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胆固醇在高脂高胆固醇诱导NASH发生发展过程中的动态作用研究

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胆固醇在高脂高胆固醇诱导NASH发生发展过程中的动态作用研究

作者：胡鑫丽山西医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨胆固醇在高脂高胆固醇诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发生发展过程中的动态作用。方法:动物水平:100只SD大鼠被随机分为正常饲料(CON)饲喂组、20%脂肪(HFC0)饲喂组、20%脂肪+1%胆固醇(HFC1)饲喂组、20%脂肪+2%胆固醇(HFC2)饲... 详细信息

目的:探讨胆固醇在高脂高胆固醇诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发生发展过程中的动态作用。方法:动物水平:100只SD大鼠被随机分为正常饲料(CON)饲喂组、20%脂肪(HFC0)饲喂组、20%脂肪+1%胆固醇(HFC1)饲喂组、20%脂肪+2%胆固醇(HFC2)饲喂组和20%脂肪+5%胆固醇(HFC5)饲喂组,每组20只。分别在饲喂第4周、第6周、第8周和第12周后,每组处死5只大鼠,收集其腹主动脉血浆和肝脏标本;细胞水平:将人源正常肝细胞(HL-7702)采用油酸(OA)和低密度脂蛋白-胆固醇(LDLC)诱导并随机分为CON组、OA组和OA+LDL-C组,细胞培养5天后构建NASH模型;收集的动物血浆和培养基用于检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性;收集动物肝脏和细胞后检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的含量;苏木素-伊红(HE)染色法用来观察肝脏的脂肪变性、气球样变性及炎症反应;马松(Masson)三色法染色观察肝脏的纤维组织沉积;肝细胞内脂滴的数量和大小、胆固醇的分布和含量分别用油红O(Oil red o)染色法和菲律宾菌素(Filipin)染色法观察;活性形式的固醇调节元件结合蛋白-2(n-SREBP-2)、低密度脂蛋白受体(LDLR)及3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(hmgcr)的表达用Western blot法检测。结果:动物水平:第12周后,HFC2组、HFC5组血浆ALT、AST和肝脏TC、TG含量较CON组明显升高(Phmgcr含量无明显差异,第8周末,与CON组相比,HFC5组hmgcr蛋白表达明显减少(Phmgcr含量明显增加(Phmgcr调控的内源性胆固醇的合成被抑制;(3)随着肝内胆固醇堆积增多,肝细胞LDLR表达减少,使肝内胆固醇相对不足,反馈性调节n-SREBP-2和hmgcr表达升高,从而使肝脏胆固醇代谢稳态被打破,促进了NASH的发生发展。

关键词：胆固醇非酒精性脂肪性肝炎 SREBP-2 hmgcr LDLR

基于生信分析的脂代谢相关分子在卵巢癌组织中的表达与铂耐药及预...

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作者：黄学瑶山东大学

学位级别：硕士

研究背景卵巢癌（Ovarian cancer,OC）是各类妇科恶性肿瘤中致死率最高的一种。尽管手术技术及辅助治疗不断改进,卵巢癌的预后依旧很差,五年生存率在49%左右。其原因主要在于卵巢癌确诊时多为晚期。OC患者治疗的一线方案为铂类药物为基... 详细信息

研究背景卵巢癌（Ovarian cancer,OC）是各类妇科恶性肿瘤中致死率最高的一种。尽管手术技术及辅助治疗不断改进,卵巢癌的预后依旧很差,五年生存率在49%左右。其原因主要在于卵巢癌确诊时多为晚期。OC患者治疗的一线方案为铂类药物为基础的化疗联合满意的肿瘤细胞减灭术。尽管60%-90%的卵巢癌患者对铂类药物反应良好,但患者的中位无进展生存期（Progression-free survival,PFS）仅为18个月,这很大程度上归因于铂耐药的发生。近年来研究发现铂耐药是多因素共同作用所致,包括肿瘤微环境的改变,DNA修复的增加,肿瘤干细胞的激活及代谢重编程等。研究发现,在快速生长的肿瘤细胞中可以观察到脂质摄取、储存和脂肪生成的增加。胆固醇（Cholesterol,CHO）是哺乳动物细胞膜的重要组成部分,在细胞周期的调节中起着重要作用。因此,大量的胆固醇是肿瘤快速生长所必需。多项研究表明胆固醇代谢在恶性肿瘤的进展和癌症患者的预后中起着重要的作用。胆固醇代谢重编程已被证明在多种恶性肿瘤中发挥重要作用,包括卵巢癌和乳腺癌。最近研究表明胆固醇代谢重编程可能与卵巢癌的化疗耐药相关。然而,胆固醇代谢途径重编程与铂耐药之间的具体机制尚不清楚。本研究应用Kaplan-Meier Plotter在线分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）和基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus datasets,GEO）数据,探究低密度脂蛋白受体（Low density lipoprotein receptor,LDLR）和三羟基三甲基辅酶 A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,hmgcr）的表达与卵巢癌患者PFS或再次进展生存期（Post-progression Survival,PPS）的关系。研究了两种胆固醇代谢相关蛋白,LDLR和hmgcr蛋白表达以及血浆低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL）和CHO与卵巢癌患者铂耐药及预后的关系。研究目的1.在线分析TCGA和GEO数据,探究LDLR和hmgcr的表达与患者PFS或PPS的关系。2.探究血液中LDL、CHO与卵巢癌患者耐药性的关系3.探究卵巢癌患者组织中LDLR及hmgcr蛋白表达及其与患者耐药性及预后的关系。研究方法1.探究LDLR和hmgcr与卵巢癌患者预后的关系。使用Kaplan-Meier Plotter网站在线分析TCGA和GEO数据,探究LDLR和hmgcr的表达与OC患者PFS或PPS的关系。2.临床资料收集与分析。回顾性研究1109例于2013年12月至2018年12月在山东大学齐鲁医院进行手术治疗的卵巢癌患者,收集患者术前术后及化疗前后的实验室检验结果（血脂谱、葡萄糖及CA125等）、病理资料、术后化疗方案及患者基础临床信息等（血脂谱数据通过自动生化分析仪获得,所有实验室检验均遵循山东大学实验室标准进行质量控制并报告）。筛选后得到卵巢癌铂耐药患者47例,铂敏感患者48例。患者术后生存及复发情况通过电话随访获得。分析上述数据与OC患者铂耐药及预后的关系。3.应用免疫组织化学染色方法检测LDLR和hmgcr在卵巢癌铂耐药及铂敏感组织中的表达及其与预后的关系。选取山东大学齐鲁医院病理科卵巢癌患者65例,应用免疫组织化学染色方法检测卵巢癌铂耐药及铂敏感组织中LDLR及hmgcr的表达差异性,并分析其与预后及铂耐药的关系。研究结果***和GEO数据库数据分析脂代谢相关分子LDLR和hmgcr与卵巢癌患者预后的关系利用在线生存分析网站对TGCA和GEO数据库进行了生存分析,确定LDLR和hmgcr基因表达与患者预后的关系。在GEO数据库中,我们选择了两个患者数量较多的使用铂类化疗的卵巢癌患者数据集GSE14764和GSE26193进行生存分析。在TCGA数据库中,表达高水平LDLR的卵巢癌患者预后较差,而hmgcr的高表达与较好的预后相关。对GEO数据库数据进行分析后我们得到了相同的结果,表达高水平LDLR和低水平hmgcr的卵巢癌患者预后较差（P＜0.05）。2.卵巢癌患者临床资料分析2.1患者基本特征我们共筛查了 1109名卵巢癌患者,最后纳入研究为65名患者。根据患者对铂类化疗药物的反应分为两组,卵巢癌铂敏感组31例,铂耐药组34例。铂耐药组患者平均诊断年龄为53.6±8.79岁,铂敏感组患者为55.9±10.72岁。铂敏感组患者平均初潮年龄为15.93±2.97岁,铂耐药组患者为14.02±4.11岁,两组间具有显著统计学差异（P=0.013）。铂敏感组87.1%（27/31）及铂耐药组82.4%（28/34）的患者分期为FIG

关键词： LDLR hmgcr 卵巢癌铂耐药胆固醇代谢

海洋真菌Stachybotrys longispora FG216代谢纤溶活性化合物FGFC1的生源合成途径研究

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海洋真菌Stachybotrys longispora FG216代谢纤溶活性化合物FGFC1...

作者：曹玉陵上海海洋大学

学位级别：硕士

海洋真菌可以分离得到结构新颖的化合物,主要包括聚酮类、生物碱类、肽类、萜类、甾体类、内酯类等,有抗肿瘤、溶解血栓、抗菌等生物活性,有发现创新药物的价值。基于丝状真菌Stachybotrys longispora FG216代谢纤溶活性化合物FGFC1以及... 详细信息

海洋真菌可以分离得到结构新颖的化合物,主要包括聚酮类、生物碱类、肽类、萜类、甾体类、内酯类等,有抗肿瘤、溶解血栓、抗菌等生物活性,有发现创新药物的价值。基于丝状真菌Stachybotrys longispora FG216代谢纤溶活性化合物FGFC1以及Stachybotrys产出多种活性化合物的研究基础,为了探索稀有菌株Stachybotrys longispora FG216的生物学特性以及物种同源信息,进行基因生物信息学分析和生物活性化合物代谢途径的生物信息学分析,获得基因组学相关信息、挖掘FGFC1代谢相关基因和调控生物活性化合物产量。采用de novo测序技术分析Stachybotrys longispora FG216基因组部分序列,基于基因组学组装分析得到605条基因组序列,总碱基长度为45 622 830 bp,基因组覆盖度为100%,平均覆盖深度为48.87,不存在GC偏向性,组装结果已提交至国家微生物科学数据中心编号为NMDC60016264。预测得到13 329条编码基因,占基因组组装总碱基数目的46.58%,共检测到169条nc RNA。KEGG数据库注释8 422个基因富集在379代谢通路中,KOG进行注释匹配到8 460条基因序列,共有7 714个基因成功获得GO功能注释,CAZy注释共有2 847个基因匹配到与碳水化合物功能相关的酶。基因组数据对比显示Stachybotrys longispora FG216拥有最少的Scaffolds为605,和最多的CDS以及最长的碱基长度45.6 Mb。Stachybotrys的核心基因共有7325个基因家族占基因家族总数目的比列为71.44%,发现4个与黄曲霉毒素生物合成过程相关的功能基因。Stachybotrys longispora FG216的独有基因有448个,其中发现4个吲哚乙酰胺水解酶活性相关的功能基因。基因组间重叠簇热图显示Stachybotrys longispora FG216与Stachybotrys chlorohalonata IBT 40285基因组的相似性最高。antiSMASH软件预测Stachybotrys longispora FG216基因组共得到101个基因簇,匹配到18个已知化合物,其中Cluster 57可以编码异吲哚啉酮的合成。蛋白互作网络图显示TRP1、TRP和COQ1属于核心蛋白。PCR扩增出Sl hmgcr(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase)基因片段,长度为3 556 bp编码1185个氨基酸,预测分子量为127.95 k Da,等电点为7.38,属于疏水性膜蛋白,具有高度的功能保守性,属于Ⅰ类hmgcr家族,包含两个NADP(H)结合区域和一个HMG-Co A结合区域。鸟氨酸可以显著性的增加菌体的生长水平,同时菌丝体形成明显紧实交联的球状结构,菌丝系成簇状,较为发达。鸟氨酸可以刺激Stachybotrys longispora FG216胞内小分子蛋白的表达,相应提高蛋白丰度;显著提高Sl hmgcr基因表达水平。结果显示Lovastatin抑制菌体生长量具有浓度依赖关系,随着浓度的增高抑制效果增强,是Stachybotrys longispora FG216生长的特异抑制剂。Lovastatin 100μM和200μM处理组的菌丝体形成类似于海绵变成松散的不规则状,菌丝系也呈松散分布;Lovastatin 100μM没有体现出FGFC1产量抑制效果,而Lovastatin 50μM处理对FGFC1的产量展示出最高的抑制性;Lovastatin对沉默蛋白的表达没有表现出促进作用;Lovastatin 100μM处理组起到提高Sl hmgcr基因表达水平的作用,其他浓度组均表现出抑制效果,Lovastatin 200μM有着非常显著的抑制效果。结合真菌复杂的生物体系和多样的次级代谢途径,通过以上结果可以得到外源物质的加入可以通过影响菌体生长水平、菌体形态变化、沉默蛋白表达、次级Sl hmgcr的表达水平进而作用于最终产物FGFC1的合成。通过对甲羟戊酸途径限速酶hmgcr进行Lovastatin特异性抑制剂处理,结果显示对最终产物FGFC1有显著性抑制效果。由此可以得出FGFC1由甲羟戊酸途径合成并被hmgcr蛋白酶调控。

关键词： Stachybotrys longispora FG216 de novo测序比较基因组学次生代谢 hmgcr

氧化鱼油、丙二醛对草鱼(Ctenopharyngodon idellus）肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢的影响

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氧化鱼油、丙二醛对草鱼(Ctenopharyngodon idellus）肝胰脏、肠...

作者：黄雨薇苏州大学

学位级别：硕士

第一章草鱼(Ctenopharyngodon idellus)hmgcr基因的全长克隆、生物信息学分析及组织表达分析3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl Co A reductase,hmgcr)是内源性胆固醇合成的关键限速酶,在维持胆固醇稳态方面... 详细信息

第一章草鱼(Ctenopharyngodon idellus)hmgcr基因的全长克隆、生物信息学分析及组织表达分析3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl Co A reductase,hmgcr)是内源性胆固醇合成的关键限速酶,在维持胆固醇稳态方面具有重要作用。本实验利用c DNA末端快速扩增(RACE)法获得了草鱼hmgcr基因的c DNA全序列。hmgcr全长3594bp,5’端非编码区(5’-UTR)长77bp,3’端非编码区(3’-UTR)长988bp,开放阅读框(ORF)为2529bp,编码842个氨基酸组成的多肽链,分子量91.48k D,理论等电点6.27。草鱼hmgcr蛋白包括两个结构域:氨基端复杂的复杂的跨膜区域(Asp62-Leu219)和羧基端细胞溶质催化区域(Asn419-Arg826),这两个序列通过一个可变的亲水接头序列(Val220-Ser418)连接起来,存在一个磷酸化位点(Ser827)和一个催化活性位点(His821),前39个氨基酸残基(Met1-Ala39)为信号肽。由氨基酸同源性分析和进化分析可知,草鱼hmgcr与斑马鱼、丽脂鲤等鲤科鱼类的进化关系较近,与斑马鱼的同源性最高(89%)。通过组织表达分析表明,草鱼hmgcr在被检测的7个组织中都有表达,其中在肝胰脏中的表达量最高,其次为肌肉、肾脏和心脏。研究结果为进一步开展对草鱼hmgcr调控胆固醇代谢的分子机制研究提供了理论依据。第二章草鱼(Ctenopharyngodon idellus)CYP7A1基因的全长克隆、生物信息学分析及组织表达分析胆固醇7α羟化酶(cholesteral 7αhydroxylase,CYP7A1)是胆汁酸经典合成途径的关键限速酶,在维持胆汁酸稳态方面具有重要作用。本实验利用c DNA末端快速扩增(RACE)法获得了草鱼CYP7A1基因的c DNA全序列。CYP7A1全长1771bp,5’端非编码区(5’-UTR)长22bp,3’端非编码区(3’-UTR)长219bp,开放阅读框(ORF)为1530bp,编码509个氨基酸组成的多肽链。分子量57.74k D,理论等电点6.54。草鱼CYP7A1蛋白包括两个结构域:包含跨膜螺旋(Leu5-Leu22)的氨基端和包含保守核心序列的羧基端,其中氨基端疏水性强,保守性弱,而羧基端的半胱氨酸在这些物种中高度保守,前24个氨基酸(Met1-Ser24)为信号肽。由氨基酸同源性分析和进化分析可知,草鱼CYP7A1与斑马鱼、丽脂鲤等鲤科鱼类的进化关系较近,与斑马鱼的同源性最高(80%)。通过组织表达分析表明,草鱼CYP7A1在肝胰脏中的表达量最高,其次为肾脏,在其他组织的表达量很少。研究结果为进一步开展对草鱼CYP7A1调控胆固醇代谢的分子机制研究提供了理论依据。第三章氧化鱼油对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢相关酶基因表达的影响为了研究氧化鱼油对草鱼肝胰脏、肠道胆固醇、胆汁酸合成代谢的影响。以豆油、鱼油、氧化鱼油作为饲料脂肪源,分别设计鱼油组(6F)、豆油组(6S)、2%氧化鱼油(2OF)、4%氧化鱼油(4OF)及6%氧化鱼油(6OF)5组等氮、等能半纯化饲料,在池塘网箱养殖平均体重为(74.8士1.2)g草鱼72天。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)的方法,测定了草鱼肝胰脏、肠道组织中四种胆固醇合成相关酶hmgcr、SREBP2、CETP、ABCA1和胆汁酸合成关键酶CYP7A1的基因表达活性,结合血清、肝胰脏和肠道TC、TBA含量分析了胆固醇、胆汁酸的合成强度的变化。结果显示:(1)添加氧化鱼油后,草鱼肝胰脏hmgcr基因表达活性显著上调(Phmgcr基因表达活性显著上调(P<0.05),CYP7A1基因表达活性显著下调(P<0.05),肠道TC含量显著增加(P<0.05),而TBA含量显著减少(P<0.05);(3)添加鱼油或氧化鱼油后,饲料∑PUFA含量与肝胰脏ABCA1基因表达活性呈显著正相关关系(P<0.05),饲料MDA含量与肠道ABCA1基因表达活性呈显著负相关关系(P<0.05)。结果表明,随着饲料氧化鱼油添加量的增加,在饲料∑PUFA含量减少和鱼油氧化产物MDA含量增加的交互影响下,肝胰脏和肠道细胞胆固醇合成能力、向细胞内转运胆固醇的能力增强,向细胞外转运胆固醇的能力、以胆固醇为原料合成胆汁酸的能力减弱,致使肝胰脏、肠道、血清胆固醇含量增加、而血清、肠道胆汁酸含量减少。肝胰脏

关键词：草鱼 hmgcr CYP7A1 胆固醇胆汁酸

石榴皮多酚对肝细胞胆固醇合成影响及其分子机制研究

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石榴皮多酚对肝细胞胆固醇合成影响及其分子机制研究

作者：马倩倩陕西师范大学

学位级别：硕士

石榴皮多酚是石榴中重要的生理活性成分,具有抗氧化、抗癌、抗菌、降血脂等多种生物学功能。本文以石榴鞣花酸、安石榴苷和石榴皮多酚纯化物为受试物,利用体外培养成人正常肝细胞L-02为研究对象,采用油红O染色观察肝细胞内脂滴情况,qRT-... 详细信息

石榴皮多酚是石榴中重要的生理活性成分,具有抗氧化、抗癌、抗菌、降血脂等多种生物学功能。本文以石榴鞣花酸、安石榴苷和石榴皮多酚纯化物为受试物,利用体外培养成人正常肝细胞L-02为研究对象,采用油红O染色观察肝细胞内脂滴情况,qRT-PCR检测分析对肝细胞胆固醇合成相关基因hmgcr mRNA、SE mRNA、LDLR mRNA和SREBP-2mRNA的表达水平的作用影响,探究石榴皮多酚及其主要成分对肝细胞胆固醇合成影响及其分子机制。主要研究成果如下：（1）建立了脂肪变性肝细胞模型：通过油红O染色法定性观察脂滴形成、试剂盒测定上清液中肝脂酶变化,结果表明,采用造模培养液对成人肝细胞L-02孵育48h,能够成功构建脂肪变性肝细胞模型,细胞内脂滴数量显著增加,细胞培养液内转氨酶活性升高。（2）采用MTT法确定了石榴皮多酚对治疗和预防作用的适宜浓度范围为0～100μg/mL。（3）初步确定了石榴皮多酚对胆固醇合成的作用影响及其分子机制： ①石榴鞣花酸、安石榴苷、石榴皮多酚纯化物均能减少细胞内脂滴形成。对比石榴皮多酚治疗组和预防组结果显示,预防组肝细胞内脂滴数量要比治疗组少一些,说明石榴皮多酚在降胆固醇作用方面预防效果更佳。 ②实时荧光定量结果表明,与正常组比较,石榴皮多酚三种受试物均可使胆固醇合成关键酶hmgcr和SE基因表达调控至较低水平,对LDLR mRNA和SREBP-2mRNA表达则有明显的上调作用。治疗组中,对hmgcr mRNA的表达水平调控作用的强弱依次为安石榴苷＞石榴皮多酚纯化物＞石榴鞣花酸,对SE mRNA的表达水平调控作用的强弱依次为石榴皮多酚纯化物＞安石榴苷＞石榴鞣花酸;对LDLR mRNA和SREBP-2mRNA表达水平上调的作用强弱依次为石榴鞣花酸＞石榴皮多酚纯化物＞安石榴苷。预防组中,石榴皮多酚对胆固醇关键限速酶hmgcr mRNA和SE mRNA表达调控作用强弱依次为：石榴鞣花酸＞石榴皮多酚纯化物＞安石榴苷;石榴皮多酚对LDLR mRNA和SREBP-2mRNA表达调控作用强弱依次为石榴鞣花酸＞石榴皮多酚纯化物＞安石榴苷。说明三种石榴皮多酚受试物,均可调控胆固醇合成关键酶调节至比正常组较低表达水平,从而降低肝细胞内胆固醇合成,同时,可上调肝细胞LDLR基因及其上游基因SREBP-2,从而提高肝细胞对胆固醇的内吞清除能力。总体上,预防组对肝细胞胆固醇合成及清除的调控作用优于治疗组。

关键词：石榴鞣花酸石榴皮多酚安石榴苷胆固醇 hmgcr SE LDLR SREBP-2

猪血脂性状与胴体品质候选基因表达、多态检测及其相关性分析

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猪血脂性状与胴体品质候选基因表达、多态检测及其相关性分析

作者：张梦琦安徽农业大学

学位级别：硕士

本研究选用美系大白猪和安徽地方猪种圩猪作为瘦肉型和脂肪型猪对照对比模型,研究对比猪种间血脂性状、胴体和肉质性状的差异;选取血液胆固醇代谢途径中重要的功能基因:载脂蛋白(APOE)基因、胆固醇酯转运蛋白(CETP)基因和3-羟基-3-甲基... 详细信息

本研究选用美系大白猪和安徽地方猪种圩猪作为瘦肉型和脂肪型猪对照对比模型,研究对比猪种间血脂性状、胴体和肉质性状的差异;选取血液胆固醇代谢途径中重要的功能基因:载脂蛋白(APOE)基因、胆固醇酯转运蛋白(CETP)基因和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(hmgcr)基因为候选基因,采用PCR-SSCP技术检测APOE、CETP和hmgcr基因部分区段的遗传变异,运用SPSS软件最小二乘分析法检测该遗传变异与血脂性状的相关性,检测突变位点对候选基因在肌肉和肝脏组织表达的遗传效应;并运用SPSS软件GLM程序比较分析肝脏和背最长肌APOE、CETP和hmgcr mRNA的表达水平与猪胴体、肉质性状的相关性。以期筛选出重要的功能性多态位点作为新的遗传分子标记,以探讨利用该候选基因作为分子标记运用于猪遗传育种的可行性,为安徽地方猪种血脂及肉质性状的遗传改良提供科学根据。实验结果如下:(1)圩猪和大白猪的血脂、胴体、肉质性状的比较中,TC、TG、HDL-C、LDL-C、背膘厚、背最长肌肌肉胆固醇含量、IMF、肌内脂肪酸中硬脂酸含量均极显著高于大白猪(Phmgcr基因在心脏等不同组织中均有不同程度的表达,其中肝脏表达量最高,且背最长肌和背脂中均有较高程度的表达。(3)圩猪、安庆六白和大白猪APOE基因上没有检测到突变;圩猪、安庆六白和大白猪CETP基因第1内含子853碱基处发生G→T的突变位点(g.853 G>T),在858碱基处存在T→C的突变位点(g.858 T>C);圩猪、安庆六白和大白猪hmgcr基因在第1内含子6380碱基处存在A→C的突变位点(g.6380 A>C);在第4内含子8409碱基处存在A→G的突变位点(g.8409 A>G);在第11外显子14295碱基处存在T→C的错义突变位点(g.14295 T>C),该核苷酸位点的突变引起氨基酸从甲硫氨酸转变为苏氨酸;在第18内含子20060碱基处存在C→T的突变位点(g.20060 C>T);在第19外显子20529碱基处存在G→A的同义突变位点(g.20529 G>A)。通过酶切还发现在第9外显子上存在A→G的同义突变位点(c.807A>G)。圩猪和大白猪中CETP基因两个突变位点的不同基因型个体中,TC、HDL-C和LDL-C含量差异显著,TG含量差异不显著;圩猪和大白猪中hmgcr基因上3个外显子和1个内含子突变位点的不同基因型个体中,TC、HDL-C和LDL-C含量差异显著,TG含量差异不显著。且hmgcr基因mRNA在c.807A>G不同基因型个体上的肝脏和肌肉表达也差异显著。(4)圩猪肝脏APOE、CETP mRNA表达量与背膘厚显著负相关,CETP mRNA表达量与背最长肌肌肉脂肪酸中的硬脂酸含量显著正相关,hmgcr基因表达与背膘厚显著正相关,与肌肉脂肪酸中的硬脂酸含量呈显著负相关;圩猪背最长肌APOE、CETP、hmgcr mRNA表达量与背膘厚、肌肉胆固醇、肌内脂肪、肌内脂肪酸中的十六碳烯酸和油酸含量呈显著正相关,与肌肉脂肪酸中的硬脂酸和亚油酸含量呈显著负相关。以上结果提示:猪血脂代谢与体内脂肪沉积密切相关,猪血脂性状的高低影响到肌内脂肪含量及其脂肪酸、胆固醇组成,对猪肉品质的形成至关重要。CETP基因g.853G>T和g.858 T>C可以作为猪血脂性状候选基因遗传标记;hmgcr基因g.14295 T>C、g.20060 C>T、g.20529 G>A和c.807A>G可以作为猪血脂性状候选基因遗传标记。猪血脂代谢候选功能基因可能在血脂性状和胴体、肉质性状相互影响的形成过程中发挥重要作用。

关键词：猪血脂性状胴体品质 APOE CETP hmgcr

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Ufd1增强泛素连接酶gp78活性的研究

Ufd1增强泛素连接酶gp78活性的研究

作者：王江兰州大学

学位级别：硕士

胆固醇是哺乳动物细胞中含量最丰富的甾醇分子，其主要功能是调节质膜的流动性和相变。正常生理条件下，细胞中的胆固醇浓度被维持在比较稳定的水平。胆固醇水平过高经常会引发多种疾病，如动脉粥样硬化、胆结石、冠心病等。因此，生物... 详细信息

胆固醇是哺乳动物细胞中含量最丰富的甾醇分子，其主要功能是调节质膜的流动性和相变。正常生理条件下，细胞中的胆固醇浓度被维持在比较稳定的水平。胆固醇水平过高经常会引发多种疾病，如动脉粥样硬化、胆结石、冠心病等。因此，生物体为维持其正常的生命活动而发展出一套精细的调控机制以维持胆固醇的代谢平衡。胆固醇的起始性合成途径是其代谢的重要组成，该途径受细胞中胆固醇的负反馈调控。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(hmgcr)催化HMGCoA生成甲羟戊酸(Mevalonate)，是胆固醇合成途径中关键的限速步骤，它在转录和蛋白水平受甾醇的负反馈调控，其中甾醇促进的hmgcr的蛋白酶体降解是胆固醇合成途径关键的反馈调控步骤。前期研究发现，gp78是hmgcr降解过程中特异的泛素连接酶，它与内质网膜蛋白Insig形成复合物。胆固醇合成前体分子羊毛脂固醇(Lanosterol)能够直接促进hmgcr与Insig-gp78相结合，从而gp78催化hmgcr泛素化，然后hmgcr通过内质网相关蛋白降解(ER-associated protein degradation，ERAD)途径被迅速降解。为深入探索gp78介导的hmgcr蛋白降解的分子机制，我们采用免疫共沉淀结合质谱分析，发现Ufd1是gp78的结合蛋白，并用免疫共沉淀鉴定了它们的结合位点，体外GSTPull-down实验证明二者直接相互作用。进一步研究发现，Ufd1通过直接结合gp78而增强后者的泛素连接酶活性，加速hmgcr的泛素化修饰和蛋白降解。同时还发现Ufd1对gp78泛素连接酶活性的增强作用依赖于它与泛素单体的结合。Ufd1还可以与泛素多聚体结合并参与hmgcr泛素化修饰后的降解过程。本研究工作揭示了Ufd1在甾醇促进的hmgcr的降解过程中能够行使双重功能，并且它能够作为gp78的辅助因子而在内质网相关蛋白降解和胆固醇代谢平衡调控过程中发挥重要的作用。

关键词： hmgcr Ufd1 gp78 ERAD 泛素—蛋白酶体泛素连接酶 E3 胆固醇

胆酸衍生物的设计、合成及其促HMG-CoA还原酶降解的活性研究

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胆酸衍生物的设计、合成及其促HMG-CoA还原酶降解的活性研究

作者：江倩茹华东师范大学

学位级别：硕士

心血管疾病是目前发病率非常高的一类疾病。血液中的胆固醇含量过高,是其最主要的发病因素之一,目前他汀类药物是临床用于降低体内胆固醇水平的一线药物。HMG-Co A还原酶(hmgcr)是体内胆固醇合成的关键酶,他汀类药物是该酶的抑制剂,但... 详细信息

心血管疾病是目前发病率非常高的一类疾病。血液中的胆固醇含量过高,是其最主要的发病因素之一,目前他汀类药物是临床用于降低体内胆固醇水平的一线药物。HMG-Co A还原酶(hmgcr)是体内胆固醇合成的关键酶,他汀类药物是该酶的抑制剂,但是长期服用该类药物会导致hmgcr代偿性高表达,从而导致其效果不断减弱,如若增加药物使用剂量,则会导致更明显的毒副作用。课题组前期研究已经发现活性优良的促hmgcr降解剂,但在生物活性测试过程中发现该类化合物会导致胆固醇在细胞内聚集,影响神经细胞的存活,进而引发严重的神经退行性疾病,另一方面还会导致脂类物质在肝脏、肾脏、脾脏和脑部的过量堆积,造成器官病变,并可能致死。因此针对性的开发新的、不会导致胆固醇在细胞内聚集的hmgcr降解剂,对新药研发具有重要的意义。本论文以双降醇BA为起始原料,通过4,4-二甲基化、Wittig-Horner反应得到基础母核,然后再进行结构的改造与修饰得到新型甾体类化合物;同时对该类化合物进行细胞水平促hmgcr降解活性、细胞内胆固醇聚集等生物测试,筛选出生物活性最佳的结构。在对A环进行并杂环修饰中,我们得到包括噻唑、吡唑、噁唑、嘧啶、吡嗪等系列杂环衍生物,在生物测试中发现乙酰化的吡唑是最佳并杂环修饰基团。在对D环侧链进行结构改造中,我们引入羧基、酰胺等不同取代基,发现当侧链引入吗啉酰胺时,生物活性最佳;同时我们对侧链长度也进行了筛选,发现侧链为4个碳链长度时,相应化合物生物活性最佳。经过结构的不断优化,本论文筛选出促hmgcr降解活性最佳的候选化合物B1(EC=0.22μM),并且该化合物完全不会导致细胞内胆固醇聚集,具有良好的开发前景。

关键词：胆固醇 hmgcr 泛素化降解结构优化动脉粥样硬化

浒苔多糖提取技术和分离纯化条件以及调节血脂作用研究

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浒苔多糖提取技术和分离纯化条件以及调节血脂作用研究

作者：黄斌福建医科大学

学位级别：硕士

目的：研究浒苔多糖(enteromorpha polysaccharide EP）的分离纯化条件和结构特点;比较不同提取方法对浒苔多糖得率及活性基团的影响;研究不同提取方法得到的浒苔多糖（EP）调节血脂及抗脂质过氧化作用，并探讨其可能机制。方法： 1... 详细信息

目的：研究浒苔多糖(enteromorpha polysaccharide EP）的分离纯化条件和结构特点;比较不同提取方法对浒苔多糖得率及活性基团的影响;研究不同提取方法得到的浒苔多糖（EP）调节血脂及抗脂质过氧化作用，并探讨其可能机制。方法： 1、以福建地区所产的浒苔为研究对象，用分光光度法，比较热水提取、超声波提取、微波提取、酶法提取以及联合不同方法提取对浒苔多糖得率及多糖中糖醛酸和硫酸根含量。 2、采用二乙氨基乙基纤维素（DEAE-cellulose）和Sephadex-100凝胶分离纯化浒苔多糖，用红外线光谱分析结构，用气相色谱分析单糖组成。 3、高脂饲料喂养，建立高血脂大鼠模型，分别采用酶法提取的EP和超声波提取的EP干预40天，检测血脂水平和抗氧化指标;HE染色观察肝脏结构;逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)测定肝脏组织中的卵磷脂胆固醇酰基转移酶（Lact）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（hmgcr）和三磷酸腺苷结合盒A1（AbcA1）mRNA的表达水平。结果： 1、浒苔多糖提取方法比较在单一的提取方法，以酶法的EP提取量较高。联合两种方法的提取量较单一方法高，联合三种方法的提取量较两种方法高。但是不能增加单位多糖中糖醛酸和硫酸根的提取量。 2、浒苔多糖的分离纯化条件和结构特点提取的浒苔多糖，经DEAE纤维素分离得到4个组分，分别为EP1、EP2、EP3、EP4，其中EP2占所回收多糖的比例达81%，EP2经Sephadex-100分离，时呈现单一对称峰。红外线光谱分析显示，EP2为糖类化合物，且有硫酸酯结构;经气相色谱检测显示，EP2由鼠李糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、岩藻糖、甘露糖和半乳糖组成，各种单糖的比例为5.12：1.32：3.38：1.62：1：1.03。 3、调节血脂及抗脂质过氧化作用结果。 3、1血脂指标与空白组（BCG）比较，模型组（MG）血清TC、TG、LDL-C较低，HDL较高，差异具有统计学意义(P＜0.05);与MG比较酶提取高剂量组（EHEP）、酶提取中剂量组（EMEP）、酶提取低剂量组（ELEP）、超声波提取高剂量组（UMEP）、超声波提取低剂量组（ULEP）的TC、TG较低，差异有统计学意义(P＜0.05)。在TC指标上ELEP比ULEP低，EMEP比UMEP低，EHEP比UHEP低，差异无统计学意义（P＞0.05）;在TG指标上ELEP比ULEP低，EMEP比UMEP高，EHEP比超声波提取高剂量组（UHEP）低，差异无统计学意义（P＞0.05）;ULEP和ELEP的HDL同MG相比较高，差异具有统计学意义（P＜0.05）;同阳性对照组比较，干预组的TG较阳性组（CG）更低，差异有统计学意义(P＜0.05)。 3、2抗氧化指标与空白组（BCG）比较，MG的SOD、 GSH-Px较低，差异有统计学意义（P＜0.05）;EHEP、EMEP、ELEP、UHEP、UMEP、ULEP和CG的SOD较MG高，差异有统计学意义(P＜0.05);EHEP、EMEP、ELEP、UHEP、UMEP、ULEP的GSH-Px较MG高，差异有统计学意义（P＜0.05），在SOD指标上上ELEP比ULEP高，EMEP比UMEP高，EHEP比UHEP高，差异无统计学意义。在GSH-PX指标上ELEP比ULEP低，EMEP比UMEP低，EHEP比UHEP低，差异无统计学意义。 3、3病理指标大鼠肝脏切片显示空白组肝细胞及结构正常;模型组脂肪肝症状明显;阳性对照组及各个浒苔多糖的处理组脂肪肝病理症状较模型组有所减轻，其中CG和酶与超声波提取的EP的中、低剂量组效果较好。两种EP多糖在相同剂量时对高血脂减缓程度的效果相近。 3、4肝脏LactｍRNA、Hmgar和AbcA1mRNA的表达与模型组比较，EHEP组肝脏LactｍRNA的表达量较高，差异有统计学意义;其他剂量组同模型组间无显著性差异，但阳性对照组较模型组有明显升高的趋势，在相同剂量组上，酶提取EP组的表达量要高于超声波提取EP组。各个剂量组Hmgar的表达方面在统计学上无显著性差异,但各个干预组Hmgar的表达较其他组有明显升高的趋势，高剂量和低剂量的酶处理组hmgcr基因表达趋势上要高于超声波处理组，中剂量的酶处理组基因表达趋势上要低于超声波EP组。AbcA1mRNA的表达在各个处理中之间无显著性差异。结论： 1.不同提取方法联合采用能增加EP的提取量，不同的提取方法对EP的活性基团有影响。 ***的主成分为EP2，EP2是一种含有硫酸酯的复合多糖。 3. EP具有调节血脂代谢作用 3.1两种浒苔多糖均能够调节高血脂大鼠体内血脂的代谢，提高大鼠机体抗氧化应激的能力，能修复受损肝细胞，起到减轻脂肪肝的作用。 3.2浒苔多糖能够

关键词：浒苔多糖分离纯化红外线光谱气相色谱降血脂抗氧化 Lact hmgcr AbcA1