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中国人hla-g1的cDNA克隆、序列分析、表达和蛋白质空间结构预测

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北京大学学报（自然科学版） 2002年第2期38卷 212-220页

作者：周建军曲宏吴才宏韩卫东李志伟丰美福北京大学生命科学学院北京100871 301医院血液科北京100853 内蒙古大学生命科学学院呼和浩特010021 中国科学院动物研究所北京100080

从中国人外周血单个核细胞、胎盘组织和肝癌组织等样品中克隆了包含完整hla g1读框的cDNA ;与国外同行获得的该基因及其蛋白质序列比较分析表明 ,该基因虽然有着细微的种族特异性 ,但高度保守 ;并获得了它的截断型重组蛋白 ,根据蛋白一... 详细信息

从中国人外周血单个核细胞、胎盘组织和肝癌组织等样品中克隆了包含完整hla g1读框的cDNA ;与国外同行获得的该基因及其蛋白质序列比较分析表明 ,该基因虽然有着细微的种族特异性 ,但高度保守 ;并获得了它的截断型重组蛋白 ,根据蛋白一级结构和同源比较方法 ,模建了它及其与特异性受体KIR2DL4形成复合体的空间结构模拟。

关键词： hla-g1 免疫耐受 cDNA克隆序列分析基因表达空间结构相互作用蛋白质中国人

膜表达的hla-g1对同种反应性PBMC分泌Th1/Th2型细胞因子的影响

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免疫学杂志 2005年第4期21卷 300-302页

作者：杨惠军吴雄文张彩娥梁智辉韩军艳黄亚非龚非力湖南师范大学医学院微生物与免疫学教研室长沙410006 华中科技大学同济医学院免疫学教研室武汉430030

目的研究人脐静脉内皮细胞系(ECV304)表达的hla-g1对同种异体外周血单个核细胞(PBMC)Th1/Th2型细胞因子分泌的影响。方法采用脂质体介导的基因转染技术将pcDNA3-hla-g1转入ECV304,以间接免疫荧光技术在蛋白质水平上检测hla-g1分子在ECV... 详细信息

目的研究人脐静脉内皮细胞系(ECV304)表达的hla-g1对同种异体外周血单个核细胞(PBMC)Th1/Th2型细胞因子分泌的影响。方法采用脂质体介导的基因转染技术将pcDNA3-hla-g1转入ECV304,以间接免疫荧光技术在蛋白质水平上检测hla-g1分子在ECV304上的表达;以表达hla-g1的ECV304作为刺激细胞,灭活后,与健康人PBMC共同培养,用ELISA检测上清液中Th1/Th2型细胞因子的浓度,观察hla-g1对同种异体抗原激活的PBMC分泌Th1/Th2型细胞因子的影响。结果与转染pcDNA3空质粒的对照组相比,hla-g1能使PBMC的IL-10分泌增加(Phla-g1能引起由同种异体抗原激活的PBMC分泌IL-10增加,提示hla-g1有可能使Th1/Th2型细胞因子向Th2型偏移。

关键词： hla-g1 ECV304 Th1/Th2型细胞因子同种移植免疫耐受

重组hla-g1基因的克隆、原核表达、纯化及功能的初步研究

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重组HLA-G1基因的克隆、原核表达、纯化及功能的初步研究

作者：张海泉中国农业大学

学位级别：硕士

hla-g是一种非经典的hla-Ⅰ类分子,与人类免疫耐受有关。诱导对移植抗原的免疫耐受是使移植物获得长期存活的关键。人类和哺乳动物的妊娠过程是自然界中存在的一种天然的同种半异体免疫耐受模型。在母胎界面的细胞滋养层上高表达的hla-... 详细信息

hla-g是一种非经典的hla-Ⅰ类分子,与人类免疫耐受有关。诱导对移植抗原的免疫耐受是使移植物获得长期存活的关键。人类和哺乳动物的妊娠过程是自然界中存在的一种天然的同种半异体免疫耐受模型。在母胎界面的细胞滋养层上高表达的hla-g能够抑制子宫蜕膜NK细胞的杀伤活性,在保护胎儿不被母体排斥的过程中具有重要的作用。但hla-g究竟是哪些特定构象或氨基酸同NK细胞上其特异性受体相互作用,目前尚没有明确的结论。我们研究的目的就是通过比较正常和特定氨基酸的突变的hla-g分子与特异性受体之间的作用力的强弱及功能活性变化来探讨hla-g与其受体的作用机制。本研究用基因工程技术将BirA酶底物肽(BSP)的编码基因克隆到MHC分子上,利用其与生物素特异性稳定结合的能力及生物素的多价性,将MHC分子捆绑成四聚体复合物,从而在MHC分子与KIR结合的过程中从而标记和识别NK细胞。本试验研究的目的就是构建和表达该融合蛋白,为hla-g1与其受体的作用机制研究奠定基础。研究利用PCR的方法分别扩增了hla-g1的胞外功能基因和BSP基因,用SOE PCR将它们拼接成融合基因(HB),并将HB克隆至载体pET28a,成功构建成了表达载体pET28a-HB。将其转化BL21(DE3)菌,在最佳的诱导表达条件下,即37℃,在含1mmol/L的IPTg的LB培养基中融合蛋白和hβ 2M分别于诱导5h,3h,两蛋白均以包涵体的形式得到了大量的表达。SDS-PAgE电泳显示其分子量分别为36kD和11kD,与预期相符。在Western blot免疫印迹分析,融合蛋白与87g单克隆抗体,hβ 2M与其腹水多克隆抗体发生特异性反应。由于融合蛋白在大肠杆菌中表达始终形成包涵体,而hla-g胞外区本身含有两个二硫键,给为蛋白质正确折叠造成很大困难,因此,在对表达产物形成的包涵体溶解、洗涤、复性等一系列过程中,摸索出融合蛋白hla-g1复性的最适条件,提高其复性率。融合蛋白包涵体经6mol/L的尿素溶解后用Co离子树脂纯化,获得理想的纯化效果。hβ 2M蛋白包涵体经洗涤溶解后目的蛋白浓度占全部包涵体蛋白的30%,满足辅助hla-g1融合蛋白复性的要求。重组融合蛋白hla-g1在与hβ 2M稀释法共复性,超滤浓缩后,在10μg/ml的浓度下,分别以NK92和K562细胞为效应细胞和靶细胞,在5:1和2.5:1的效靶比例下,用乳酸脱氢酶法(LDH法)测定NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果表明10μg/ml hla-g1融合蛋白能显著抑制NK细胞的杀伤活性,加入1.9μg/ml hla-g1融合蛋白抗体87g能阻断大部分hla-g1的抑制活性。

关键词： hla-g1 BSP hB2M 表达免疫耐受

膜型hla-g1对异种细胞毒T淋巴细胞的诱生和细胞毒性的影响

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中华移植杂志（电子版） 2007年第1期1卷 34-36页

作者：梁智辉吴雄文韩军艳房崇芸陈浩华中科技大学同济医学院免疫学系免疫学研究所武汉430030

目的探讨膜型hla-g1对人抗鼠细胞毒T淋巴细胞(CTL)诱生和细胞毒性作用的影响。方法将稳定表达hla-g1的小鼠NIT-1细胞株g1-NIT-1作为刺激细胞,与人外周血淋巴细胞混合,进行异种淋巴细胞-肿瘤细胞混合培养诱生出人抗鼠CTL,并用MTT法检测CT... 详细信息

目的探讨膜型hla-g1对人抗鼠细胞毒T淋巴细胞(CTL)诱生和细胞毒性作用的影响。方法将稳定表达hla-g1的小鼠NIT-1细胞株g1-NIT-1作为刺激细胞,与人外周血淋巴细胞混合,进行异种淋巴细胞-肿瘤细胞混合培养诱生出人抗鼠CTL,并用MTT法检测CTL特异性细胞毒性。结果用g1-NIT-1细胞诱导的人抗鼠CTL细胞对NIT-1细胞的杀伤率(32.21±20.52)%低于NIT-1-pcDNA3细胞诱导的人抗鼠CTL的杀伤率(56.41±14.80)%,两者差异具有统计学意义(P1细胞诱导的人抗鼠CTL对NIT-1-pcDNA3、g1-NIT-1细胞的杀伤率分别为(50.03±18.98)%、(52.54±17.90)%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 hla-g1能够通过抑制异种排斥反应中人抗鼠CTL的诱生,间接抑制人CTL对异种靶细胞的毒性。

关键词： hla-g1 异种淋巴细胞-肿瘤细胞混合培养细胞毒 T 淋巴细胞细胞毒性

表达hla-g1的K562细胞抵抗外周血NK细胞杀伤作用的研究

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免疫学杂志 2001年第4期17卷 257-260页

作者：韩军艳黄亚非吴雄文龚非力华中科技大学同济医学院免疫学研究所湖北武汉430030

目的研究 HL A- g1分子对 NK细胞杀伤活性的影响。方法借助脂质体介导的 DNA转染技术 ,将本室构建的真核表达质粒 pc DNA3 - HL A- g1转染人 K5 62细胞 ;通过 g4 18筛选 ,获得克隆化细胞株 K5 62 - g1;应用 RT- PCR及流式细胞术分别在 ... 详细信息

目的研究 HL A- g1分子对 NK细胞杀伤活性的影响。方法借助脂质体介导的 DNA转染技术 ,将本室构建的真核表达质粒 pc DNA3 - HL A- g1转染人 K5 62细胞 ;通过 g4 18筛选 ,获得克隆化细胞株 K5 62 - g1;应用 RT- PCR及流式细胞术分别在 RNA水平和蛋白质水平检测 HL A- g1的表达 ;最后 ,应用 MTT比色法检测转染细胞对不同个体外周血 NK细胞杀伤活性的抑制效应。结果与转染了空质粒的对照组相比 ,外周血 NK细胞对 K5 62 - g1的杀伤率降低 3 2 .4 3 % ( P 1)。结论靶细胞表达 HL A - g1分子可明显抑制 NK细胞的杀伤效应。

关键词： hla-g1 NK细胞基因转染 DNA转染 K562细胞

从妊娠人胎盘绒毛组织克隆hla-g1 cDNA

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同济医科大学学报 2001年第3期30卷 190-192页

作者：韩军艳黄亚非吴雄文龚非力华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学教研室武汉430030

为系统研究 HL A- g1分子的生物学功能 ,采用 RT- PCR技术 ,从人流的胎盘绒毛组织中提取总 RNA,经过逆转录合成 HL A- g1的全长 c DNA,插入到真核表达载体 pc DNA3中 ,构建重组表达质粒 pc DNA3- HL A- g1;转化大肠杆菌 DH5 α,筛选其... 详细信息

为系统研究 HL A- g1分子的生物学功能 ,采用 RT- PCR技术 ,从人流的胎盘绒毛组织中提取总 RNA,经过逆转录合成 HL A- g1的全长 c DNA,插入到真核表达载体 pc DNA3中 ,构建重组表达质粒 pc DNA3- HL A- g1;转化大肠杆菌 DH5 α,筛选其阳性克隆株 ,经酶切、 PCR及测序鉴定 ,证实 HL A-

关键词： hla-g1 克隆 cDNA 妊娠胎盘绒毛组织

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hla-g 与慢性炎症性疾病的研究进展

中华微生物学和免疫学杂志 2014年第7期34卷 554-559页

作者：徐丹萍林爱芬颜卫华温州医科大学附属浙江省台州医院中心实验室 317000

非经典人类白细胞抗原g（ human leukocyte an-tigen-g， hla-g）是机体内重要的免疫耐受分子，经选择性剪切可产生4种膜结合型 hla-g 蛋白（ mhla-g，hla-g1～g4）和3种可溶型hla-g蛋白（ shla-g， hla-g5～g7）。相对于 hlaⅠ类分子，... 详细信息

非经典人类白细胞抗原g（ human leukocyte an-tigen-g， hla-g）是机体内重要的免疫耐受分子，经选择性剪切可产生4种膜结合型 hla-g 蛋白（ mhla-g，hla-g1～g4）和3种可溶型hla-g蛋白（ shla-g， hla-g5～g7）。相对于 hlaⅠ类分子，hla-g具有有限的基因多态性，且存在多个位点和shla-g表达水平显著相关，其中研究最多的是14 bp插入／缺失等位基因多态性（14 bp＋／-多态性）。当hla-g基因为14 bp插入纯合子时，外显子8起始区的一个92 bp片段将被剪切，从而有助于hla-g mRNA转录水平更稳定。但hla-g转录水平与蛋白表达存在不均一性，中国汉族人种基因型为14 bp＋／＋人群外周血 shla-g 较14 bp＋／-、14 bp-／-人群外周血shla-g分泌水平显著降低，进一步提示hla-g 14 bp＋／-多态性在shla-g分泌过程中发挥了至关重要的作用［1］。

关键词： hla-g蛋白慢性炎症性疾病等位基因多态性 shla-g hlaⅠ类分子人类白细胞抗原g hla-g基因 hla-g1

妊娠晚期胎盘中可溶性人类白细胞抗原g的表达与重度子痫前期的相关性研究

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妊娠晚期胎盘中可溶性人类白细胞抗原G的表达与重度子痫前期的相...

作者：李莹郑州大学

学位级别：硕士

子痫前期（Preeclampsia）是妊娠20周后出现的一种特发性高血压综合征,是导致孕产妇和围生儿患病率和死亡率的主要原因之一,尤其是重度子痫前期。该病在国外的发病率为5%～7%,国内为9.4%。尽管世界范围内对子痫前期的研究很多,但是其确... 详细信息

子痫前期（Preeclampsia）是妊娠20周后出现的一种特发性高血压综合征,是导致孕产妇和围生儿患病率和死亡率的主要原因之一,尤其是重度子痫前期。该病在国外的发病率为5%～7%,国内为9.4%。尽管世界范围内对子痫前期的研究很多,但是其确切机制至今仍不明确。目前普遍认为母-胎界面免疫失衡是子痫前期发病的重要病因,也是当前研究的热点。众所周知,胎儿携带有一半父亲的基因,所以大多数学者认为胎儿对母体而言相当于一种同种半异体移植物。正常情况下,机体对于“非己”的异物都会产生免疫识别和排斥反应。然而,正常的妊娠过程中并不出现母儿排斥,这是因为母亲和胎儿间存在免疫耐受,可保证母胎免疫平衡。然而一旦该平衡被打破,就可导致一系列类似于急性移植排斥反应的病理学改变的发生。 hla是引发同种移植排斥反应的主要抗原,其Ⅰb类抗原hla-g,因其特异性的表达在母胎界面的绒毛外滋养细胞上,促进滋养细胞的侵入,抑制蜕膜NK细胞活性,维持母胎免疫平衡而受到学者的广泛关注。研究表明hla-g基因具有有限的多态性,其多态性的存在可能会影响hla-g的稳定性,导致胎盘中hla-g的表达异常或下降。hla-g表达下降或异常与一些主要的妊娠相关疾病相关,例如复发性流产,子痫前期等。基因的作用最终都通过其翻译产物—蛋白的功能表现出来。可溶性hla-g亚型（shla-g1／g5）在妊娠期维持母儿免疫平衡方面发挥重要作用。此次研究我们测定了重度子痫前期患者与正常晚孕者胎盘中shla-g1/g5mRNA和蛋白的表达,探讨妊娠晚期胎盘shla-g1/g5的表达与重度子痫前期发病的相关性。目的本课题采用Real-time PCR,免疫组化和Western Blot|的技术,比较妊娠晚期重度子痫前期组和正常晚孕组两组产妇胎盘中shla-g1/g5mRNA和蛋白的表达的有无差异,探讨胎盘中shla-g1/g5的表达与重度子痫前期发病的相关性。材料和方法 1研究对象收取2008年10月—2011年2月在郑州大学第三附属医院住院、经临床诊断为重度子痫前期的产妇胎盘85例,正常足月妊娠产妇胎盘104例。重度子痫前期的诊断标准按照人民卫生出版社出版的乐杰主编的第七版《妇产科学》。两组孕产妇均为中国汉族居民,单胎剖宫产。 2方法胎盘娩出后15分钟内避开胎盘边缘以及钙化和坏死处,分别于胎盘3点、6点、9点、12点处以及中心处,收集母体面5块组织（2cm×2cm×0.5cm）,用无菌滤纸反复吸取组织表面的血,用于HE染色和免疫组化的组织装入10%福尔马林溶液中固定,用于提取RNA和蛋白的组织剪刀剪碎后装入无菌冻存管内,然后迅速放入液氮罐,最后-80℃冰箱冻存备用。本课题采用Real-time PCR,免疫组化和Western blot的技术,测定妊娠晚期重度子痫前期患者和正常晚孕产妇胎盘中shla-g1/g5mRNA和蛋白的表达。 3统计学处理所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计学分析。Real-time PCR的相对拷贝数的统计用Log拷贝数法,两组间符合正态分布的计量资料采用两独立样本t检验,不符合正态分布的计量资料采用秩和检验。以α=0.05为检验水准。结果 1两组孕产妇一般临床资料的比较重度子痫前期组患者的平均年龄为30.15±5.28,与天上常对照组的29.64±6.17相比,不存在差异,结果无统计学意义（P＞0.05）;但是重度子痫前期组患者的平均孕周34.27±3.32显著低于正常对照组的38.56±1.65,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（见表3.1） 2两组孕产妇胎盘组织中hla-g1/g5mRNA的表达 2.1两组孕产妇胎盘组织中hla-g1mRNA的表达重度子痫前期组胎盘组织中hla-g1mRNA的相对表达量明显低于正常对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（见表3.2,图3.1） 2.2两组孕产妇胎盘组织中hla-g5mRNA的表达重度子痫前期组胎盘组织中（?）LA-g5mRNA的相对表达量显著低于正常对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（见表3.3,图3.2） 3两组孕产妇胎盘组织中shla-g蛋白的表达 shla-g表达在胎盘的滋养细胞上,包括绒毛滋养细胞和绒毛外滋养细胞,尤其集中地表达在母胎界面的绒毛外滋养细胞上。免疫组化的结果提示：shla-g在滋养细胞的胞浆,胞膜中均有表达,而且重度子痫前期组胎盘组织中shla-g蛋白的表达显著低于正常对照组（P＜0.05）。（见图3.3,3.4和3.5,）Western Blot的结果为：重度子痫前期组胎盘中shla-g蛋白的相对表达量为0.360±0.023,低于正常对照组的0.375±0.028,差异具有统计学意义（P＜0.05）。（见表3

关键词：重度子痫前期可溶性人类白细胞抗原g hla-g1 hla-g5 胎盘

Immune escape mechanism of hepatocellular carcinoma cells via trogocytosis of hla-g

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