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核受体基因Tchr96调控朱砂叶螨对丁氟螨酯抗药性形成

核受体基因TcHR96调控朱砂叶螨对丁氟螨酯抗药性形成

引用

作者：文翔西南大学

学位级别：硕士

朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种分布广泛、危害性大且难于防治的重要农业害螨。由于目前的害螨防治主要以化学药剂为主,使得朱砂叶螨对大量杀螨剂已经产生抗药性。丁氟螨酯是一种新型的苯酰乙腈类杀螨剂,同时也是一种半酯酶... 详细信息

朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种分布广泛、危害性大且难于防治的重要农业害螨。由于目前的害螨防治主要以化学药剂为主,使得朱砂叶螨对大量杀螨剂已经产生抗药性。丁氟螨酯是一种新型的苯酰乙腈类杀螨剂,同时也是一种半酯酶依赖性前体杀螨剂,已经被广泛运用于田间害螨防治。目前,朱砂叶螨丁氟螨酯抗药性主要由解毒酶活性增强引起,而包括核受体在内的转录因子则通过对靶基因的转录调控作用参与药物的解毒代谢过程。hr96基因是核受体超家族中的一员,已有研究表明hr96对抗药性的形成至关重要。本研究基于前期朱砂叶螨转录组数据和二斑叶螨基因组数据库,对朱砂叶螨一条Tchr96调控抗药性进行了系统研究,具体的研究结果如下:1.克隆获得朱砂叶螨的一条核受体hr96基因,该基因c DNA全长1506bp,编码501个氨基酸,预测的蛋白分子量为56.88 KDa,理论等电点为6.55,命名为Tchr96。生物信息学分析表明,Tchr96具有核受体家族保守的LBD和DBD结构域,属于NR1J家族,且该基因与二斑叶螨tetur36g00260为同源基因。2.通过q PCR对Tchr96在朱砂叶螨不同品系和药剂诱导下m RNA表达模式进行分析,结果显示,在甲氰菊酯抗性品系(Fe R)中Tchr96表达量与敏感品系(SS)无显著差异,但在丁氟螨酯抗性品系(Cy R)中,Tchr96表达量是敏感品系(SS)的18.2倍;分别经LC和LC两个浓度的丁氟螨酯诱导后,SS和Cy R品系的Tchr96的表达量与对照均无显著差异。3.采用叶碟饲喂法对Tchr96进行RNAi研究,结果显示在SS品系中,Tchr96的沉默效率为59%,丁氟螨酯对朱砂叶螨的LC由干扰前的2.9mg/L下降至1.5mg/L;在Cy R中,Tchr96的沉默效率为80%,丁氟螨酯的LC由干扰前的253.3mg/L显著下降至68.4mg/L。Tchr96的RNAi可使丁氟螨酯抗性倍数由87倍下降至43倍,表明Tchr96对朱砂叶螨丁氟螨酯抗性的形成至关重要。4.构建了p Cold II-Tchr96、p ET 28a-Tchr96、p ET 30a-Tchr96和p Cold SUMO-Tchr96等四个载体,原核表达结果显示Tchr96均以包涵体形式存在;随即采用稀释复性的方法,对p Cold II-Tchr96包涵体进行复性,最后成功获得了Tchr96的可溶性蛋白。5.采用DARTS方法,检测了Tchr96重组蛋白与丁氟螨酯和AB-1(丁氟螨酯在螨体内的活化产物)的结合能力(以甲氰菊酯为对照药剂),结果显示丁氟螨酯和AB-1处理均表现出明显的保护性条带,表明丁氟螨酯和AB-1都能够与Tchr96蛋白与结合。继而用微量热泳动(MST)方法测定出Tchr96与丁氟螨酯结合的Kd值为234μM,与AB-1结合的Kd值为130μM。6.结合RNAi及转录组测序技术,获得了3条Tchr96潜在调控的下游解毒酶基因:TcGSTd08、TcGSTm02和TcGSTm09。克隆获得了一条丁氟螨酯抗性基因TcGSTm02的启动子序列并预测到了两个潜在的核受体转录因子结合位点。借助荧光素酶报告基因系统研究了Tchr96对TcGSTm02基因启动子的调控作用,结果显示共转染Tchr96和TcGSTm02基因启动子后,荧光活性显著大于对照组(2.87倍),初步明确了Tchr96对TcGSTm02的调控作用。

关键词：朱砂叶螨丁氟螨酯 hr96 结合能力转录调控

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BR-C调控家蚕及果蝇变态发育期脂质合成的分子机制研究

BR-C调控家蚕及果蝇变态发育期脂质合成的分子机制研究

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作者：何雪川西南大学

学位级别：硕士

转录因子Broad Complex(BR-C)是蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)信号转导通路中关键的初级应答基因,在昆虫幼虫的蜕皮以及幼虫到蛹的转变过程中发挥重要作用。研究表明,BR-C通过介导20E信号来调控一系列次级应答基因以及靶基因的转录... 详细信息

转录因子Broad Complex(BR-C)是蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)信号转导通路中关键的初级应答基因,在昆虫幼虫的蜕皮以及幼虫到蛹的转变过程中发挥重要作用。研究表明,BR-C通过介导20E信号来调控一系列次级应答基因以及靶基因的转录,进而在昆虫的细胞凋亡、胚胎发育、原基发育、变态发育等多种生物学过程中发挥功能。在昆虫变态发育过程中,作为能量的脂质在幼虫取食生长期间合成,在蛹向成虫的转变过程中被分解利用。尽管BR-C在昆虫生长发育过程中所发挥的功能被广泛解析,但BR-C是否参与调控昆虫变态发育期脂质代谢过程还没有研究报道。因此,探究BR-C与昆虫变态发育期的脂质代谢之间的关系,无疑将有助于完善BR-C在昆虫变态发育期的功能,同时也为激素调控昆虫变态发育提供新思路。前期研究中,通过高通量的染色质免疫共沉淀测序(Ch IP-seq)已证实核受体基因hr96为BR-C的新靶标基因。hr96在昆虫异生物质代谢、脂质稳态等方面发挥核心作用。本研究中,我们以家蚕和果蝇为研究对象,利用瞬时RNAi(RNA interference)技术、遗传挽救实验、双荧光素酶报告基因实验、染色质免疫共沉淀-PCR(Ch IP-PCR)以及凝胶阻滞分析实验(EMSA)分别从分子、细胞、个体水平上探究了BR-C是否参与昆虫变态发育期的脂质代谢,并对其分子机制进行初步解析。所得到的主要研究结果如下:1.BR-C调控家蚕及果蝇变态发育期的脂质合成我们首先利用定量RT-PCR(RT-q PCR)实验对家蚕5龄初期幼虫到化蛹两天个体的脂肪体中的BR-C表达情况进行了检测,发现家蚕脂肪体中BR-C在5龄初期表达水平较低,随后逐渐升高,到上簇第2天(W2)达到最高,进入蛹期后又逐渐降低。基于RNAi技术原理,我们合成特异的BR-C双链RNA(doulble-stranded RNA,ds RNA),在5龄5天(L5D5)和刚上簇(W0)两个时期注射家蚕个体,实现对BR-C的干涉。RT-q PCR分析显示,与对照相比,BR-C ds RNA第二次注射24 h后,BR-C的表达水平显著下调,表明BR-C被成功干涉。进一步的脂滴染色结果显示,与对照相比,BR-C的RNAi导致脂肪体细胞中脂滴减少、脂质含量降低。同时,我们在果蝇脂肪体中对BR-C进行了特异性RNAi,结果显示产卵后120 h(120 h AEL)的幼虫脂肪体细胞中也出现脂滴减少、脂质含量降低的表型。这些结果表明,BR-C参与了家蚕及果蝇变态发育期的脂代谢。结合前期研究结果,我们进一步利用RT-q PCR分析了家蚕和果蝇BR-C的RNAi对蛹变态发育初期脂质合成酶基因表达的影响。结果表明,不论是在家蚕还是在果蝇中,与对照相比,BR-C的RNAi均导致脂肪体组织中脂质合成酶基因即长链酰基辅酶A合成酶(Acsl)和磷脂酸磷酸酶(Lipin)的表达水平均显著下调。这表明BR-C参与了家蚕及果蝇变态发育期的脂质合成过程。2.BR-C通过hr96调控家蚕及果蝇变态发育期的脂质合成鉴于核受体基因hr96为家蚕BR-C的新靶标基因,并且hr96在昆虫脂质稳态中发挥重要功能,我们推测BR-C可能通过调控hr96的转录来影响变态发育期的脂质合成。为证实此推测,我们首先利用RT-q PCR实验分析了BR-C RNAi个体中hr96的表达情况;结果显示,不管是在家蚕还是在果蝇中,BR-C RNAi个体脂肪体中的hr96的表达水平均显著下调,表明hr96表达确实受到BR-C的调控。接着我们同样利用RNAi技术合成特异的hr96ds RNA,并对上簇时期的家蚕进行hr96干涉。随后的RT-q PCR分析显示,与对照相比,干涉24 h后,hr96的表达水平显著下调,表明hr96被成功干涉;对家蚕脂肪体细胞进行脂滴染色观察,结果显示hr96 RNAi导致家蚕脂肪体细胞中脂滴减少、脂质含量降低。同时,我们在果蝇脂肪体中对hr96进行了特异性干涉;与家蚕结果类似,果蝇hr96的脂肪体特异RNAi同样导致脂滴减少、脂质含量降低。进一步的RT-q PCR分析结果显示,与对照相比,家蚕和果蝇hr96的RNAi均显著下调了脂肪体中脂质合成酶基因Acsl和Lipin的表达水平。我们进一步开展了个体水平的遗传挽救实验,即在果蝇脂肪体中特异性干涉BR-C的同时过表达hr96。脂肪体细胞脂滴染色观察结果显示,与对照相比,hr96过表达能够挽救由BR-C干涉所导致的脂肪体细胞中脂滴减少、脂质含量降低的表型。不仅如此,脂肪体中脂质合成酶基因Acsl和Lipin的表达水平也同样得到恢复。以上结果证明,BR-C通过影响hr96的转录表达来调控家蚕及果蝇变态发育期的脂质合成。3.家蚕hr96对脂质合成酶基因的转录调控鉴于hr96是一种具有转录调控功能的核受体,我们进一步探究了hr96是否能直接调控脂质合成酶基因的转录。首先,我们利用

关键词：变态发育 BR-C hr96 脂质合成转录调控

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