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hsaf防控梨叶部病害及早期落叶效果试验

中国南方果树 2017年第5期46卷 104-106页

作者：曾少敏张长和黄新忠福建省农业科学院果树研究所福州350013 福建省建宁县农业局福建建宁354500

以5年生翠冠梨为供试品种,以常规化学药剂与清水为对照,开展了hsaf防控梨叶部病害及早期落叶试验。结果表明,hsaf对梨叶部主要病害、早期落叶与返花返青具有一定防控作用,但其效果极显著差于常规化学药剂。8月中旬对梨炭疽病、梨褐斑病... 详细信息

以5年生翠冠梨为供试品种,以常规化学药剂与清水为对照,开展了hsaf防控梨叶部病害及早期落叶试验。结果表明,hsaf对梨叶部主要病害、早期落叶与返花返青具有一定防控作用,但其效果极显著差于常规化学药剂。8月中旬对梨炭疽病、梨褐斑病、梨黑斑病、梨斑点病的防效分别为28.21%、15.53%、68.32%和0.82%,仅为常规化学药剂的50.81%、20.53%、77.36%和1.89%;控制早期落叶、返花、返青效果分别为43.14%、39.4%和60.65%,仅为常规化学药剂的54.68%、40.29%和62.17%,至10上旬落叶率、返花率与清水对照已无明显差异。

关键词： hsaf 梨叶部病害早期落叶防控

Antifungal activity of hsaf against Colletotrichum fructicola and its possible mechanisms of action

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Antifungal activity of HSAF against Colletotrichum fructicol...

hsaf对梨黑斑病菌的抑制作用及抑菌机理研究

中国植物病理学会2019年学术年会

作者：李朝辉 Tang Bao Sun Weibo Zhao Yancun 刘凤权 Institute of Plant Protection Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and SafetyState Key Laboratory Cultivation Base of Ministry of Science and TechnologyJiangsu Academy of Agricultural Sciences

Anthracnose caused by Colletotrichum fructicola is one of the most important diseases in pear fruit,result in huge economic *** anthracnose is primarily an orchard disease but also may lead to significant post-harvest losses during the storage *** is an antifungal natural product isolated from the biocontrol agent Lysobacter enzymogenes and is regarded as a potential biological pesticide with novel mode of *** was previously demonstrated to show antifungal activity against a number of plant pathogenic fungi,but its efficacy against Colletotrichum species remained *** current study,the substantially antifungal activities of hsaf on mycelial growth,conidia germination and apperssorium formation of *** were observed in a dose-dependent *** found that hsaf was fungicidal toward Colletotrichum fructicola with half maximal effective concentration(EC)of 0.69 μg/mL when assayed mycelia growth on ***,hyphae grown on hsaf added plates displayed defects such as clustered branching,curling,swelling and depolarized *** the presence of hsaf(4 μg/mL),conidia germination were significanly delayed and the germ tubes growth were inhibited,however appressorium could still formed after 24 h ***,many hsaf-treated conidia featured small surface protuberances that could reflect failed attempts at forming a germ *** at the concentration of 8 μg/mL could totally block the conidia germination of *** conclusion,our results validate hsaf as a potential drug to treat anthracnose caused by Colletotrichum fructicola.

关键词： Biocontrol Antifungal activity Colletotrichum fructicola Anthracnose hsaf

来源： cnki会议评论

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HSAF对梨黑斑病菌的抑制作用及抑菌机理研究

作者：李丙新安徽农业大学

学位级别：硕士

热稳定抗真菌因子(Heat stable antifungal factor,hsaf),是产酶溶杆菌C3和OH11代谢产生的一类大环内酯类抗生素,对多种丝状真菌具有抑制活性,具有较好的开发应用前景。梨黑斑病是梨生产上的主要病害之一。由链格孢菌Alternaria altern... 详细信息

热稳定抗真菌因子(Heat stable antifungal factor,hsaf),是产酶溶杆菌C3和OH11代谢产生的一类大环内酯类抗生素,对多种丝状真菌具有抑制活性,具有较好的开发应用前景。梨黑斑病是梨生产上的主要病害之一。由链格孢菌Alternaria alternata引起,其为害梨的叶片与果实,形成叶片与果实的黑色斑点症状,严重影响我国梨的产量与品质。前期,从全国主要的梨产区采集了梨黑斑病样品,并进行了分离鉴定。为明确hsaf对梨黑斑病菌种群的抑制效果及其对梨黑斑病作用机理,本文有以下几个方面结果:1、梨黑斑病菌分离鉴定及供试菌株筛选从全国18个梨产区66份梨黑斑病样品中共分离得到了57株梨黑斑病菌,根据rDNA-ITS、Gpd、RPB2、OPA2和EF1α核苷酸序列将这57株梨黑斑病菌分为3大类,并选出各自代表性菌株,以致病性和对hsaf敏感性为依据,筛选出具有代表性的HN-5作为供试菌株。2、hsaf对梨黑斑病菌HN-5抑制活性测定采用生长速率法测定hsaf对梨黑斑病菌HN-5室内毒力水平,获得hsaf对梨黑斑病菌HN-5的毒力回归方程。hsaf处理HN-5分生孢子时,发现hsaf能够抑制分生孢子萌发L。进一步的研究发现,hsaf处理后的较老的菌丝明显变粗膨胀,菌丝扭曲严重并且菌丝分枝增多,通过细胞壁染色发现hsaf能够抑制菌丝尖端细胞壁的合成,同时细胞核染色发现hsaf处理后的菌丝细胞核消失,细胞发生凋亡。3、hsaf对梨黑斑病菌田间药效试验开展hsaf对梨黑斑病菌田间药效试验,武汉梨园的结果表明:喷施hsaf防治效果与对照不喷药相比,病情指数从19.13下降到1.33,翠冠梨上病情指数从13.89下降到2.06,而且相较于常规农药10%苯醚甲环唑可湿性粉剂3000倍液,hsaf的防治效果也要好。重庆梨园的hsaf防治效果也要优于对照代森锰锌药剂。4、hsaf对梨黑斑病菌作用分子机制初探为明确hsaf的作用分子机理,对hsaf处理的梨黑斑病菌(处理组)与野生型(对照组)的进行转录组测序分析,对这些差异表达基因进行GO与KEGG富集分析,发现hsaf处理后,代谢过程、催化活性和膜相关基因、氨基酸代谢、药物代谢和三羧酸循环和碳代谢大量下调表达。对代谢途径与信号传导途径相关基因进一步分析,发现碳代谢途径中的关键基因下调表达,推测hsaf可能阻断糖酵解途径和三羧酸循环,导致菌丝的有氧呼吸被抑制,影响细胞内糖的代谢与能量的获取。与碳代谢相对应的是,大多数氮代谢相关基因也呈下调表达模式。进一步分析发现氮代谢与炭代谢关联的信号通路如鞘脂代谢途径和AMPK信号传导途径响应hsaf对黑斑病菌的毒性。5、梨黑斑病菌遗传转化体系建立通过对原生质体制备条件与转化方法的优化,建立了梨黑斑病菌遗传转化体系:梨黑斑病菌HN-5在MR培养基中培养36 h,收集菌丝在酶解液(1%崩溃酶+1%裂解酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶)中酶解3 h,离心收集原生质体,用稳渗剂(0.7 mol/L NaCl+0.8 mol/L Mannitol)清洗原生质体,再用STC Buffer重悬浮原生质体用于转化;将2μg的质粒转入梨黑斑病菌,共获得12个转化子,成功建立梨黑斑病菌PEG介导的原生质体转化体系。

关键词： hsaf 链格孢菌抑菌活性抑菌机理遗传转化体系

hsaf生防制剂开发及其防治梨腐烂病效果研究

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HSAF生防制剂开发及其防治梨腐烂病效果研究

作者：穆琛南京农业大学

学位级别：硕士

我国梨产量和梨树栽培面积居世界第一位。梨树病害的发生是威胁我国梨产业发展的一个重要因素。梨腐烂病号称梨树“癌症”,影响果树树势和产量,具有发病率高、发生区域广、难以控制的特点。目前,防治腐烂病的主要方法是以化学杀菌剂为... 详细信息

我国梨产量和梨树栽培面积居世界第一位。梨树病害的发生是威胁我国梨产业发展的一个重要因素。梨腐烂病号称梨树“癌症”,影响果树树势和产量,具有发病率高、发生区域广、难以控制的特点。目前,防治腐烂病的主要方法是以化学杀菌剂为主。但是,化学杀菌剂存在着污染、有害等问题,不利于环境的和谐。因此,开发抗菌性强、对环境人体友好的新型生防药剂,可以作为一种防治方法的有益补充,也可以减少化学药剂带来的负面影响。产酶溶杆菌OH11是一种新型的生防细菌,具有广泛的抑菌谱,对真菌、细菌和卵菌等具有抑制作用。热稳定抗真菌因子(Heat Stable Antifungal Factor,简称hsaf)可由产酶溶杆菌OH11的次级代谢产物中分离得到。本实验研究了OH11对梨腐烂病菌、黑斑病菌、轮纹病菌和炭疽病菌的拮抗作用,结果表明OH11对梨上几种主要病原真菌病菌具有高效拮抗作用;室内发酵获得含有hsaf的发酵液,发酵液加热前后对病菌抑制作用无变化,均有明显抑制效果;并且随着发酵液浓度的增加,对腐烂病菌的抑制效果愈加明显。在此基础上,将含有hsaf发酵液开发成两种生防制剂,一种是水剂,使用浓度40 ug/mL;一种是凝胶剂,使用浓度为20 ug/mL。室内评价hsaf生防制剂对离体枝条和梨果的防治效果,HASF生防制剂表现出了较好防效。2013年在陕西乾县、江苏丰县和河南新乡开展HASF生防制剂的大田试验,实验结果表明hsaf凝胶剂对梨腐烂病的防治效果与化学药剂甲硫萘乙酸、腐殖酸铜相当;且hsaf水剂可以抑制梨树枝干新生病疤的形成,陕西地区对新生病斑防效可达到77.8%;hsaf水剂对梨树叶部病害防效与当地常规药剂相当。

关键词：梨树腐烂病 hsaf 生防制剂大田试验

hsaf生物合成中醇脱氢酶OX4的底物识别机制研究

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HSAF生物合成中醇脱氢酶OX4的底物识别机制研究

作者：谢向前山东大学

学位级别：硕士

hsaf（heat-stable antifungal factor）是从生防菌株产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes）C3中分离得到的多环特特拉姆酸大环内酰胺（Polycyclic Tetramate Macrolactam,PoTeM）类化合物,具有强效广谱抗真菌活性。前期对hsaf的生物合成机制研究发现醇脱氢酶OX4通过延长的迈克尔加成反应催化特定立体构型的5-5双环底物（3-deOH alteramide C）还原环化形成5-5-6三环产物,但仅催化其它立体构型的5-5双环底物（如3-deOH alteramide B）的双键还原而不环化。本研究在前期hsaf生物合成研究的基础上,开展了醇脱氢酶OX4的结构生物学与体外生物化学研究,以期阐明醇脱氢酶OX4的底物立体构型识别机制。通过对OX4重组蛋白的表达纯化、晶体筛选以及X-ray数据收集等实验,首次解析了 OX4蛋白2.3 A的高分辨晶体结构,同时解析了 OX4-NADP（H）二元（3.1 A）及 OX4-NADP（H）-底物 3-deOH alteramideC 三元（3.1 A）复合物结构。我们发现所有结构中OX4均为同源二聚体,每个单体均包含1个核苷酸结合结构域和1个催化结构域,NADP（H）与底物3-deOH alteramide C均结合于2个结构域之间的裂缝处。随后,我们通过点突变体的体外酶活及亲和力测定实验验证了OX4与两者的结合位点。其中,S168和K195残基对NADP（H）的结合发挥关键作用,Y50、D57、D67、T110、F111、M113、F115、W260、Q265、M280、F281、F290和L292残基共同参与底物结合口袋的构建。此外,利用OX4W260F与底物3-deOH alteramide C的体外反应,获得了 1个新的还原产物3-deOH alteramide E。基于OX4与底物复合物的晶体结构和突变体的体外酶活及亲和力研究,我们初步推测了 OX4催化hsaf中6元环形成的分子机制。此外,本研究首次获得了纯度较高且具有体外催化活性的负责hsaf多烯前体合成的iPKS/NRPS全长蛋白,并首次发现了疣孢菌代谢产生邻二烷基取代芳香酸类化合物。综上所述,本研究通过结构生物学与体外生物化学相结合策略,解析了醇脱氢酶OX4的apo结构及2个复合物结构,定位了 OX4中多个关键氨基酸残基,初步推测了 OX4催化成环的“两步”反应机制,为阐明醇脱氢酶OX4的底物立体构型识别机制奠定了基础,为同类酶的催化特性改造提供了理论依据。

关键词： hsaf 醇脱氢酶结构生物学晶体结构芳香酸

产酶溶杆菌OH11中转录因子LetR调控次生代谢产物hsaf合成的机制研究

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产酶溶杆菌OH11中转录因子LetR调控次生代谢产物HSAF合成的机制研...

作者：王平南京农业大学

学位级别：硕士

产酶溶杆菌OH11(Lysobacter enzymogenes OH11)分离自辣椒根际土壤,该属细菌基因组DNAG+C%含量高、无鞭毛、有蹭性运动(Twitching motility,TM)、能分泌多种胞外水解酶和天然抗菌小分子化合物,对多种病原菌均有较强的抑制作用,生防应用... 详细信息

产酶溶杆菌OH11(Lysobacter enzymogenes OH11)分离自辣椒根际土壤,该属细菌基因组DNAG+C%含量高、无鞭毛、有蹭性运动(Twitching motility,TM)、能分泌多种胞外水解酶和天然抗菌小分子化合物,对多种病原菌均有较强的抑制作用,生防应用前景十分广阔。hsaf(Heat-StableAntifungalFactor)是分离自该菌的是一类结构新颖和作用方式独特的能够显著抑制真菌和卵菌生长的活性物质。hsaf的生物合成途径已经在本实验室前期研究中被阐明,但其生物合成调控机制仍不清楚。转录因子(TranscriptionFactors,TFs)是一类广泛存在于细菌中,能与启动子上游的特定位点结合,从而控制目的基因转录表达的蛋白质分子。转录因子的研究有助于我们更好地了解DNA结合的蛋白种类和功能,是基因调控研究的一个关键领域。本论文以能够产生hsaf的产酶溶杆菌OH11为研究对象,旨在探索转录因子调控hsaf生物合成的机制研究。经过基因注释,我们发现产酶溶杆菌OH11全基因组中共含有363个转录因子,共分为4个类别。本文选取螺旋-转角-螺旋(Helix Turn Helix,HTH)家族的转录因子,共构建了 87个转录因子的细菌单杂交(Bacterial one-hybrid system)文库。经过筛选,最终获得了 10个可以直接结合在Phsaf区(hsaf生物合成操纵子的启动子区域)的转录因子,本文分别构建了这10个转录因子基因的缺失突变株,并检测所有突变株的hsaf产量,发现1个突变株(△letR)的hsaf产量显著上升,后续的细菌单杂交和琼脂糖凝胶阻滞电泳试验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)都证明LetR能直接结合在Phsaf区。Phsaf区DNA片段截短后进行EMSA试验进一步鉴定了一段LetR结合的核心区域。在野生型OH11中敲除letR后hsaf的产量和hsaf合成关键基因pks/nrps(lafB)的转录量显著增加,而在野生型OH11中过表达letR后,hsaf的产量和合成关键基因pks/nrps(lafB)的表达量降低。本研究不仅鉴定了一个影响hsaf产量的转录因子,而且构建了一个hsaf高产菌株(AletR),这使我们在hsaf制药和生物防治的方向上又迈进了一步。

关键词：产酶溶杆菌 hsaf LetR Phsaf

生防细菌的筛选与溶杆菌中抗真菌物质hsaf的田间防效研究

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生防细菌的筛选与溶杆菌中抗真菌物质HSAF的田间防效研究

作者：蒋天萍扬州大学

学位级别：硕士

植物病害是影响农业生产的自然灾害之一,解决大多数植物病害最简易快速的措施依然是化学防治,化学防治引起的环境问题愈发值得关注。为实现我国农药减施增效,以我国主要植物病害为防治对象,筛选具有杀菌防病效果的微生物菌株和次生代谢... 详细信息

植物病害是影响农业生产的自然灾害之一,解决大多数植物病害最简易快速的措施依然是化学防治,化学防治引起的环境问题愈发值得关注。为实现我国农药减施增效,以我国主要植物病害为防治对象,筛选具有杀菌防病效果的微生物菌株和次生代谢产物,并以拮抗微生物或活性代谢产物为有效成分创制安全高效的生物杀菌剂是重要举措之一。本研究通过采集全国不同地区果园的土壤样品,以22种病原菌为靶标,包括常见病原真菌小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、梨腐烂病菌、梨黑斑病菌等,以及常见病害的致病细菌水稻白叶枯病菌、水稻条斑致病菌等,利用传统的筛菌方法,初筛得到157株具有抑菌效果的生防菌株,16S rDNA鉴定了 30株抑菌活性较好的菌株,这些生防菌株都具有被挖掘的潜力。其中,GM-7、GM-8被鉴定为溶杆菌(Lysobacter),溶杆菌属细菌属于黄单胞科(Xanthomonadaceae),因其可产生大量胞外酶及活性次生代谢产物,并且环境友好,是一种新型的有待开发的生防细菌。将这两株溶杆菌与其他四种典型溶杆菌,包括产酶溶杆菌(***)OH11、抗生素溶杆菌(***)OH13、胶状溶杆菌(***)OH17、变棕溶杆菌(***)OH23,在胞外酶、蹭动性、拮抗活性等方面进行比较。结果表明,与上述四种典型溶杆菌一致,GM-7、GM-8都可产生蛋白酶、纤维素酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。此外,GM-7、GM-8表现出与产酶溶杆菌OH11相似的蹭动性,并且具有良好的抗真菌卵菌活性。通过质谱分析发现,GM-7的主要活性物质为hsaf(heat-stable antifungal factor,dihydromaltophilin),GM-8 产生少量 hsaf 及其类似物 ATB(Alteramide B)。hsaf和ATB已被报道来自产酶溶杆菌OHl1,对多种植物病原真菌及卵菌具有较好的拮抗活性,并且作用机制独特,具有被开发为生物农药的潜力。因此,为进一步研究hsaf的开发价值,我们进行了 hsaf对小麦赤霉病的田间防治试验,使用hsaf与用于防治小麦赤霉病最广泛的药剂多菌灵做比较,发现20 μg/mL hsaf的防治效果与50%多菌灵相似,40μg/mL hsaf比50%多菌灵效果更好。依托国家梨产业体系,在各试验站开展了 hsaf生防制剂田间防治梨树病害的试验。结果显示,hsaf水剂对梨炭疽病防效在90%以上,效果和代森锰锌相当;hsaf水剂对梨黑星病的防效和40%福星乳油8000倍液的效果相当,均在80%以上;hsaf凝胶剂对梨腐烂病的病疤治愈率在84.27%-95.12%之间,均高于80%,且优于腐殖酸铜水剂、石硫合剂等常用药剂。这些结果都表明hsaf具有被开发为植物病害生防制剂的前景。

关键词：生物防治生防细菌溶杆菌 hsaf 小麦赤霉病梨树病害

产酶溶杆菌抗菌活性物质hsaf对小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）作用机制的初探

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产酶溶杆菌抗菌活性物质HSAF对小麦赤霉病菌（Fusarium graminear...

作者：程超南京农业大学

学位级别：硕士

hsaf是由产酶溶杆菌OH11产生的一种热稳定性抗真菌物质,它对病原真菌及卵菌具有广谱的抑菌活性,对酵母和细菌则无抑菌活性。前人研究报道,hsaf可能作用于构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的神经酰胺合成途径,扰乱鞘脂类物质的合成,致使细... 详细信息

hsaf是由产酶溶杆菌OH11产生的一种热稳定性抗真菌物质,它对病原真菌及卵菌具有广谱的抑菌活性,对酵母和细菌则无抑菌活性。前人研究报道,hsaf可能作用于构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的神经酰胺合成途径,扰乱鞘脂类物质的合成,致使细胞壁合成所需的物质过度积累,导致细胞壁增厚,从而影响*** 菌丝的正常生长。然而,这种机制还只是一种推测,缺乏直接证据。因此,进一步开展hsaf作用机制的研究对于hsaf生防制剂的开发具有重要意义。本研究测定了 hsaf对生产上常见的10种病原真菌和1种病原卵菌的拮抗活性。结果表明,hsaf对这11种病原菌都表现出不同程度的生长抑制作用,其中hsaf对梨树腐烂病菌(Valsa pri)、稻瘟病菌(Magnaprthe oryzae)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的生长抑制作用最强,抑制中浓度EC50值分别为0.5 μg/mL、0.7μg/mL、0.8 μg/mL,抑制 95%浓度 EC95 值分别为 9.1 μg/mL、2.2μg/mL、6.3 μg/mL,表明hsaf对梨树腐烂病、稻瘟病以及油菜菌核病等3种病害的防治效果可能最好。以不同浓度hsaf处理小麦赤霉病菌(Fusariu)graminiarumPH-1后发现,PH-1除孢子萌发、菌丝生长以及分生孢子产生受到抑制外,其菌丝形态与幼殖体形态也会发生畸变,包括菌丝扭曲、顶端膨胀、分枝增加以及孢子萌发点增多、芽管肿胀等现象,并且hsaf对PH-1分生孢子萌发的抑制作用强于其对PH-1菌丝生长的抑制作用。表明hsaf破坏了 PH-1的极性生长,且可能影响到PH-1的能量代谢。TEM检测结果显示,hsaf能够导致PH-1细胞发生质壁分离、细胞内陷以及脂质体增多,并且在hsaf存在的情况下,PH-1对渗透胁迫因子、细胞膜胁迫因子及细胞壁胁迫因子变得更为敏感,表明hsaf能够影响PH-1的细胞结构,降低PH-1的抗环境胁迫能力并起到类似渗透胁迫因子的作用。与hsaf相比,用多菌灵处理后PH-1主要表现为菌丝扭曲和近菌丝顶端处分枝增加,而hsaf除导致病原菌菌丝扭曲生长,分枝增多外,还造成菌丝顶端膨胀,因此hsaf对病原真菌的作用方式与多菌灵存在一定的差异。

关键词： hsaf 多菌灵小麦赤霉病菌作用机制

产酶溶杆菌抗菌代谢物hsaf高产菌株选育的研究

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产酶溶杆菌抗菌代谢物HSAF高产菌株选育的研究

作者：史晓敏南京师范大学

学位级别：硕士

产酶溶杆菌属黄单胞科,溶杆菌属,是一种在环境中广泛存在的新型植物病害生防细菌。而hsaf(Heat-Stable Antifungal Factor)是其产生的一种小分子抗菌物质,其能够对多种真菌和卵菌产生抑制作用,在生物防治中发挥着重要作用,是一种结构和... 详细信息

产酶溶杆菌属黄单胞科,溶杆菌属,是一种在环境中广泛存在的新型植物病害生防细菌。而hsaf(Heat-Stable Antifungal Factor)是其产生的一种小分子抗菌物质,其能够对多种真菌和卵菌产生抑制作用,在生物防治中发挥着重要作用,是一种结构和作用方式全新的广谱抗真菌、卵菌活性物质。生产无农药残留、无病虫危害的农业产品一直是促进人类自身健康和保护生态环境的重要途径,也是生物防治药物研究领域的主要目标。而hsaf作为一种环境友好型杀菌剂,具有开发为新型生物源农药的巨大潜力。然而现阶段hsaf的产量太低,无法实现工业化大规模生产,一定程度上制约了其在病害防治中的广泛应用和推广。因此获得hsaf高产菌株,提高hsaf产量是当前亟需解决的问题。本研究以hsaf为研究对象,以产酶溶杆菌OH11为出发菌株,采用三种方法进行hsaf高产菌株的选育。通过紫外诱变、hsaf负调控基因的敲除、hsaf生物合成基因及其正调控基因的启动子改造,构建了多个不同的突变菌株,并对其hsaf产量进行评估。通过紫外诱变,筛选到3株hsaf高产菌株,其hsaf产量与野生型相比分别提高了 36%、33%和25%,但是遗传稳定性实验表明,其遗传性状并不稳定。在产酶溶杆菌OH11中,已知第二信使c-di-GMP对hsaf的生物合成具有调控作用,本研究将c-di-GMP代谢蛋白的编码基因le3756和le1974这2个负调控基因进行敲除,获得双突变菌株△3756△1974,其hsaf产量比野生型提高了 67%,随后在该菌株的基础上敲除RNA伴侣蛋白的编码基因hfq,获得菌株A3756A1974△hfg,与野生型菌株OH11相比,其hsaf产量提高了 1倍;此外,由于c-di-GMP代谢蛋白的编码基因le632对hsaf的生物合成具有正调控作用,因此在双突变菌株A3756△1974中,将le1632的启动子用强启动子Ptac换,得到菌株△2-1632-Ptac,与野生型菌株相比,其hsaf产量提高了 1.7倍。通过对菌株A3756A1974△hfq和A2-l632-Ptac在10%TSB培养基中的生长曲线进行测定,发现其生长没有受到不良影响,其最大细胞密度基本可以达到野生型水平,且在发酵过程中始终保持着稳定的hsaf高产趋势。总之,本研究采用多种方法筛选到2株稳定遗传的hsaf高产菌株,为后续的hsaf高产菌株的选育提供一个参考,为实现其工业化生产奠定基础。

关键词： hsaf 产酶溶杆菌高产菌株选育生物源农药