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左卡尼汀对四氯化碳诱导的hl7702细胞损伤的保护作用及其机制研究

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左卡尼汀对四氯化碳诱导的HL7702细胞损伤的保护作用及其机制研究

作者：王雪霞河南大学

学位级别：硕士

目的：建立四氯化碳CCl4诱导的hl7702细胞氧化损伤致细胞凋亡病理模型，筛选并确定左卡尼汀（L-carnitine, LC）增强细胞活性的有效浓度，探究LC抑制CCl4诱导的hl7702细胞氧化损伤的作用及机制。方法：应用L9（34）正交表进行正交... 详细信息

目的：建立四氯化碳CCl4诱导的hl7702细胞氧化损伤致细胞凋亡病理模型，筛选并确定左卡尼汀（L-carnitine, LC）增强细胞活性的有效浓度，探究LC抑制CCl4诱导的hl7702细胞氧化损伤的作用及机制。方法：应用L9（34）正交表进行正交试验，选择两个因素和三个水平（CCl4浓度分别为4、8、16mmol·L-1，损伤时间分别为3、6、9h），建立CCl4诱导hl7702细胞最佳细胞凋亡病理模型;MTT法观察LC（10-5000μmol·L-1）对hl7702细胞活性的影响。实验分组：空白对照组、阳性对照组（5.68mmol·L-1维生素C）、CCl4模型组、不同剂量LC预处理组（1000、3000、5000μmol·L-1LC）;MTT法检测细胞活性;酶生化法测定细胞内丙氨酸转氨酶（ALT）、门冬氨酸转氨酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）活性的影响;2’,7’-二氯氢化荧光素二酯（DCFH-DA）为荧光探针，检测细胞ROS（12h）生成量;采用Hoechst33258荧光染色法倒置显微镜观察hl7702细胞凋亡形态;免疫印迹法检测NF-κB/p65、p-NF-κB/p65、Bcl-2、Bax蛋白的表达量。结果：正交试验结果表明，8mmol·L-1CCl4损伤hl7702细胞6h为最佳细胞凋亡模型;10-5000μmol·L-1范围内LC可剂量依赖性地提高细胞活性（P均＜0.05），未见细胞毒作用;8mmol·L-1CCl4损伤6h后细胞活性明显降低，ALT、AST、MDA水平升高（P均＜0.05）和SOD（P＜0.05）活性减弱，ROS（P＜0.05）含量高于对照组，荧光倒置显微镜观察发现，凋亡细胞显著增加;NF-κB/p65移位于胞核使胞内表达增加同时磷酸化水平升高，Bcl-2/Bax比值下降。1000-5000umol·L-1剂量范围内的左卡尼汀可使CCl4损伤后hl7702细胞活性明显增强，能明显抑制CCl4损伤后ALT、AST、MDA水平升高和SOD活性减弱（P均＜0.05）;荧光倒置显微镜观察发现，不同浓度的左卡尼汀预处理12h，可使细胞形态明显改善。左卡尼汀可显著减少CCl4损伤hl7702细胞后ROS的含量;抑制CCl4诱导的hl7702细胞内NF-κB的活化（P＜0.05），提高Bcl-2/Bax比值，以上效应均呈剂量依赖性。结论：正交试验建立CCl4诱导hl7702细胞氧化损伤致细胞凋亡模型（8mmol·L-1CCl4、6h）;LC在1000-5000μmol·L-1剂量范围内对hl7702细胞无细胞毒作用;LC对hl7702细胞保护作用机制与其抗氧化特性和调节NF-κB/p65与Bcl-2/Bax表达有关。

关键词：左卡尼汀 hl7702细胞四氯化碳氧化损伤凋亡

尼泊金丁酯钠、双乙酸钠及山梨酸钾对特氏杜氏藻及hl7702细胞的影响研究

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尼泊金丁酯钠、双乙酸钠及山梨酸钾对特氏杜氏藻及HL7702细胞的影...

作者：尚宇华南理工大学

学位级别：硕士

防腐剂是一种重要的食品添加剂,在食品加工中应用广泛,越来越受到关注。不同国家允许添加的防腐剂种类及用量有所不同。在中国,用量最大的防腐剂为苯甲酸及其钠盐,但目前许多国家已经禁止添加苯甲酸及其钠盐作为防腐剂,且中国规定A级绿... 详细信息

防腐剂是一种重要的食品添加剂,在食品加工中应用广泛,越来越受到关注。不同国家允许添加的防腐剂种类及用量有所不同。在中国,用量最大的防腐剂为苯甲酸及其钠盐,但目前许多国家已经禁止添加苯甲酸及其钠盐作为防腐剂,且中国规定A级绿色食品中也不允许使用苯甲酸钠。对羟基苯甲酸酯类,双乙酸钠,山梨酸及其钾盐等是国际公认的较为安全的防腐剂,毒性均小于苯甲酸钠,但此三种防腐剂对藻类和hl7702细胞影响的研究较少。本文研究尼泊金丁酯钠,双乙酸钠,山梨酸钾对藻类的影响。在正常藻类生长pH(微碱性)下,尼泊金丁酯钠在浓度≤1.4×102mg/L时对特氏杜氏藻生长基本没有影响;在浓度为1.5×102～2.3×102mg/L时,随着浓度上升,对特氏杜氏藻的抑制作用越来越强;尼泊金丁酯钠在浓度≥1.7×102mg/L时对特氏杜氏藻有致死的作用。双乙酸钠在浓度hl7702细胞(正常人体肝细胞)的影响也进行了研究。尼泊金丁酯钠浓度≤62.5μg/mL时,hl7702细胞基本不受影响;100～1000μg/mL范围下,随着尼泊金丁酯钠浓度上升,hl7702细胞存活率从87%逐渐下降至11%, EC50=215.97μg/mL。浓度≤1000μg/mL,山梨酸钾及双乙酸钠对hl7702细胞均无影响,细胞存活率均≥90%。

关键词：尼泊金丁酯钠双乙酸钠山梨酸钾特氏杜氏藻 hl7702细胞

蜂胶黄酮对环磷酰胺诱导hl7702细胞损伤的保护作用

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实用药物与临床 2013年第4期16卷 277-279页

作者：张良中国医科大学附属第一医院新生儿科沈阳110001

目的探讨蜂胶黄酮(EPF)对环磷酰胺(CTX)诱导hl7702细胞凋亡的保护作用。方法将hl7702细胞按一定密度分别接种于96孔板和24孔板,培养24 h后,向各孔中分别加入CTX(4 ng/L)、CTX(4 ng/L)+EPF(20、30、40 ng/L),继续培养24 h,进行WST-1、AO... 详细信息

目的探讨蜂胶黄酮(EPF)对环磷酰胺(CTX)诱导hl7702细胞凋亡的保护作用。方法将hl7702细胞按一定密度分别接种于96孔板和24孔板,培养24 h后,向各孔中分别加入CTX(4 ng/L)、CTX(4 ng/L)+EPF(20、30、40 ng/L),继续培养24 h,进行WST-1、AO/EB双染、Annexin-V-FITC/PI流式细胞染色。采用小鼠随机分组,试验组每天给予EPF 100、200、400 mg/mL灌胃,0.5 mL/支,连续给药10 d,同时注射CTX0.15 g/kg,共3 d。取血清检测过氧化氢酶(CAT)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)等活性及尿素氮(BUN)含量。结果 EPF与CTX共处理hl7702细胞生长抑制明显改善,当EPF浓度达到40 ng/mL时,促进生长作用呈现正比例曲线特征。试验组凋亡细胞明显减少,绝大多数细胞形态饱满,几乎没有死亡细胞。CTX单独处理的hl7702细胞组24 h晚期凋亡细胞占30.2%,CTX与EPF共处理细胞组凋亡细胞分别占19.2%、13.1%、7.1%。结论 EPF对CTX诱导的hl7702凋亡作用具有拮抗作用,可缓解CTX引起的毒性。

关键词： hl7702细胞蜂胶黄酮细胞凋亡环磷酰胺保护作用

苦参碱和氧化苦参碱致hl7702细胞毒性研究

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中华中医药学刊 2011年第6期29卷 1222-1225页

作者：张茜李峰杰金若敏宋泽平上海中医药大学药物安全评价研究中心上海201203

目的：探讨苦参碱和氧化苦参碱在体外对人正常肝细胞（hl7702）的影响。方法：①采用MTT法检测苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞活力的影响;②采用光镜对给药后的细胞形态进行观察;③检测给予苦参碱和氧化苦参碱后,肝细胞培养上清液中的肝功... 详细信息

目的：探讨苦参碱和氧化苦参碱在体外对人正常肝细胞（hl7702）的影响。方法：①采用MTT法检测苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞活力的影响;②采用光镜对给药后的细胞形态进行观察;③检测给予苦参碱和氧化苦参碱后,肝细胞培养上清液中的肝功能指标（ALT、AST、ALP、LDH）。结果：①MTT法显示,2.5~5mg/mL的苦参碱对hl7702细胞有明显的抑制作用（P〈0.01）,5mg/mL的氧化苦参碱能够显著性降低肝细胞活力（P〈0.05）;②光镜结果显示,给予苦参碱和氧化苦参碱后,细胞出现皱缩,变圆,体积变小,亮度增加,且药物浓度越大,呈现此状态的数目越多,苦参碱对hl7702细胞形态的影响大于氧化苦参碱;③5mg/mL的苦参碱和氧化苦参碱均能明显升高细胞上清液中的AST、ALP、LDH水平（P〈0.01或P〈0.05）,相同剂量苦参碱的上清液中AST、ALP、LDH水平的升高程度大于氧化苦参碱。结论：苦参碱和氧化苦参碱对肝脏可能具有毒性作用,且苦参碱的肝毒性作用大于氧化苦参碱。

关键词：苦参碱氧化苦参碱肝细胞毒性 hl7702细胞

微囊藻毒素LR影响人肝细胞hl7702的ERK及JNK的蛋白磷酸化

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水生生物学报 2011年第1期35卷 180-182页

作者：孙瑜黄朴徐立红浙江大学医学院生物化学与遗传学系杭州310058

微囊藻毒素（Microcystin,MCYST）是蓝藻的一些属产生的次级代谢产物,在发生水华的水体中普遍存在。微囊藻毒素LR（MCLR）是微囊藻毒素中存在最为普遍且毒性作用最强的一种。已有研究表明,微囊藻毒素可以诱发肝毒性并且与人群中的肝癌... 详细信息

微囊藻毒素（Microcystin,MCYST）是蓝藻的一些属产生的次级代谢产物,在发生水华的水体中普遍存在。微囊藻毒素LR（MCLR）是微囊藻毒素中存在最为普遍且毒性作用最强的一种。已有研究表明,微囊藻毒素可以诱发肝毒性并且与人群中的肝癌发生密切相关[1,2],因此进一步阐明其致毒机理具有重要的意义。

关键词： p-ERK p-JNK p-P38 微囊藻毒素LR hl7702细胞

RGD活性肽对环磷酰胺诱导hl7702正常肝细胞损伤的保护作用

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中国老年学杂志 2013年第9期33卷 2095-2097页

作者：张良韩丹赵诗萌吴红敏中国医科大学附属第一医院新生儿科辽宁沈阳110001

目的探讨含RGD序列的抗肿瘤多肽T30肽对环磷酰胺诱导hl7702细胞凋亡的保护作用。方法将hl7702细胞按一定密度分别接种于96孔板和24孔板,培养24 h后向各孔中分别加入环磷酰胺(CTX)(浓度为4μg/ml),CTX+RGD-T30(浓度依次为20、40、60μg/m... 详细信息

目的探讨含RGD序列的抗肿瘤多肽T30肽对环磷酰胺诱导hl7702细胞凋亡的保护作用。方法将hl7702细胞按一定密度分别接种于96孔板和24孔板,培养24 h后向各孔中分别加入环磷酰胺(CTX)(浓度为4μg/ml),CTX+RGD-T30(浓度依次为20、40、60μg/ml),继续培养24 h,进行WST-1、AO/EB双染、Annexin-V-FITC/PI流式细胞染色。结果 RGD-T30肽与CTX共处理hl7702细胞生长抑制明显改善,当RDG-T30肽浓度达到40μg/ml时,促进生长作用呈现正比例曲线特征。RDG-T30肽组凋亡细胞明显减少,绝大多数细胞形态饱满,几乎没有死亡细胞。CTX单独处理的hl7702细胞组24 h晚期凋亡细胞占30.2%,CTX与RDG-T30共处理细胞组凋亡细胞分别占19.2%和13.1%、7.1%。结论 T30肽对CTX诱导的hl7702凋亡具有拮抗作用。

关键词： hl7702细胞 RGD 细胞凋亡环磷酰胺

二甲基甲酰胺对hl7702肝细胞毒性及线粒体膜电位的影响

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毒理学杂志 2017年第4期31卷 283-285,300页

作者：张蔓管明月吴智君郑敏赵文锦王磊程娟中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所北京100050

目的观察二甲基甲酰胺(DMF)对hl7702肝细胞的细胞活力、凋亡及线粒体膜电位的影响,探讨DMF引起肝细胞凋亡的可能机制。方法 hl7702肝细胞给予50、100、150、200和250 mmol/L DMF处理,于24 h后检测其细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)释放量。... 详细信息

目的观察二甲基甲酰胺(DMF)对hl7702肝细胞的细胞活力、凋亡及线粒体膜电位的影响,探讨DMF引起肝细胞凋亡的可能机制。方法 hl7702肝细胞给予50、100、150、200和250 mmol/L DMF处理,于24 h后检测其细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)释放量。根据细胞毒性测试结果设置对照组及DMF染毒组(200 mmol/L)。流式细胞术检测DMF对hl7702细胞凋亡以及对线粒体膜电位的影响。结果 DMF剂量依赖性地降低hl7702细胞的存活率,其中150、200和250 mmol/L DMF组与对照组相比,细胞存活率明显降低;并且,随着DMF染毒浓度增加,释放至细胞外的LDH的含量增加,与DMF浓度呈正相关。200 mmol/L DMF染毒24 h后,与对照组相比,细胞凋亡率增加,差异有统计学意义(Phl7702细胞的毒性作用具有剂量依赖性,DMF引起hl7702线粒体膜电位的改变与DMF导致细胞凋亡有关。

关键词：二甲基甲酰胺 hl7702细胞细胞毒性线粒体膜电位

微囊藻毒素-LR对α4过表达的人肝细胞系hl7702的影响

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微囊藻毒素-LR对α4过表达的人肝细胞系HL7702的影响

作者：王莎浙江大学

学位级别：硕士

研究背景:随着经济的高速发展,由人类经济活动产生的水体富营养化及其所造成的水华暴发成为全球关注的重要环境问题。水华暴发时,大量繁殖的藻类所产生的次生代谢物微囊藻毒素(microcystins,MCs)对水生生物和人类具有健康威胁。在超过10... 详细信息

研究背景:随着经济的高速发展,由人类经济活动产生的水体富营养化及其所造成的水华暴发成为全球关注的重要环境问题。水华暴发时,大量繁殖的藻类所产生的次生代谢物微囊藻毒素(microcystins,MCs)对水生生物和人类具有健康威胁。在超过100种的MCs异构体中,微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)是最为常见且毒性最强的一种,肝脏是其主要的靶器官。MC-LR可以引发一系列的肝毒性,包括诱导肝细胞坏死、凋亡、肝出血等。目前认为,MC-LR的主要致毒机理是通过抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2 A,PP2 A)的活性从而产生一系列的细胞毒性作用。PP2A是细胞内主要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,参与了包括细胞骨架动态调控在内的多种细胞生命活动。α4是PP2A 一个重要的调节蛋白,它能对PP2A进行多种调节,包括调节PP2A活性和促进PP2A核心酶组装。α4的过表达能够促进细胞增殖和细胞存活。α4还对细胞骨架具有一定调节作用。本实验室前期发现MC-LR能够在多种细胞系中诱导细胞骨架发生重构,这可能与其抑制PP2A活性有关。随后,我们在人胚肾293细胞(HEK293)内观察到低浓度MC-LR引发了 PP2A活性应激性上调,这一现象可能与α4和PP2A/C亚基结合的改变有关,暗示α4参与了对MC-LR细胞毒性效应的调节过程。将HEK293细胞内α4蛋白过表达后,本实验室最近还观察到MC-LR对细胞骨架的破坏作用消失了,提示在MC-LR毒性效应下α4的过表达提高了 HEK293内细胞骨架的稳定性,这引发了我们如果在其它细胞系中过表达α4是否具有同样效应的思考。本实验将探究MC-LR处理α4过表达的人肝细胞系7702(hl7702)后产生的各种细胞效应,这有助于更好地阐明MC-LR毒性效应下α4,PP2A和细胞骨架的关系。研究方法:利用lipofectamineTM2000将α4表达质粒载体转入hl7702内24h后,再分别用不同浓度的MC-LR(0μM,1μM和10μM)处理24h。空载质粒作为空载对照组。应用酶活性测定试剂盒、免疫印迹技术、免疫荧光技术和免疫共沉淀技术对本实验条件下产生的各种细胞效应和相关分子变化进行检测。研究结果:MC-LR染毒α4过表达的hl7702后:PP2A活性受到显著抑制;PP2A亚基蛋白水平和PP2A/C亚基的翻译后修饰水平受到影响,如PP2A/C亚基表达上调,PP2A/C亚基Y307位点磷酸化水平升高,PP2A/C亚基L309位点甲基化水平降低;PP2A/C亚基和α4的结合以及PP2A/C亚基和PP2A/A亚基的结合均显著下降;PP2A 活性受到抑制的同时,p-ERK(T202/Y204),p-JNK(T183/Y185)和p-P38(T180/Y182)磷酸化水平显著上升,表明三条MAPK通路同时被激活;细胞内微丝,微管和中间纤维形态和分布没有发生变化,细胞骨架结构稳定,而骨架相关蛋白VASP(S157)和Ezrin(T567)磷酸化水平上调,VASP(S239)磷酸化水平下调。研究结论:α4过表达后,MC-LR仍然抑制了 hl7702细胞的PP2A活性,其作用方式可能是改变PP2A/C亚基蛋白水平及其翻译后修饰水平,改变PP2A/C亚基和α4的结合以及PP2A/C亚基和PP2A/A亚基的结合;与未过表达α4的hl7702细胞类似,ERK1/2,P38和JNK三条通路依然被激活;α4的过表达在一定程度上拮抗了 MC-LR对骨架的破坏作用,与骨架相关蛋白VASP(S157),VASP(S239)和Ezrin(T567)的磷酸化水平改变有关;α4过表达的hl7702细胞对MC-LR的响应与α4过表达的HEK293中类似,但机制有所不同。

关键词：微囊藻毒素-LR α4过表达 hl7702细胞蛋白磷酸酶2A 细胞骨架细胞骨架相关蛋白

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RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制

中华肿瘤杂志 2011年第4期33卷 270-275页

作者：谢淑丽朱明光吕国悦王广义吉林大学第一医院普外科长春 130021 吉林大学基础医学院免疫教研室

目的研究RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制，为抑制肝癌细胞生长寻找分子靶点。方法构建***载体，建立RhoC基因沉默的肝癌细胞株。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长，硝酸银染色检测细胞增殖，平板克隆实验检测细胞克隆形... 详细信息

目的研究RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制，为抑制肝癌细胞生长寻找分子靶点。方法构建***载体，建立RhoC基因沉默的肝癌细胞株。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长，硝酸银染色检测细胞增殖，平板克隆实验检测细胞克隆形成能力，流式细胞术（FACS）检测细胞周期，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞周期蛋白表达。PcDNA3-RhoC转染肝细胞，建立RhoC高表达细胞株，检测RhoC基因对正常肝细胞生长的影响。结果siRNA-RhoC载体转染Bel7402细胞后，RhoC基因表达的抑制效率为82．3％。细胞培养第4天，RNAi组吸光度（A）值为0．4 ±sO．10，显著低于Bel7402细胞组（0．73±0．11，P〈0．05）和阴性对照组（0．71±0．07，P〈0．05）。此后，RNAi组的细胞增殖速度持续低于Bel7402细胞组和阴性对照组，直到第7天实验结束。RNAi组的细胞核平均银染颗粒数明显少于Bel7402细胞组和阴性对照组（分别为1．23±0．35、3．47±0．93和3．17±0．78，均P〈0．01）；Go／G，期细胞显著升高[分别为（73．14±5．93）％、（57．05±5．97）％和（52．99±4．80）％，均P〈0．05]；cyclinD1表达下降（分别为0．45±0．21、1．25±0．24和1．12±0．15，均p〈0．05）；CDK4表达下降（分别为0．55±O．08、1．18±0．32和1．10±0．29，均P〈0．05）；p16表达升高（分别为1．07±0．23、0．36±0．12和0．35±0．13，均P〈0．01）；p21表达升高（分别为0．42±0．12、0．174±0．06和0．19±0．08，均P〈0．05）。hl7702细胞转染PcDNA3-RhoC质粒后，Rhoc高表达，至转染的第3天，RhoC转染组A值为0．83±0．10，显著高于hl7702细胞组（0．54±0．11，P〈0．05）和空载体对照组（0．58±0．55，P〈0．05）。其后，RhoC转染细胞生长速度持续高于hl7702细胞组和空载体对照组，直至第7天实验结束。结论RhoC是调控肝癌细胞生长的关键分子，是抑制肝癌细胞生长的良好分子靶点。

关键词： RhoC基因肝肿瘤 Bel7402细胞 hl7702细胞 RNA干扰细胞生长细胞周期