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hspc238对HMOX1、RPS27a、MT2A、UBB调节的初步研究

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中国免疫学杂志 2016年第4期32卷 509-512页

作者：谭家余黄湘陈敬林钟裕恒南方医科大学第三临床医学院南方医科大学附属中山博爱医院中山528403

目的:探讨hspc238过表达或低表达对目标蛋白(HMOX1、MT2A、UBB、RPS27a)的调节作用及其调节途径。方法:分别构建hspc238的干扰载体及高表达载体,脂质体法转染HEPG2细胞株,RT-PCR、Western blot检测hspc238及目标蛋白的mRNA、蛋白的表达... 详细信息

目的:探讨hspc238过表达或低表达对目标蛋白(HMOX1、MT2A、UBB、RPS27a)的调节作用及其调节途径。方法:分别构建hspc238的干扰载体及高表达载体,脂质体法转染HEPG2细胞株,RT-PCR、Western blot检测hspc238及目标蛋白的mRNA、蛋白的表达量;进一步用目标蛋白的高表达质粒分别转染低表达及高表达hspc238的HEPG2细胞株,实验组另以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,镍柱纯化目标蛋白,以hspc238做免疫印迹,检测目标蛋白累积情况。结果:外源性干扰hspc238后HMOX1、MT2A、RPS27a表达下调较明显,外源性过表达hspc238后MT2A、UBB、RPS27a表达水平明显上调;目标蛋白的高表达质粒分别转染低表达及高表达hspc238的HEPG2细胞株,实验组以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,与对照组比较,泛素化的目标蛋白条带明显增加。结论:过表达hspc238可上调MT2A、UBB、RPS27a的表达,干扰hspc238可下调HMOX1、MT2A、RPS27a的表达;hspc238可能通过泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)对目标蛋白发挥调节作用。

关键词： hspc238 泛素蛋白酶体途径目标蛋白

hspc238相互作用蛋白RPL5的初步筛选

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中国免疫学杂志 2015年第11期31卷 1494-1497页

作者：陈敬林黄湘谭家余钟裕恒万志丹南方医科大学第三临床医学院南方医科大学附属中山博爱医院中山528403 南方医科大学附属中山市博爱医院产前诊断中心中山528403 南方医科大学附属中山市博爱医院中心ICU 中山528403

目的:构建hspc238诱饵载体,筛选与hspc238相互作用的目标蛋白。方法:基因合成法合成hspc238基因,sfi IA和sfi IB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接,获得诱饵质粒pGBKT7-hspc238,经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH1... 详细信息

目的:构建hspc238诱饵载体,筛选与hspc238相互作用的目标蛋白。方法:基因合成法合成hspc238基因,sfi IA和sfi IB双酶切后与pGBKT7诱饵载体连接,获得诱饵质粒pGBKT7-hspc238,经测序鉴定后与酵母双杂交空质粒pGBKT7共同转化到酵母菌株AH109,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-hspc238的自激活作用,进一步从人胎肝c DNA文库中筛选与hspc238相互作用的目标蛋白。结果:诱饵载体pGBKT7-hspc238构建成功,经表型筛选检测无自激活作用,经酵母双杂交技术结合文献分析,从人胎肝c DNA文库中初步筛选发现核糖体蛋白L5(Ribosomal protein L5,RPL5)可能是hspc238相互作用的目标蛋白之一。结论:成功构建pGBKT7-hspc238诱饵质粒载体,且经酵母双杂交技术结合文献分析发现RPL5可能是与hspc238相互作用的目标蛋白之一。

关键词： hspc238 酵母双杂交核糖体蛋白L5 相互作用蛋白

过表达hspc238对Bel7402细胞周期的影响

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中国免疫学杂志 2011年第2期27卷 120-125页

作者：黄湘谭家余王穗海李明南方医科大学附属中山市博爱医院检验科中山528403 南方医科大学生物技术学院广州510515

目的:构建pcDNA3.1(-)/hspc238真核表达载体,研究过表达hspc238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/hspc238重组质粒中克隆得到hspc238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建p... 详细信息

目的:构建pcDNA3.1(-)/hspc238真核表达载体,研究过表达hspc238基因对人肝癌细胞株Bel7402细胞周期的影响。方法:采用PCR法从pET28b/hspc238重组质粒中克隆得到hspc238 cDNA全长序列,并将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)/hspc238真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将该重组质粒转染Bel7402细胞,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株。用RT-PCR和Western blot技术分别检测hspc238基因在Bel7402中的mRNA和蛋白水平的表达。随后用饥饿法使各组细胞周期同步化,再用流式细胞仪分析hspc238过表达对细胞周期的影响。结果:pcDNA3.1(-)/hspc238经酶切鉴定及DNA测序证实,目的基因hspc238的序列完全正确;RT-PCR和Western blot检测显示,与转染pcDNA3.1(-)组和未转染组相比较,转染pcDNA3.1(-)/hspc238组的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,但前两者间没有差异。用饥饿法同步化后,流式细胞仪检测显示过表达hspc238可延缓Bel7402细胞株从G1期进入S期。结论:成功构建了pcDNA3.1(-)/hspc238真核表达载体,并在Bel7402中表达。初步发现过表达hspc238可延缓肝癌细胞的细胞周期,为更进一步研究hspc238蛋白的功能奠定了基础。

关键词： hspc238 过表达 Bel7402 细胞周期

hspc238对宫颈癌细胞生物学行为的影响及其分子机制研究

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HSPC238对宫颈癌细胞生物学行为的影响及其分子机制研究

作者：钟裕恒南方医科大学

学位级别：硕士

目的:hspc238,又名RN181,RNF181,是一种新型C3HC4型锌指蛋白。锌指蛋白是一类重要的转录调控因子,是人类许多肿瘤发生的关键所在。研究发现锌指蛋白hspc238的异常与肝癌、胃癌和大肠癌这些消化系统癌症的发生有关,本课题拟探讨hspc238... 详细信息

目的:hspc238,又名RN181,RNF181,是一种新型C3HC4型锌指蛋白。锌指蛋白是一类重要的转录调控因子,是人类许多肿瘤发生的关键所在。研究发现锌指蛋白hspc238的异常与肝癌、胃癌和大肠癌这些消化系统癌症的发生有关,本课题拟探讨hspc238与宫颈肿瘤的关系,通过免疫组化实验、EdU增殖实验、Transwell侵袭实验、裸鼠成瘤实验和western blotting实验等研究hspc238对宫颈癌细胞生长、增殖及侵袭等生物学行为的影响,并初步探讨其发挥作用的分子机制,从而为揭示hspc238的功能提供更多的信息和线索。方法:1.宫颈组织免疫组织化学检测(ABC法)收集76例宫颈癌、105例宫颈上皮内瘤变组织(简称CIN)及28例正常宫颈标本及临床相关数据,然后用ABC法对标本行hspc238免疫组织化学染色,统计比较其表达水平的差异,以及比较宫颈癌组织中hspc238的表达水平在不同病理分级中的差异,肌层浸润与否的差异,淋巴转移与否的差异。2.质粒转染和鉴定采用脂质体法分别将前期已构建好的pcDNA3.1-hspc238质粒(以下简称hspc238高表达)、pLL3.7-hspc238载体(以下简称hspc238干扰)以及相应对照质粒转染至Hela细胞,鉴定转染效果,以备后续实验时使用。***细胞增殖实验将hspc238高表达组,干扰组及相应对照组的Hela细胞培养至适合的生长密度,然后用EdU法检测各组细胞的增殖能力,最后用荧光显微镜观察细胞的生长情况。实验重复三次,统计比较各组细胞的增殖水平。***细胞侵袭实验将hspc238高表达组,干扰组及相应对照组的Hela细胞培养至对数期,然后用Transwell法检测细胞的侵袭能力,结晶紫染色后,统计比较各组OD值。5.干扰hspc238对裸鼠移植瘤生长的影响采用同体对照的方法,将hspc238高表达组Hela细胞接种在裸鼠左侧前肢腋部皮下,对照组细胞接种在裸鼠右侧前肢腋部皮下。隔两日观察裸鼠的生长情况,测量移植瘤的体积。统计比较两组移植瘤的生长和体积是否有差异。***238对Hela细胞周期蛋白的影响用逆转录PCR法(RT-PCR)和免疫印迹实验检测hspc238高表达组、干扰组和相应对照组中hspc238、Cyclin E1、p16、RB、E2F-1的mRNA和蛋白的表达水平,然后比较各组数据差异。结果:1.免疫组织化学染色hspc238的表达水平在正常宫颈组织和宫颈癌组织中无显著差异;在CIN与正常宫颈组织间有显著差异,并且发现hspc238的表达水平与CIN的分级存在显著相关性,随着CIN级别升高,其表达水平降低;另外,宫颈癌组织中hspc238的表达水平在不同病理分级中没有差异,在肌层浸润组和非肌层浸润组间没有差异,在淋巴转移组与非淋巴转移组也没有差异。2.质粒转染和鉴定成功构建并鉴定了 hspc238高表达和hspc238干扰的Hela宫颈癌细胞株。***增殖实验和Transwell侵袭实验与对照组相比,高表达hspc238可以使Hela细胞增殖和侵袭能力降低,反之,干扰hspc238使Hela细胞增殖能力和侵袭能力增强。4.裸鼠成瘤实验与对照组相比,干扰hspc238后裸鼠移植瘤的生长速度加快,瘤体体积明显增大。***238对Hela细胞周期蛋白的影响高表达hspc238后,Hela细胞中Cyclin E1、pRb、E2F-1蛋白表达水平增加,p16的表达水平无明显增加;干扰hspc238后,Hela细胞中CyclinE1、pRb、p16蛋白表达水平也减少,E2F-1的表达水平无明显增加。而高表达或干扰 hspc238 后,Hela 细胞中 CyclinE1、pRb、E2F-1 和 p16 的 mRNA 求平均无明显变化。结论:hspc238的表达水平与宫颈上皮内瘤变的分级相关。hspc238高表达时能抑制Hela细胞的增殖和侵袭,hspc238低表达时促进Hela细胞的增殖和侵袭。低表达hspc238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤具有促进作用。hspc238能够影响细胞周期蛋白CyclinE1、pRb、E2F-1和p16的表达。hspc238可能通过调控Hela宫颈癌细胞的细胞周期进而影响宫颈癌的进展。

关键词： hspc238 宫颈癌增殖侵袭移植瘤机制

hspc238相互作用蛋白的初步筛选及验证

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HSPC238相互作用蛋白的初步筛选及验证

作者：陈敬林南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的原发性肝细胞癌(Hepatocellular caicinoma,HCC;简称肝癌)是临床上常见的恶性肿瘤,近年来随着乙型和丙型肝炎病毒的感染率在世界范围内的增加,肝癌的发病率也逐渐上升,有报告显示,每年有新发肝癌超过70万例。目前肝癌已... 详细信息

研究背景和目的原发性肝细胞癌(Hepatocellular caicinoma,HCC;简称肝癌)是临床上常见的恶性肿瘤,近年来随着乙型和丙型肝炎病毒的感染率在世界范围内的增加,肝癌的发病率也逐渐上升,有报告显示,每年有新发肝癌超过70万例。目前肝癌已成为世界上第五大最常见的恶性肿瘤,肝癌致死率在癌症死亡率中排名第三。只有约15%的肝癌有机会通过手术治愈(例如,肝切除或移植)或微创局部治疗(例如,射频消融)。随着医学影像等技术手段的提高,肝癌的早期诊断和治疗虽取得了巨大进步,但长期预后仍不理想,有学者研究报道,肝癌患者平均的5年生存率仅为8.9%。大多数肝癌是由慢性肝病(如乙肝、丙肝、酒精肝等)发展而来的,但仍有15-50%的新发病例病因不清。肝癌的早期转移是影响其临床预后的一个重要因素,在这一复杂过程中,涉及到多基因、多蛋白的参与。当前对肿瘤发生发展机制的研究大多关注癌基因、抑癌基因、小分子RNA等单个或多个分子的作用和功能,而蛋白质作为基因编码产物,是生命活动的最终执行者,其在肿瘤中的表达、对肿瘤发生发展所起的作用,仍有待阐明。随着分子生物学及蛋白质组学技术的发展,在细胞内执行生物学功能的蛋白质又重新得到重视,蛋白质分子间的相互作用作为蛋白质组学研究的主要内容之一已成为近年来的研究热点。蛋白质之间的相互作用不但能够提供蛋白质本身功能的信息,而且能够提供蛋白质在代谢调控、信号传导和复合体中起作用的信息,这为揭示肿瘤发生发展机制带来了新的希望。锌指蛋白具有指状结构,常出现在DNA结合蛋白中,属于真核转录因子的一大家族,锌指蛋白结构域有胱氨酸和组氨酸残基以及锌离子构成。根据锌离子与这两种氨基酸的组合方式,锌指蛋白可以分为C2H2、C3、C4等多种类型。许多锌指蛋白除了能够识别特定的DNA序列,还参与蛋白质与RNA和蛋白质-蛋白质相互作用。本研究中的hspc238蛋白,其基因组全长716个碱基,编码153个氨基酸,其第40至60氨基酸残基能够形成特殊的RING指结构域,故也是一种C3HC4型锌指蛋白。本课题组在前期研究中发现hspc238蛋白是一种新的抑癌蛋白。我们通过对139例具有完整临床随访资料的肝癌组织标本进行了免疫组织化学检测,结果显示：hspc238蛋白在正常肝组织中的表达水平显著高于肝癌组织,与肝癌患者的年龄、性别及临床分期无相关性,但与肝癌的分化程度呈负相关;在体外培养的SMMC7721细胞系中改变hspc238的表达,结果发现,上调hspc238的表达可抑制SMMC7721细胞株的增殖和克隆形成,下调hspc238的表达可促进SMMC7721细胞株的增殖和克隆形成;进一步通过体内裸鼠成瘤实验证实,上调hspc238可抑制裸鼠体内肿瘤细胞的增殖,干扰hspc238的表达则可促进裸鼠体内肿瘤的增殖;进一步深入研究发现,hspc238通过ERK/MAPK途径对肝癌细胞发挥抑制作用。这些前期研究结果为探索肝癌抑癌机制及寻找新的肝癌诊断潜在标志物提供了新的理论依据和研究靶点。除上述研究结果外,国内外尚无对hspc238蛋白与肝癌功能的相关报道,为进一步深入研究hspc238在肝癌中的抑癌作用机制,本实验拟通过酵母双杂交系统筛选与hspc238相互作用的目标蛋白,并进一步通过激光共聚焦、免疫共沉淀及pull-down等实验技术对筛选到的目标蛋白进行验证,从而为全面研究hspc238的功能及其在肝癌中的作用机制奠定基础。方法：1.重组诱饵质粒载体的构建、酵母转化及自激活检测1.1重组诱饵质粒载体的构建将装载了人工合成的目的基因hspc238的质粒载体(pUC19-hspc238质粒,前期研究中制备并保存)通过转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行扩增和质粒抽提,以获取足量的目的基因片段;所得质粒(pUC19-hspc238质粒)经电泳、测序等方法鉴定后与酵母双杂交诱饵载体质粒pGBKT7双酶切后连接,初步获得含诱饵蛋白(hspc238)的重组载体pGBKT7-hspc238,连接体系再次转化大肠杆菌Top10以扩增重组载体(pGBKT7-hspc238),随机挑取3个转化子接种于带卡那抗性的液体LB培养基过夜,抽提质粒并电泳初步鉴定质粒,酶切进一步鉴定是否插入了目标片段(hspc238)。1.2诱饵载体的酵母转化及自激活检测经过鉴定的pGBKT7-hspc238载体与pGADT7空载体采用醋酸锂法共转化酵母AH109细胞,同时根据试剂盒说明书中的要求设置阳性及阴性对照,分别涂布不同营养缺陷性平板,通过蓝白斑筛选及营养缺陷筛选,判断诱饵蛋白hspc238对酵母AH109是否存在毒性及自激活活性。2.人胎肝cDNA文库的筛选2.1文库质粒的扩增、抽提和转化筛选稀释文库菌液后涂布LB+Amp平板扩增培养,抽提文库质粒,检测所得文库质粒的

关键词： hspc238 酵母双杂交相互作用蛋白

hspc238对肝癌细胞中RB基因表达的影响

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国际检验医学杂志 2016年第18期37卷 2505-2506,2510页

作者：袁春雷谭家余钟裕恒黄湘陈敬林南方医科大学附属中山博爱医院检验科广东中山528400 南方医科大学附属中山博爱医院中心ICU 广东中山528400 南方医科大学附属中山博爱医院产前诊断中心广东中山528400

目的观察hspc238对肝癌细胞中RB mRNA和pRb蛋白水平的影响。方法将PcDNA3.1-hspc238质粒和PLL3.7-hspc238干扰载体分别转染HepG2细胞,用实时荧光定量PCR的方法检测RB mRNA的表达量;采用Western blotting法检测pRb蛋白的表达。结果和对... 详细信息

目的观察hspc238对肝癌细胞中RB mRNA和pRb蛋白水平的影响。方法将PcDNA3.1-hspc238质粒和PLL3.7-hspc238干扰载体分别转染HepG2细胞,用实时荧光定量PCR的方法检测RB mRNA的表达量;采用Western blotting法检测pRb蛋白的表达。结果和对照组相比,转染高表达hspc238载体时,HepG2细胞中RB的mRNA水平和pRb表达量也增加;相反地,和对照组相比,转染低表达hspc238载体时,HepG2细胞中RB的mRNA水平和pRb蛋白的表达量也减少。以上结果差异均有统计学意义(Phspc238对RB基因的表达存在正向调控作用。

关键词： hspc238 RB基因肝癌细胞 HepG2

hspc238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响

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实用癌症杂志 2017年第7期32卷 1045-1047页

作者：钟裕恒黄湘梁睿杨海鑫欧锦留南方医科大学附属中山博爱医院 532200

目的探讨高表达和干扰hspc238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将pc DNA3.1-hspc238高表达和p LL3.7-hspc238干扰载体分别瞬时转染Hela细胞,然后采用Ed U增殖和Transwell侵袭实验,检测hspc238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。结... 详细信息

目的探讨高表达和干扰hspc238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。方法将pc DNA3.1-hspc238高表达和p LL3.7-hspc238干扰载体分别瞬时转染Hela细胞,然后采用Ed U增殖和Transwell侵袭实验,检测hspc238对Hela细胞增殖和侵袭能力的影响。结果与对照组相比,转染了pc DNA3.1-hspc238质粒的Hela细胞增殖和侵袭能力下降,转染了p LL3.7-hspc238质粒的Hela细胞增殖和侵袭能力增强,以上结果均有统计学差异(Phspc238高表达时能抑制Hela细胞的增殖和侵袭,干扰hspc238时促进Hela细胞的增殖和侵袭。

关键词： hspc238 Hela细胞增殖侵袭

干扰hspc238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤的促进作用

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检验医学与临床 2017年第6期14卷 752-753页

作者：钟裕恒黄湘吴学威梁睿南方医科大学附属中山博爱医院产前诊断中心广东中山528403

目的观察干扰hspc238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤的影响。方法将PLL3.7-hspc238干扰载体稳定转染Hela细胞,然后将细胞接种到BALB/c裸鼠前肢腋部皮下,观察肿瘤出现时间及体积变化。结果转染了PLL3.7-hspc238干扰载体组的裸鼠肿瘤较对照组... 详细信息

目的观察干扰hspc238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤的影响。方法将PLL3.7-hspc238干扰载体稳定转染Hela细胞,然后将细胞接种到BALB/c裸鼠前肢腋部皮下,观察肿瘤出现时间及体积变化。结果转染了PLL3.7-hspc238干扰载体组的裸鼠肿瘤较对照组生长快,肿瘤的体积明显大于对照组,差异有统计学意义(Phspc238对宫颈癌Hela细胞裸鼠成瘤具有促进作用。

关键词： hspc238 Hela细胞宫颈癌裸鼠

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PSMA7对A549细胞中RB途径的影响

中国免疫学杂志 2017年第4期33卷 516-519页

作者：黄湘钟裕恒谭家余吴学威梁睿梁少霞赵婧南方医科大学附属中山博爱医院产前诊断中心中山528403 南方医科大学附属中山博爱医院中心ICU 中山528403

目的:探究高表达和干扰PSMA7对A549细胞周期以及RB途径中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影响。方法:将pcDNA3.1-PSMA7高表达和pGPU6/Hygro-PSMA7-265干扰载体分别瞬时转染A549细胞,然后用流式细胞仪检测PSMA7对细胞周期的影响,再通... 详细信息

目的:探究高表达和干扰PSMA7对A549细胞周期以及RB途径中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影响。方法:将pcDNA3.1-PSMA7高表达和pGPU6/Hygro-PSMA7-265干扰载体分别瞬时转染A549细胞,然后用流式细胞仪检测PSMA7对细胞周期的影响,再通过Western blot实验检测Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平。结果:和对照组相比,PSMA7高表达时周期时相分布无明显差异,但Cyclin D1、CDK4的蛋白表达水平明显降低,P16、Rb的表达明显增高;和对照组相比,干扰PSMA7后细胞的G0/G1、G2/M期比例均降低,而S期的值增高,均具有差异,而Cyclin D1、CDK4的蛋白表达水平明显增加,P16、Rb的表达明显降低,以上结果与对照组相比差异均有统计学意义。结论:PSMA7在A549肺腺癌细胞中能够影响RB途径中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平的表达,干扰PSMA7使A549细胞较早进入S期。

关键词： hspc238 RB途径细胞周期免疫印迹