学基础医学院药理学教研室天津300070 天津市第一中心医院妇产科天津300192

目的研究1-磷酸鞘氨醇(S1P)后适应对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧/复氧损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法建立HUVEC缺氧/复氧损伤模型,将HUVEC细胞分为5组,正常对照组、S1P低剂量组、S1P中剂量组、S1P高剂量组以及缺氧/复氧损伤(H... 详细信息

目的研究1-磷酸鞘氨醇(S1P)后适应对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧/复氧损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法建立HUVEC缺氧/复氧损伤模型,将HUVEC细胞分为5组,正常对照组、S1P低剂量组、S1P中剂量组、S1P高剂量组以及缺氧/复氧损伤(H/R)组。MTT法检测细胞存活率;流式细胞术分析测定细胞凋亡率;比色法测定细胞培养液中总超氧化物歧化酶(total superoxide disnmtase,TSOD)、铜锌超氧化物歧化酶(copper/zinc superoxide dismutase,CuZn-SOD)和锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn-SOD)活力以及一氧化氮(nitric oxide,NO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;荧光显微镜下观察线粒体膜电位;Western blot测定huvecs细胞Bcl-2/Bax、eNOS蛋白的表达水平。结果与H/R组相比,S1P低、中、高剂量组可明显增加huvecs细胞缺氧/复氧损伤后细胞存活率;均明显升高T-SOD活力、CuZn-SOD活力、Mn-SOD活力,降低MDA含量,明显升高NO含量及增加eNOS蛋白表达,降低凋亡率,抑制线粒体膜电位下降。结论 S1P能够使H/R损伤的huvecs细胞凋亡率降低,且呈一定的浓度依赖性。S1P对H/R损伤的huvecs细胞凋亡的保护作用可能与降低细胞内MDA含量,提高细胞内SOD活力,提升线粒体膜电位,增强抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax的表达有关。

关键词： S1P 缺氧/复氧 huvecs细胞 Bcl-2/Bax eNOS 凋亡

脱胶葵花盘醇提物的提取工艺及其抗氧化活性研究

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脱胶葵花盘醇提物的提取工艺及其抗氧化活性研究

作者：李欢内蒙古农业大学

学位级别：硕士

我区每年产大量的葵花盘,葵花盘为原料可生产果胶,但生产果胶后产生的副产物脱胶葵花盘渣均被焚烧处理,含有的果胶以外的营养成分未能充分利用。为此,本文以脱胶葵花盘渣为原料,采用超声波辅助提取法提取醇溶物,研究其抗氧化活性及其对... 详细信息

我区每年产大量的葵花盘,葵花盘为原料可生产果胶,但生产果胶后产生的副产物脱胶葵花盘渣均被焚烧处理,含有的果胶以外的营养成分未能充分利用。为此,本文以脱胶葵花盘渣为原料,采用超声波辅助提取法提取醇溶物,研究其抗氧化活性及其对过氧化氢(H2O2)诱导的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,huvecs)氧化损伤的保护作用。主要研究结果如下:(1)以脱胶葵花盘渣为原料,提取醇溶物,以提取率和DPPH自由基清除率为指标,通过正交试验确定了最佳提取工艺。结果表明,最佳提取工艺条件为:料液比1:17 g/mL、乙醇浓度70%、超声波处理时间30 min、浸提温度60℃、浸提时间1h,在此工艺条件下,提取率为20.32%,DPPH自由基清除率为72.13%。(2)分析最佳工艺条件下获得的醇提物的成分,发现成分有蛋白质、多糖、多酚(以没食子酸含量计)及黄酮(以芦丁含量计),含量分别为18.88%、3.11%、5.36%及 10.04%。(3)以总还原力、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率及ABTS自由基清除率为指标,研究了脱胶葵花盘醇提物的抗氧化活性,结果发现,总还原力随着浓度的升高而增强,当浓度达到1.6 mg/mL时,其总还原力与VC接近;醇提物的DPPH自由基清除率随着浓度升高而增大,当浓度达到1.6 mg/mL时,其DPPH自由基清除率与VC接近;醇提物的羟自由基清除率随着浓度的增加变化不明显,且羟自由基清除率低于VC;醇提物的ABTS自由基清除率随着浓度升高而增大,但ABTS自由基清除率低于VC。以上结果表明,脱胶葵花盘醇提物的羟自由基清除率及ABTS自由基清除率低于VC,但总还原力及DPPH自由基清除率与Vc相当,说明其具有一定的抗氧化活性。(4)进一步研究了脱胶葵花盘醇提物对H2O2诱导的huvecs细胞损伤的保护作用,结果发现,当醇提物浓度为3.125、6.25、12.5 μg/mL时,对正常的huvecs细胞有促增殖作用;当加入浓度为3.125、6.25、12.5 μg/mL的醇提物时,H2O2诱导的huvecs细胞活力值随着浓度的增加而提高;与正常组比较,H2O2诱导的huvecs细胞氧化损伤模型组的SOD及GSH-Px活性显著降低,LDH活性和MDA含量显著增加。当加入浓度为3.125、6.25、12.5 μg/mL醇提物时,随着浓度的增加SOD及GSH-Px活性显著增高,而LDH活性和MDA含量显著降低。表明脱胶葵花盘醇提物通过提高SOD及GSH-Px活性,降低LDH活性和MDA含量来对H2O2诱导的huvecs细胞氧化损伤起保护作用。

关键词：脱胶葵花盘醇提物提取工艺 huvecs细胞抗氧化活性

维生素D补充维生素D缺乏的2型糖尿病患者的影响

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维生素D补充维生素D缺乏的2型糖尿病患者的影响

作者：潘国涛苏州大学

学位级别：硕士

目的:探索补充维生素D对维生素D缺乏的2型糖尿病患者糖代谢和相关指标的影响。在此基础上,研究1,25(OH)D对高糖诱导huvecs损伤的保护作用。方法:1)维生素D水平与2型糖尿病患者代谢指标的关系:采用横断面调查的方法,收集270名受试对象的... 详细信息

目的:探索补充维生素D对维生素D缺乏的2型糖尿病患者糖代谢和相关指标的影响。在此基础上,研究1,25(OH)D对高糖诱导huvecs损伤的保护作用。方法:1)维生素D水平与2型糖尿病患者代谢指标的关系:采用横断面调查的方法,收集270名受试对象的人口统计学指标、身体测量指标和血清学指标,使用多因素logistic回归分析和Restricted cubic spline剂量反应关系分析维生素D对2型糖尿病患者代谢相关指标的影响。2)补充维生素D对维生素D缺乏的2型糖尿病患者的影响:采用社区干预方法,选取血清25(OH)D水平低于20 ng/mL的2型糖尿病患者共100名,通过补充维生素D 800 IU/d,观察血清25(OH)D的变化情况以及其他血清学指标和代谢指标的改变分析其影响。3)1,25(OH)D对高糖环境诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用:采用高浓度葡萄糖作为huvecs的培养环境,使用1,25(OH)D干预高糖培养的细胞,通过检测细胞活力、氧化应激指标和结构功能改变评价其保护作用。结果:1)研究共纳入270例2型糖尿病患者,发现2型糖尿病患者血清维生素D水平普遍较低,维生素D缺乏率和不足率分别为43.71%和39.63%。logistic回归分析显示,血清25(OH)D水平与2型糖尿病患者代谢综合征患病率呈负相关。限制立方样条图显示,当血清25(OH)D水平在14 ng/mL时,代谢综合征患病风险为参照(30 ng/mL)的2.12倍,只有当血清25(OH)D水平达到充足时(>30ng/mL),才能有效降低代谢综合征患病风险。2)社区干预研究共纳入血清25(OH)D≤20 ng/mL的2型糖尿病患者100名,补充800 IU/d的维生素D可以逐渐提升血清25(OH)D水平(14.15±4.13、17.01±6.50、29.22±8.48和38.80±9.47 ng/m L),改善缺乏的状态。并且可以改善2型糖尿病患者糖代谢异常情况,升高血清N-端骨钙素水平,且女性患者受益更明显;同时结果还发现体内的25(OH)D水平升高时,TNF-a在正常范围内升高,血小板参数(血小板分布宽度,血小板计数)显著降低,血小板压积也显著降低。3)细胞实验结果显示,高糖环境会抑制细胞增殖,刺激细胞产生ROS,伴随MDA生成增多,SOD水平降低;而1,25(OH)D可以显著减少高糖诱导的MDA生成,升高SOD和GSH水平。免疫荧光和蛋白检测均显示,高糖环境会增加内皮细胞通透性,影响细胞间紧密连接的结构;而1,25(OH)D可以显著升高VDR和MLC表达,调节细胞内Ca的含量,重塑细胞结构与细胞间的紧密连接,并促进NO的合成与释放。结论:1)在2型糖尿病人群中,血清25(OH)D水平与代谢综合征患病率呈显著负相关,当血清25(OH)D水平低于14 ng/m L时,代谢综合征患病风险显著增加;2)补充800 IU/d的维生素D一年后,显著改善血清25(OH)D≤20ng/mL的2型糖尿病患者维生素D缺乏状态,并且可以改善2型糖尿病患者糖代谢异常情况,增加骨钙素水平,女性患者受益更大;3)1,25(OH)D可以通过抑制氧化应激反应,保护内皮细胞结构和功能,减弱高糖和波动性高糖环境所造成的内皮细胞损伤和凋亡。

关键词：维生素D 缺乏 2型糖尿病 huvecs细胞 1 25(OH)2D3