检索结果-南通市图书馆

卫生研究 2005年第5期34卷 549-553页

作者：杨丽琛李英华杨晓光朴建华吴永宁朱祯中国疾病预防控制中心营养与食品安全所北京100050 中国科学院遗传与发育研究所

目的针对抗虫转sck基因水稻中标记基因表达蛋白hpt的食用安全性开展初步研究,主要包括该蛋白在大米中的定性、定量研究、可能的膳食摄入量估计及其潜在致敏性评估等.方法将hpt的编码序列插入带有组氨酸标签(His-tag)的原核表达载体PBV22... 详细信息

目的针对抗虫转sck基因水稻中标记基因表达蛋白hpt的食用安全性开展初步研究,主要包括该蛋白在大米中的定性、定量研究、可能的膳食摄入量估计及其潜在致敏性评估等.方法将hpt的编码序列插入带有组氨酸标签(His-tag)的原核表达载体PBV222中进行融合表达,通过脲变性和镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白.用纯化后的6His-hpt蛋白免疫家兔和小鼠,分别制备相应的抗hpt多克隆和单克隆抗体,进一步将这两种抗体组成双抗夹心酶联免疫检测体系,用于检测hpt在转sck基因水稻中的表达水平.在致敏性评估方面,首先将hpt序列与已知的致敏原数据库进行比较,再利用模拟的胃肠液环境进行体外消化稳定性实验.结果重组体经表达纯化后获得了高纯度(95%)的6His-hpt融合蛋白,免疫动物后获得了高效价的抗hpt多克隆及单克隆抗体,经免疫印迹检测证明所制备的抗体可与转基因水稻中及纯化出的hpt蛋白形成特异结合带.由这两种抗体组成的双抗夹心酶联免疫检测体系用于检测hpt抗原时的灵敏度为30ng/ml,可检测出转sck基因水稻叶片中hpt蛋白的表达量约为80～150ng/ml;而在相应的转基因大米中未能检出.hpt序列经与已知的致敏原数据库进行比较未见同源性,但在体外消化稳定性实验中,hpt蛋白在模拟的胃肠液环境中均迅速降解.结论就目前的检测水平来看,转sck基因大米中所含的hpt蛋白水平极低,且对消化环境不稳定,推测该标记基因表达蛋白不易引起可观察到的食用安全性问题.但利用表达的hpt蛋白直接进行动物急性毒性及致敏性实验的工作仍有待进行,有关的结果将进一步报道.

关键词： hpt蛋白表达纯化抗体制备食用安全性检测

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转基因水稻中标记基因hpt表达行为的研究

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卫生研究 2005年第4期34卷 460-462页

作者：王锐陈松彪卓勤杨丽琛朱祯杨晓光中国疾病预防控制中心营养与食品安全所北京100050 中国科学院遗传与发育生物学研究所

目的探讨转sck基因水稻中标记基因hpt的表达行为。方法对经潮霉素抗性筛选的转基因水稻4个生长发育时期、不同组织的hpt基因进行PCR检测;提取4个生长发育时期PCR检测阳性植株的叶片总RNA,以hpt基因片断为探针进行Northernblot分析,并对... 详细信息

目的探讨转sck基因水稻中标记基因hpt的表达行为。方法对经潮霉素抗性筛选的转基因水稻4个生长发育时期、不同组织的hpt基因进行PCR检测;提取4个生长发育时期PCR检测阳性植株的叶片总RNA,以hpt基因片断为探针进行Northernblot分析,并对不同生长时期的叶片和成熟期的茎部、根部、种子进行双夹心ELISA检测,以同种非转基因水稻M86相应时期的相应部位作阴性对照。结果转基因水稻不同生长时期、不同组织中均能扩出特异的hpt(832bp)片段;Northernblot结果显示,在4个生长发育时期的hpt基因在转录水平均有表达,但是表达水平较低,且不同生长发育时期之间无明显差别;ELISA检测结果显示hpt蛋白在4个生长时期的叶片和成熟期的茎部和根部均有表达,种子中hpt蛋白的含量不超过负对照,不能被检测。结论不同生长发育时期的叶片中hpt基因在转录水平和翻译水平表达均能稳定表达。成熟的种子中不含有可检测水平的hpt蛋白。

关键词：表达特异性 hpt蛋白 hpt基因

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hpt-ELISA方法的建立及其在转基因水稻监测中的应用

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核农学报 2007年第2期21卷 168-172页

作者：汪海燕叶庆富浙江大学原子核农业科学研究所浙江杭州310029

本文改进了hpt-ELISA检测法，利用一种简便并且高效的微生物表达体系，将hpt基因的全编码序列克隆到原核表达质粒pGEX—KG上，在***菌株B121（DE3）-pLys中进行诱导表达，获得了融合蛋白GST—hpt，经Thrombin凝血酶酶切过夜，再经过柱... 详细信息

本文改进了hpt-ELISA检测法，利用一种简便并且高效的微生物表达体系，将hpt基因的全编码序列克隆到原核表达质粒pGEX—KG上，在***菌株B121（DE3）-pLys中进行诱导表达，获得了融合蛋白GST—hpt，经Thrombin凝血酶酶切过夜，再经过柱纯化后获得不合GST且具有生物活性的hpt纯蛋白，所得蛋白纯度〉90％。MALDI—TOF—MS分析表明，hpt蛋白分子量为39．4KD。用hpt纯蛋白免疫家兔，制备了高效价的多克隆抗体，进而构建了双抗夹心酶联免疫检测方法，其灵敏度为0．31ng／ml。应用该hpt—ELISA方法，测定了不同生育期转Bt基因水稻植株中hpt蛋白的表达水平以及成熟期稻米中的hpt蛋白含量。结果表明，不同生育期转Bt基因水稻植株中hpt蛋白的表达量约为15．67-60．12ng／g·FW，转Bt基因稻米中hpt蛋白的含量为5．28ng hpt／g·FW，而在非转基因亲本的植株和稻米中均未检测到hpt蛋白。

关键词： hpt蛋白表达纯化抗体制备酶联免疫分析转Bt基因水稻

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植物选择标记基因hpt在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定

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高技术通讯 2003年第6期13卷 30-36页

作者：杨丽琛常团结蔡华雅陈宛新杨晓光朱祯中国科学院遗传研究所植物遗传分子操作开放实验室北京100101 中国疾病预防控制中心营养与食品安全研究所卫生部微量元素营养重点实验室北京100050

为对hpt基因编码蛋白进行的安全性评价,建立一种简便、高效的体外微生物表达体系,以获得大量的hpt蛋白,将用于植物转化的hpt基因的全编码序列克隆到原核表达载体pGEX4T-3上,在*** BL21中进行诱导表达,所得融合蛋白主要以包涵体的形式存... 详细信息

为对hpt基因编码蛋白进行的安全性评价,建立一种简便、高效的体外微生物表达体系,以获得大量的hpt蛋白,将用于植物转化的hpt基因的全编码序列克隆到原核表达载体pGEX4T-3上,在*** BL21中进行诱导表达,所得融合蛋白主要以包涵体的形式存在,且与Glutathione Sephrose 4B纯化介质的结合率不高。后经优化诱导表达的各种条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,该蛋白具有明显的生物活性。经Glutathione Sephrose 4B亲和层析,所得蛋白纯度>95％。动物实验显示,融合蛋白还具有良好的免疫原性,免疫家兔后可诱导产生高滴度的抗体(>1:10000)。ELISA及Western blotting检测进一步证实了所获纯化蛋白及其抗体的特性。这为深入进行hpt蛋白的安全性评价打下了良好的基础。

关键词：植物选择标记基因大肠杆菌融合表达纯化生物活性 hpt蛋白包涵体可溶性免疫原性

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