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Celastrol promotes apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells by targeting hsdl2

Acupuncture and Herbal Medicine 2024年第1期4卷 92-101页

作者： Li Liu Yanqing Liu Shujie Zhang Junzhe Zhang Yuqing Meng Dandan Liu Liwei Gu Ying Zhang Liting Xu Ziyue Zhang Minghong Zhao Yinkwan Wong Qixin Wang Yongping Zhu Jigang Wang College of Pharmacy Gannan Medical UniversityGanzhouChina State Key Laboratory for Quality Ensurance and Sustainable Use of Dao-di Herbs Artemisinin Research Centerand Institute of Chinese Materia MedicaChina Academy of Chinese Medical SciencesBeijingChina Department of Pharmacological Sciences Yong Loo Lin School of MedicineNational University of SingaporeSingaporeSingapore

Objective:Celastrol is a pentacyclic triterpenoid extracted from the traditional Chinese medicinal herb,Tripterygium wilfordii.This study aims to provide a scientific basis for the rational development and use of celastrol in breast cancer.Method:A quantitative chemical biology approach was used to investigate the protein targets and molecular mechanisms of celastrol in breast cancer cells.Results:Low-concentration celastrol exerted an anti-tumor effect by directly binding to hydroxysteroid dehydrogenase-like 2(hsdl2)and inhibiting its expression.Moreover,the expression of the pro-apoptotic protein,Bcl-2-associated X(BaX),increased,the level of the anti-apoptotic protein,B-cell lymphoma-2(Bcl-2),decreased,and the rate of apoptosis increased.After the transfection of cells with si-hsdl2,the apoptosis rate was similar to that observed after the administration of celastrol.However,apoptosis was reversed by the overexpression of hsdl2.Furthermore,our mass spectrometry(MS)data indicated a relationship between hsdl2 and the mitogen-activated protein kinase(MAPK)signaling pathway.We also found that the expression of hsdl2 was directly related to the degree of extracellular signal-regulated kinase(ERK)phosphorylation.Conclusion:Celastrol may promote apoptosis by suppressing the hsdl2/MAPK/ERK signaling pathway.

关键词： Activity-based protein profiling Apoptosis Celastrol hsdl2

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雷公藤红素靶向hsdl2蛋白促进乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡（英文）

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Acupuncture and Herbal Medicine 2024年第1期 92-101页

作者：刘莉刘艳青张书杰张俊哲孟雨晴刘丹丹谷丽维张颖徐丽婷张紫月赵明洪 Yinkwan Wong 王启新朱永平王继刚赣南医科大学药学院中国中医科学院中药研究所道地药材品质保障与资源持续利用全国重点实验室青蒿素研究中心新加坡国立大学杨潞龄医学院药学院

乳腺癌仍然是目前威胁女性健康的最常见的癌症类型之一。其中，三阴性乳腺癌（TNBC）是指一种异质性乳腺肿瘤，即缺乏人类表皮生长因子受体2(HER2)、孕激素受体受体（PR）和雌激素受体（ER），目前仍无最佳治疗方法和治疗靶点。因此，为... 详细信息

乳腺癌仍然是目前威胁女性健康的最常见的癌症类型之一。其中，三阴性乳腺癌（TNBC）是指一种异质性乳腺肿瘤，即缺乏人类表皮生长因子受体2(HER2)、孕激素受体受体（PR）和雌激素受体（ER），目前仍无最佳治疗方法和治疗靶点。因此，为TNBC寻找新的治疗靶点和筛选基于新靶标的候选药物变得迫在眉睫。羟基类固醇脱氢酶2(hsdl2)属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）超家族，位于9q32染色体位点，在多种类型的肿瘤中异常表达，但其在乳腺癌治疗中的作用机制尚不清楚。雷公藤红素是从传统中草药雷公藤中提取的一种五环三萜化合物，在乳腺癌细胞中抗肿瘤活性的分子机制尚不完全清楚。为合理开发利用雷公藤红素抗乳腺癌提供充分科学依据，本研究采用基于活性的化学蛋白质组学方法研究雷公藤红素在乳腺癌细胞中的蛋白靶点和分子机制。研究结果表明，低浓度雷公藤红素具有抗肿瘤作用，可直接与hsdl2结合并抑制其表达。促凋亡蛋白Ba X的表达增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平降低，凋亡率升高。用si-hsdl2转染细胞后，细胞凋亡率与给药后相似。然而，过表达hsdl2后，细胞凋亡被逆转。总之，我们的研究结果表明雷公藤红素可能通过靶向hsdl2从而促进细胞凋亡。此外，质谱数据表明hsdl2与MAPK信号通路之间存在关系，hsdl2的表达与ERK的磷酸化程度直接相关。

关键词：雷公藤红素 hsdl2 凋亡基于活性的化学蛋白质组学

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hsdl2高表达促进直肠癌细胞增殖:基于激活CDK6/cyclinD1信号通路

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南方医科大学学报 2023年第4期43卷 544-551页

作者：程阳何旭旭王炼许轶博沈梦迪张文静夏勇生张婕张敏王宜君胡建国张军蚌埠医学院第一附属医院输血科安徽蚌埠233004 蚌埠医学院安徽蚌埠233000 蚌埠医学院第一附属医院胃肠外科安徽蚌埠233004 蚌埠医学院第一附属医院消化内科安徽蚌埠233004 蚌埠医学院第一附属医院检验科安徽蚌埠233004 蚌埠医学院组织移植重点实验室安徽蚌埠233030

目的明确羟基类固醇脱氢酶样蛋白2(hsdl2)在直肠癌组织中的表达及对癌细胞增殖能力的影响。方法基于前瞻性临床数据库和生物标本库系统分析2020年1月~2022年6月我院收治的90例直肠癌患者的临床资料。采用免疫组化法检测90例直肠癌组织... 详细信息

目的明确羟基类固醇脱氢酶样蛋白2(hsdl2)在直肠癌组织中的表达及对癌细胞增殖能力的影响。方法基于前瞻性临床数据库和生物标本库系统分析2020年1月~2022年6月我院收治的90例直肠癌患者的临床资料。采用免疫组化法检测90例直肠癌组织与癌旁组织中hsdl2的表达水平。根据hsdl2表达中位数分为高表达组(n=45)与低表达组(n=45),分析其与肿瘤临床病理参数间的关系。基于GEO数据库,对hsdl2进行GO功能注释和KEGG通路富集,分析hsdl2在直肠癌中潜在的生物学功能和作用机制;分别采用慢病毒NC、Si-hsdl2与LV-hsdl2转染SW480细胞,CCK8法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测hsdl2对细胞周期的影响,免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白的表达。结果直肠癌组织中hsdl2的表达水平显著高于癌旁组织(Phsdl2、Ki67蛋白与血CEA、血CA19-9水平均呈正相关(Phsdl2高表达组患者的T3-4期、N2-3期、血CEA≥5μg/L与血CA19-9≥37 kU/L比例明显高于低表达组(Phsdl2主要富集到DNA复制等生物学过程。KEGG富集显示hsdl2主要参与细胞周期等信号通路。上调hsdl2表达显著促进SW480细胞的体外增殖能力(Phsdl2则抑制细胞增殖、S期细胞比例与CDK6、CyclinD1的表达(Phsdl2在直肠癌组织中高表达,与直肠癌恶性进展相关,并促进直肠癌细胞增殖能力,影响细胞周期进程。

关键词：直肠癌 hsdl2 细胞增殖细胞周期生物标志物

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胃癌中hsdl2过表达与临床病理特征的相关性

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临床与实验病理学杂志 2020年第1期36卷 1-6页

作者：董兵朴俊杰杨洋朱光秦云植林贞花延边大学医学院病理学教研室延吉133002 延边大学肿瘤研究中心延吉133002 延边大学附属医院麻醉科延吉133002

目的探讨羟基类固醇脱氢酶样蛋白2(hydroxysteroid dehydrogenase like 2,hsdl2)在胃癌中的表达及与临床病理特征的关系。方法采用免疫组化SP两步法检测hsdl2蛋白在90例胃癌和20例正常胃组织中的表达,分析hsdl2蛋白过表达与胃癌临床病... 详细信息

目的探讨羟基类固醇脱氢酶样蛋白2(hydroxysteroid dehydrogenase like 2,hsdl2)在胃癌中的表达及与临床病理特征的关系。方法采用免疫组化SP两步法检测hsdl2蛋白在90例胃癌和20例正常胃组织中的表达,分析hsdl2蛋白过表达与胃癌临床病理特征的关系,并采用GEPIA数据库进行生存分析。结果hsdl2蛋白主要定位于胃癌细胞SGC-7901和AGS的细胞质中。UALCAN数据库分析结果显示:胃癌组织中hsdl2 mRNA的表达水平明显高于正常胃组织(Phsdl2蛋白在胃癌组织中过表达,强阳性率为58.9%(53/90),显著高于正常胃组织(5.0%,1/20)(Phsdl2蛋白表达与胃癌分化程度、临床分期及肿瘤直径密切相关(P均hsdl2蛋白过表达胃癌患者无瘤生存率低于hsdl2蛋白低表达患者(Phsdl2在胃癌组织中明显过表达,其表达水平与胃癌的发生、发展及不良预后密切相关,有望成为胃癌患者预后评估的重要指标。

关键词：胃肿瘤 hsdl2 免疫组织化学

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头颈鳞状细胞癌中hsdl2的表达水平及临床意义

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临床与实验病理学杂志 2020年第12期36卷 1412-1417页

作者：王艺璇王馨悦林贞花孙洁杨洋金爱花延边大学医学院病理学教研室延吉133002 吉林省科技厅重点实验室延吉133002 延边大学附属医院消化内科延吉133002

目的探讨人类羟基类固醇脱氢酶样蛋白2(hydroxysteroid dehydrogenase like 2,hsdl2)在人头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中的表达及临床意义。方法通过UALCAN数据库分析HNSCC中hsdl2 mRNA的表达及其与临床病理学特征的关系;应用The Human Protein Atlas(HPA)数据库和免疫组化SP两步法染色检测HNSCC中hsdl2蛋白的表达,并分析其与临床病理学特征的关系;应用HPA数据库分析hsdl2 mRNA表达与HNSCC患者生存期的关系;应用STRING数据库分析hsdl2可能参与的生物学进程及蛋白互作网络。结果与癌旁正常组织相比,HNSCC组织中hsdl2 mRNA的表达水平明显降低(Phsdl2蛋白主要定位于细胞质中,且在HNSCC组织中的表达明显低于癌旁正常组织(Phsdl2低表达与临床分期(Phsdl2主要参与细胞的脂肪酸代谢过程。结论hsdl2低表达与HNSCC的恶性演进密切相关,提示hsdl2在HNSCC的发生、发展中发挥抑癌基因的作用,同时其表达水平对于HNSCC的早期诊断和预后评估具有一定的指导意义。

关键词：头颈部肿瘤鳞状细胞癌 hsdl2 免疫组织化学预后评估

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hsdl2促进胰腺癌增殖及脂质代谢的机制研究

HSDL2促进胰腺癌增殖及脂质代谢的机制研究

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作者：韩安娜延边大学

学位级别：硕士

研究背景:胰腺癌是致死率极高的消化道恶性肿瘤,因其早期症状不明显、起病快等原因,致使患者5年生存率不足10%。目前,临床主要采用手术切除、辅助化疗和放疗等治疗策略,但效果欠佳。因此,迫切需要深入探索胰腺癌演进的分子机制,以期为... 详细信息

研究背景:胰腺癌是致死率极高的消化道恶性肿瘤,因其早期症状不明显、起病快等原因,致使患者5年生存率不足10%。目前,临床主要采用手术切除、辅助化疗和放疗等治疗策略,但效果欠佳。因此,迫切需要深入探索胰腺癌演进的分子机制,以期为胰腺癌的诊断和治疗提供新策略。多项研究证实,脂质代谢异常是恶性肿瘤的十大标志之一。脂质代谢因子-羟基类固醇脱氢酶样2(hsdl2),隶属于类固醇脱氢酶家族成员,可与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合,参与胆固醇的合成。有报道称,hsdl2过表达可促进细胞内胆固醇合成,使体内总胆固醇含量显著升高。亦有研究证实,hsdl2在甲状腺乳头状癌、胶质瘤、卵巢癌等肿瘤演进中发挥促癌作用。但目前hsdl2在胰腺癌中的作用尚不明确。研究目的:研究hsdl2在胰腺癌中的表达水平及临床病理学意义,探讨hsdl2对胰腺癌细胞生物学功能的影响,为HSLD2作为胰腺癌临床治疗的新靶点提供理论和实验依据。材料与方法:1.胰腺癌组织标本分析:1)采用免疫组织化学染色法检测hsdl2在胰腺癌组织及癌旁组织中的表达情况;2)通过卡方检验分析hsdl2的表达与患者临床病理参数之间的相关性;3)采用Kaplan-Meier生存曲线和Cox比例风险模型分析hsdl2的表达在胰腺癌患者临床预后评估中的意义。2.体外实验:1)应用小分子干扰RNA(siRNA)构建hsdl2沉默细胞株,并通过Western blot实验验证其沉默效果;2)通过噻唑蓝(MTT)、平板克隆和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)核素掺入实验检测hsdl2对细胞增殖的影响;3)通过STRING数据库、GEPIA数据库检索分析hsdl2可能参与的生物学功能;4)应用脂代谢试剂盒、BODIPYTM 493/503染色和Western blot实验检测hsdl2对细胞脂质代谢的影响。结果:1.hsdl2在胰腺癌组织中高表达:免疫组织化学染色结果显示,hsdl2主要表达于细胞质,其在胰腺癌组织中的表达呈阳性或强阳性,在癌旁组织中的表达多呈阴性,且在胰腺癌组织中的阳性表达率(76.2%)显著高于癌旁组织(53.7%;Phsdl2的表达与组织学分级(P=0.038)和肿瘤部位(P=0.015)显著相关;2.hsdl2高表达与胰腺癌患者的预后不良相关:人类蛋白图谱(HPA)数据库分析表明,hsdl2高表达的胰腺癌患者总生存期较hsdl2低表达的患者的总生存期短(Phsdl2表达水平可作为胰腺癌患者总生存期预后评估的独立风险指标(Phsdl2促进胰腺癌细胞的增殖:MTT、平板克隆和EdU核素掺入实验结果显示,与对照组相比,hsdl2沉默组胰腺癌细胞的细胞活力、克隆形成能力和DNA复制能力均显著下降(Phsdl2可下调周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白B(cyclinB)和细胞周期蛋白D(cyclinD)的表达水平;4.hsdl2促进胰腺癌细胞的脂质代谢:脂代谢试剂盒检测结果显示,沉默hsdl2可减少胰腺癌细胞内的甘油三酯、总胆固醇和磷脂含量;BODIPYTM 493/503染色结果显示,沉默hsdl2可减少胰腺癌细胞内的脂滴生成;Western blot实验结果显示,沉默hsdl2可明显下调脂质合成相关蛋白,脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和长链酰基-辅酶合成酶1(ACSL1)的表达。结论:HSLD2高表达预示胰腺癌患者的不良预后,且其通过调控胰腺癌细胞的增殖和脂质代谢促进胰腺癌的演进。

关键词：胰腺癌 hsdl2 预后增殖脂质代谢

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hsdl2在人恶性黑色素瘤中的表达及功能研究

HSDL2在人恶性黑色素瘤中的表达及功能研究

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作者：陈雷皖南医学院

学位级别：硕士

研究背景及目的:恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是由黑色素细胞转化产生的恶性肿瘤。黑色素细胞是由神经嵴分化而来,因此MM发生在由神经嵴细胞分化的组织或器官上,如口腔、鼻腔、胃肠道黏膜、颅脑等部位,但MM发生率最高的器官还... 详细信息

研究背景及目的:恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是由黑色素细胞转化产生的恶性肿瘤。黑色素细胞是由神经嵴分化而来,因此MM发生在由神经嵴细胞分化的组织或器官上,如口腔、鼻腔、胃肠道黏膜、颅脑等部位,但MM发生率最高的器官还是皮肤。恶性黑色素瘤的发病率因人种的不同和生活地区紫外线强度的不同而出现差异性。黑色素是由色素细胞产生,用来保护皮肤免受紫外线的损伤。有数据显示高加索人的MM发病率明显高于非洲人及亚洲人,同种皮肤颜色下生活中紫外线照射强的地区MM的发病率高。对色素痣的刺激及不正确处理也是MM发生的诱因之一。我国人民对恶性黑色素瘤的认识普遍不高,长期户外工作者没有有效的自我防护,减少紫外线对皮肤的损伤,尤其对足底、腰部、口腔黏膜等其他易刺激部位的色素痣没有足够的保护。加之对色素痣的不正确处理如:反复摩擦、化学药物、冷冻、不彻底的切除等均可诱发色素痣的恶变。当患者发现皮肤出现破溃,或肿块时才到医院就诊,此时恶性黑色素瘤往往已出现周围组织浸润,和淋巴结转移,失去了手术治疗的最佳时机。有数据显示0期MM的5年生存率为97%,IV期MM的5年生存率仅为10%。我国的MM发病率虽然不高,约占全身恶性肿瘤的4%%,但死亡率却在所有皮肤肿瘤中排名第一,我国MM的5年生存率不足10%。对早期恶性黑色素瘤没有有效的筛查手段,也是MM患者生存率不高的原因之一。因此从基因学角度对恶性黑色素瘤细胞进行研究,寻找有效的生物靶点,是提高早期恶性黑色素瘤的诊断率的重要方法,同时有效的生物靶点,也可为MM的治疗及预后判断提供全新的临床思路。方法:高内涵基因功能筛选平台,筛选在黑色素瘤细胞中的新功能阳性基因hsdl2。构建针对hsdl2基因不同靶点的RNA感染慢病毒载体,在工具细胞293T中,进行Western Blot外源验证靶点有效性,筛选出有效靶点。?使用qPCR方法检测hsdl2基因在不同工具细胞中mRNA均有高丰富度表达。?以hsdl2基因为模板设计RNA干扰靶点及双链DNA oligo制备,并构建慢病毒载体。?在体外感A375(人恶性黑色瘤细胞),使之敲除肿瘤细胞hsdl2基因,筛选后构建hsdl2缺陷的A375稳转细胞珠。(4)qPCR检测hsdl2基因在mRNA水平的基因敲减率。(5)对shhsdl2(A375细胞、加hsdl2基因shRNA病毒感染的细胞组)进行Celigo细胞计数检测细胞生长、MTT检测、PI-FACS细胞周期检测、Annexin V-APC单染法细胞凋亡检测。结果:1.经shRNA慢病毒感染后,qPCR方法检测m RNA水平上实验组A375细胞中hsdl2基因表达量受到明显抑制(p2.细胞生长检测表明:shhsdl2组(正常A375细胞、加hsdl2基因shRNA病毒感染的细胞组)与shCtrl组(正常A375细胞、加阴性对照病毒感染的细胞)相比,增殖抑制明显。3.MTT检测结果表明:相比shCtrl组,shhsdl2组细胞增殖减缓。4.细胞周期检测表明:shhsdl2组处于S期的细胞增多(P2/M期的细胞减少(Phsdl2组凋亡数增多(Phsdl2可有效降低黑色素瘤细胞A375胞活性、抑制细胞增值、促进细胞凋亡,其可能是MM的有效分子生物靶点,为临床MM的诊断、治疗、预后判断提供新的思路及方法。

关键词：恶性黑色素瘤 hsdl2 慢病毒载体细胞增殖细胞凋亡

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hsdl2蛋白在乳腺癌增殖和预后评估中的作用及分子机制研究

HSDL2蛋白在乳腺癌增殖和预后评估中的作用及分子机制研究

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作者：董兵延边大学

学位级别：硕士

研究目的:探讨hsdl2蛋白在乳腺癌中的表达情况,并分析hsdl2高表达与乳腺癌患者临床病理特征和预后的相关性;揭示hsdl2蛋白在乳腺癌细胞增殖和细胞周期进程中的作用,并初步阐明hsdl2调控乳腺癌恶性演进的相关分子机制,为乳腺癌临床治疗... 详细信息

研究目的:探讨hsdl2蛋白在乳腺癌中的表达情况,并分析hsdl2高表达与乳腺癌患者临床病理特征和预后的相关性;揭示hsdl2蛋白在乳腺癌细胞增殖和细胞周期进程中的作用,并初步阐明hsdl2调控乳腺癌恶性演进的相关分子机制,为乳腺癌临床治疗提供预后标志物和潜在分子靶点。材料与方法:1.数据库及乳腺癌组织标本分析:运用Oncomine数据库检索乳腺癌组织中hsdl2 mRNA的表达水平;通过免疫组织化学染色法检测hsdl2蛋白在119例乳腺癌组织和40例正常乳腺组织中的表达情况,并分析其表达与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系;采用Kaplan-Meier plotter数据库、Human Protein Atlas数据库和Cox 比例风险模型分析hsdl2的表达在乳腺癌患者临床预后评估中的意义。2.体外实验:采用蛋白免疫印迹实验检测hsdl2蛋白在多种人乳腺癌细胞系中的表达情况,应用小干扰RNA（siRNA）技术沉默MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的hsdl2基因的表达,并通过蛋白免疫印迹实验验证其沉默效果。免疫荧光实验检测hsdl2蛋白在乳腺癌细胞中的定位;应用噻唑蓝（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）实验和平板克隆形成实验检测hsdl2基因沉默对细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测hsdl2基因沉默对细胞周期进程的影响;蛋白免疫印迹实验检测hsdl2基因沉默对PI3K/AKT信号通路及细胞周期相关蛋白的影响。结果:1.hsdl2蛋白在乳腺癌组织中高表达,并与乳腺癌患者的分化程度和临床分期密切相关:Oncomine数据库检索发现hsdl2在乳腺癌组织中的mRNA表达显著高于正常乳腺组织（P=0.01）;免疫荧光结果显示,hsdl2蛋白主要定位于乳腺癌细胞的细胞质中;免疫组化统计结果显示:hsdl2蛋白在乳腺癌组织中的阳性率为87.4%（104/119）,显著高于正常乳腺组织（25%,10/40）（P＜0.01）,强阳性率为48.7%（58/119）,显著高于正常乳腺组织（12.5%,5/40）（P＜0.01）。进一步分析hsdl2蛋白高表达与乳腺癌患者临床病理特征的相关性发现,hsdl2蛋白高表达与乳腺癌患者的分化程度和临床分期密切相关（P＜0.05）,与年龄、淋巴结转移和HER2等因素无明显相关性。2.hsdl2蛋白高表达是乳腺癌患者不良预后的独立风险因素:KM plotter和Protein Atlas数据库分析显示,hsdl2 mRNA高表达患者的生存期明显短于hsdl2 mRNA低表达的患者（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析结果显示,hsdl2蛋白高表达的乳腺癌患者总生存期明显短于hsdl2蛋白低表达的患者（P＜0.05）。对于PR（-）乳腺癌患者,hsdl2蛋白低表达的乳腺癌患者总生存期明显高于hsdl2蛋白高表达的患者（P＜0.05）,但对于PR（+）乳腺癌患者总生存期无明显相关性。单因素Cox回归模型分析结果显示,临床分期、雌激素受体、孕激素受体和hsdl2蛋白表达水平与乳腺癌患者的不良预后密切相关（P值均＜0.05）,进一步多因素Cox回归模型结果显示,hsdl2蛋白的表达水平、临床分期和孕激素受体的表达均是乳腺癌患者不良预后的独立风险因素（P＜0.05）。3.hsdl2通过调控细胞周期分布影响乳腺癌细胞的增殖:MTT实验结果表明,与对照组相比,沉默hsdl2可以有效降低乳腺癌细胞的细胞活性（P＜0.01）;通过平板克隆形成实验发现,下调hsdl2表达可显著抑制乳腺癌细胞的集落形成能力（P＜0.01）。PI单染结果表明,沉默hsdl2可诱导乳腺癌细胞阻滞于G0/G1期,使G2/M期细胞分布减少。蛋白免疫印迹实验结果显示,沉默hsdl2可明显下调细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）、细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达水平,上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21（P＜0.01）,P53的表达无明显变化。4.hsdl2沉默可影响PI3K/AKT信号通路的激活:蛋白免疫印迹实验结果显示,沉默hsdl2可抑制PI3K/AKT信号通路的激活,下调p-AktSer473、p-S6KThr389等标志物的表达（P＜0.01）,而AKT、S6的表达未发生明显变化。结论:1.hsdl2蛋白在乳腺癌组织中高表达,且其高表达与乳腺癌患者的分化程度、临床分期和生存期密切相关;2.hsdl2蛋白高表达是乳腺癌患者不良预后的独立风险因素;3.沉默hsdl2蛋白表达可有效抑制乳腺癌细胞增殖,诱导细胞周期阻滞,抑制PI3K/AKT信号通路的激活。

关键词：乳腺癌 hsdl2 增殖预后 PI3K/AKT

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基于定量化学蛋白质组学探究雷公藤红素促进乳腺癌细胞凋亡的机制

基于定量化学蛋白质组学探究雷公藤红素促进乳腺癌细胞凋亡的机制

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作者：刘莉赣南医学院

学位级别：硕士

目的:本研究旨在利用基于活性的化学蛋白质组学技术(Activity-based protein profiling,ABPP),鉴定乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中合成的雷公藤红素探针(Celastrol probe,cel-p)的蛋白质靶标,并根据靶标信息阐明雷公藤红素(Celastrol,cel)抗癌活性的机制,为合理开发利用celastrol提供充分的科学依据。方法:本实验选用MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)细胞株作为研究对象,通过串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)标记确定celastrol的靶标,通过蛋白质免疫印记(Western blotting,WB)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)等实验技术进行靶标的验证,探索celastrol对乳腺癌细胞的抗癌作用。结果:1.通过CCK8方法确定celastrol和cel-p对乳腺癌细胞的半数抑制率(50%inhibiting concentration,IC),初步探索celastrol是否具有抗肿瘤作用和最佳给药剂量,证实了celastrol和cel-p具有相近的IC值,说明两者具有等效性,cel-p可以代替原药celastrol进行下一步的靶标探索。2.采用SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)蛋白凝胶方法发现cel-p结合蛋白具有浓度依赖性,证实了其高效的生物标记效率,在4μM的浓度下,条带显示cel-p与蛋白结合明显,同时,cel-p与4×原药celastrol具有相同的结合位点。采用IF实验方法证实,cel-p能在2h之内从胞浆进入胞核,因此可以用作后续的细胞生物实验,验证相关蛋白的生物效应。3.采用TMT标记的方法,在Uniprot数据库筛选出高可信度的靶点hsdl2,结合pull down进行验证,证实了cel-p能够和celastrol竞争结合hsdl2,确定hsdl2为celastrol与乳腺癌细胞的靶点。采用IF,证实了hsdl2与cel-p具有共定位现象。采用CETSA技术,证实了celastrol能够增强靶蛋白的热稳定性,为后续进一步的生物效应实验提供依据。采用纯蛋白标记方法,证实了人重组hsdl2与celastrol结合具有浓度依赖性。4.采用流式细胞术(Flow cytometry)方法和蛋白免疫印迹技术(Western blot)证实了celastrol能诱导癌细胞凋亡。5.采用基因沉默技术敲低hsdl2,蛋白免疫印迹技术和流式细胞术证实敲低hsdl2能促进乳腺癌细胞凋亡,同时,细胞的半数抑制率也下降,过表达逆转了细胞凋亡的情况。6.在David数据库筛选了9条高可信度KEGG通路分析,选取MAPK通路探索与药物靶点之间的联系,celastrol给药之后,结果显示对其通路蛋白ERK的磷酸化抑制程度具有浓度依赖性,即随着给药浓度的提高,磷酸化的程度随之降低,而在过表达hsdl2之后,促进了ERK磷酸化。结论:我们通过发现celastrol在体外较低浓度下达到抗肿瘤效果,作用机制可能是通过MAPK通路能直接与hsdl2结合,抑制hsdl2表达并促进细胞凋亡,从而产生抗乳腺癌作用。

关键词：雷公藤红素 hsdl2 Activity-based protein profiling 凋亡

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