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hiwi expression profile in cancer cells and its prognostic value for patients with colorectal cancer

Chinese Medical Journal 2011年第14期124卷 2144-2149页

作者： ZENG Yan QU Li-ke MENG Lin LIU Cai-yun DONG Bin XING Xiao-fang WU Jian SHOU Cheng-chao Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research (Ministry of Education Department of Biochemistry and Molecular Biology Peking University Cancer Hospital & Institute Beijing 100142 China Department of Pathology Peking University Cancer Hospital & Institute Beijing 100142 China

Background hiwi is a member of PIWI gene family and its expression is found in various tumors, indicating that it may play a pivotal role in tumor development. This study was designated to examine hiwi protein expression profile in several cancer cell lines and its prognostic value for patients with colorectal cancer.Methods Totally 270 patients who underwent surgical resection of primary colorectal cancer between January 1999 and December 2002 with a median follow-up time of 33 months were registered in the study. Formalin-fixed and paraffin-embedded specimens from these patients and 236 matched adjacent non-cancerous normal colorectal tissues were collected. Anti-HIlWI monoclonal antibodies were generated and used for evaluating hiwi protein expression. X2 tests were conducted to determine the association between hiwi expression and the other variables. Survival curves were estimated using the Kaplan-Meier method and compared by the log-rank test. Multivariate analysis was performed by using the Cox regression model.Results By generating antibodies specific for hiwi, we examined hiwi protein expression in several cancer cell lines and demonstrated positive expression of hiwi in 69 out of 270 （25.6%） colorectal cancer tissues; 15 of 236 （6.4%） matched adjacent non-cancerous tissues were also positive for hiwi. Patients with positive hiwi expression in adjacent non-cancerous tissue had statistically lower overall survival （OS） and disease free survival （DFS） compared with negative patients （OS： 10.4% vs. 55.5%, P=0.009; DFS： 10.4% vs. 55.1%, P=0.015）. For early stage group （stages Ⅰ and Ⅱ）,patients with positive hiwi expression had significantly lower OS and DFS （OS： 57.4% vs. 79.5%, P=0.014; DFS： 56.7%vs. 80.5%, P=0.010）. In lymph node negative group, patients with positive hiwi expression had statistically lower OS and DFS （OS： 53.0% vs. 73.5%, P=0.037; DFS： 52.2% vs. 74.6%, P=0.025）. Multivariate analysis revealed that hiwi over-expression was a significant prognostic factor for OS （95% CI： 1.132-2.479, P=0.01

关键词： hiwi colorectal neoplasms prognosis

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人脑胶质瘤中hiwi的表达及其意义

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江苏医药 2010年第9期36卷 993-995,F0003页

作者：孙关颜伟钱春发赵鹏张军霞王颖毅孙利华王伟杰鲁艾林刘宁傅震尤永平南京医科大学第一附属医院神经外科 210029

目的探讨hiwi在人脑胶质瘤中的表达及其与病理分级的相关性。方法收集具有病理明确分级的WHOⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤组织各10例,另取12例正常脑组织(来源于脑外伤行内减压术患者)作正常对照,用免疫组织化学染色、RT-PCR及Western blot检... 详细信息

目的探讨hiwi在人脑胶质瘤中的表达及其与病理分级的相关性。方法收集具有病理明确分级的WHOⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤组织各10例,另取12例正常脑组织(来源于脑外伤行内减压术患者)作正常对照,用免疫组织化学染色、RT-PCR及Western blot检测hiwi在正常脑组织及各级胶质瘤组织中的表达水平。结果在胶质瘤组织中hiwi表达增高,与胶质瘤恶性程度呈正相关,且在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中表达水平显著强于Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤。结论 hiwi在胶质瘤组织中高表达,可能与胶质瘤的发生、发展密切相关。

关键词：神经胶质瘤 hiwi

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靶向hiwi基因的RNAi对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

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中国普通外科杂志 2014年第5期23卷 685-688页

作者：胡小辉黄胜超吴海滨陈宝英李建文广东医学院附属医院血管甲状腺乳腺外科广东湛江524001 广东医学院附属医院肿瘤中心广东湛江524001

目的:研究靶向hiwi基因的siRNA对乳腺癌细胞增殖的影响。方法:将靶向hiwi基因的siRNA导入乳腺癌细胞,培养并转染MCF-7细胞,运用qRT-PCR、Western-Blot进行干扰效果的检测并使用CCK-8法检测干扰后MCF-7细胞的增殖和凋亡情况。结果:干扰后... 详细信息

目的:研究靶向hiwi基因的siRNA对乳腺癌细胞增殖的影响。方法:将靶向hiwi基因的siRNA导入乳腺癌细胞,培养并转染MCF-7细胞,运用qRT-PCR、Western-Blot进行干扰效果的检测并使用CCK-8法检测干扰后MCF-7细胞的增殖和凋亡情况。结果:干扰后48 h和72 h的MCF-7细胞无明显生长抑制作用(P>0.05),而干扰后24 h的hiwi-647组细胞的生长抑制作用明显高于其他组,差异有统计学意义(Phiwi基因的siRNA干扰乳腺癌细胞MCF-7后,MCF-7细胞增殖受到抑制,提示hiwi是乳腺癌基因治疗的潜在靶点。

关键词：乳腺肿瘤病理学基因 hiwi siRNA RNAi

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hiwi在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

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实用医学杂志 2014年第24期30卷 3976-3978页

作者：胡小辉黄胜超吴海滨陈宝英李建文广东医学院附属医院血管甲状腺乳腺外科 524001 广东医学院附属医院肿瘤中心 524001

目的:研究hiwi在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法:应用免疫组化方法分别检测乳腺癌和癌旁组织中hiwi蛋白的表达。结果:hiwi蛋白主要在乳腺癌和癌旁组织细胞胞浆中表达。乳腺癌组织中hiwi的阳性表达率明显高于癌旁组织(P0.05)。结... 详细信息

目的:研究hiwi在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法:应用免疫组化方法分别检测乳腺癌和癌旁组织中hiwi蛋白的表达。结果:hiwi蛋白主要在乳腺癌和癌旁组织细胞胞浆中表达。乳腺癌组织中hiwi的阳性表达率明显高于癌旁组织(Phiwi的表达与临床分期、Ki67相关(P0.05)。结论:乳腺癌组织中hiwi的高表达,提示hiwi可能与乳腺癌的发生、发展有关。而hiwi的表达与乳腺癌的临床分期和Ki67相关,说明hiwi可能是影响乳腺癌预后的重要因素。

关键词：乳腺肿瘤 hiwi 免疫组化

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hiwi影响肝细胞癌转移复发的机制及其预后价值的研究

HIWI影响肝细胞癌转移复发的机制及其预后价值的研究

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作者：王龙蓉复旦大学

学位级别：硕士

原发性肝癌主要是肝细胞癌(以下简称肝癌),其发病率位居全球恶性肿瘤发病率第五位,而肿瘤致死率则位居全球第三。目前,外科根治性切除是治疗肝癌的主要方法,但其术后高复发率和高转移率是阻碍肝癌患者获得长期生存的主要问题。因此探索... 详细信息

原发性肝癌主要是肝细胞癌(以下简称肝癌),其发病率位居全球恶性肿瘤发病率第五位,而肿瘤致死率则位居全球第三。目前,外科根治性切除是治疗肝癌的主要方法,但其术后高复发率和高转移率是阻碍肝癌患者获得长期生存的主要问题。因此探索新的有效生物指标来进行预后判断或者作为靶点发展新的辅助治疗手段,成为预防及治疗肝癌复发转移的重要研究方向。越来越多的研究已经显示微小RNA (microRNAs, miRNAs)可以通过RNA干扰(RNA interference, RNAi)途径调节很多细胞内的基因表达。其中有半数miRNAs位于较为脆弱的染色质位点以及那些经常在各种肿瘤内功能丢失或功能放大的区域,提示了这些miRNAs可能在肿瘤发生发展中起重要作用,他们也被称为肿瘤miRNAs (oncomiRs)。然而,虽然在肿瘤发生发展过程中抑制这些oncomiRs可以成为一种新型有效的肿瘤疗法,但由于每种oncomiR对于肿瘤发展所起的作用是各自独立的,因此在肿瘤细胞中同时抑制多种oncomiR是极为困难的。而PIWI亚家族是Argonaute蛋白家族的两个亚家族(AGO和PIWI)之一,是RNAi机制的必需组成蛋白,同时也可以调节大多miRNAs的生物合成。这些蛋白出现在已被报道的所有RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complexes, RISC)中,并且被认为是在成熟miRNAs生物合成过程中的必需蛋白。hiwi(又称PIWIL1)主要在人类的生殖细胞中表达,其与多种肿瘤发生、发展和预后的联系已经在近期多个研究中被报道。然而,在肝癌研究中仅有有限的关于hiwi的数据被报道且并未得出任何结论。因而,相比较单个miRNAs而言,探索hiwi和肝癌之间的联系可能是寻找肝癌有效预后指标和治疗靶点的一个更有希望的途径。因此我们对其进行了系统研究。我们利用RT-PCR和Western Blot方法检测人不同转移潜能肝癌细胞株HepG2、SMMC7721、MHCC97L、MHCC97H及HCCLM3和人正常肝细胞株L02内的hiwi表达情况,同时利用RT-PCR方法检测其在冰冻肝癌标本及相应癌旁组织标本(n=20)内的表达情况,发现hiwi的表达在L02细胞株、低转移潜能细胞株和中高转移潜能细胞株中逐级增加(P=0.039),并且在肝癌组织内的表达显著高于其相应的癌旁组织(Phiwi在肝癌中所起的作用以及其可能的内在机制,我们设计并合成不同抑制效率的hiwi靶向siRNA:control siRNA、hiwi-970和hiwi-1510,并将它们转染入HCCLM3、MHCC97H和MHCC97L三种肝癌细胞株。在siRNA转入24h后,RT-PCR和Western Blot检测证实细胞内hiwi表达的抑制效率随control siRNA、hiwi-970和hiwi-1510表现出显著提高的趋势,且三者之间有显著差异(Phiwi的下调造成细胞增殖功能在转染siRNA72h后出现显著抑制(Phiwi表达也造成了肿瘤细胞侵袭能力的显著下降(Phiwi-970和hiwi-1510表现出显著提高趋势。基于前期结果,我们构建了肝癌组织芯片(n=168),利用免疫组织化学方法进行hiwi染色,探索hiwi与临床病理特征的相关性及其表达的预后价值。结果显示hiwi在肝癌组织及其癌旁组织的胞质、胞膜和胞核中均有染色。其在肿瘤组织中的表达阳性率为26.19%高于癌旁组织的2.98%(Phiwi阳性染色的患者与肿瘤体积大(P=0.047)、肝内转移灶多(P=0.027)和淋巴转移率高(P=0.004)等临床病理特征呈正相关。PCNA主要在肝癌组织及其癌旁组织的胞核染色。在hiwi阳性表达的肝癌组织中,PCNA表达阳性率为97.73%,在hiwi阴性肝癌组织中PCNA阳性率为66.13%,两者呈正相关(Phiwi的表达是肝癌患者总体生存(P=0.007)与无瘤生存(P=0.036)的独立危险因素,其总生存时间和无瘤生存时间预测价值在AFP≤300ng/ml (P=0.002和P300ng/ml (P=0.463和P=0.987)和Edmondson-Steiner Ⅲ-Ⅳ级(P=0.331和P=0.912)的条件下hiwi的表达与预后无关。通过上述研究,我们可以得出结论,hiwi可以作为肝癌根治性切除术治疗后患者的一项可靠的预后

关键词： hiwi 肝细胞癌转移复发预后

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胃癌中hiwi和CD44的表达及临床意义

胃癌中Hiwi和CD44的表达及临床意义

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作者：陈勇安徽医科大学

学位级别：硕士

目的：通过检测胃癌组织中干细胞因子hiwi及肿瘤干细胞表面标记物CD44的表达,分析两者与胃癌临床病理因素间的关系,并且分析hiwi和CD44在胃癌组织中表达的相关性,探讨干细胞因子hiwi作为肿瘤干细胞表面标记物的可能性。方法：采用免疫... 详细信息

目的：通过检测胃癌组织中干细胞因子hiwi及肿瘤干细胞表面标记物CD44的表达,分析两者与胃癌临床病理因素间的关系,并且分析hiwi和CD44在胃癌组织中表达的相关性,探讨干细胞因子hiwi作为肿瘤干细胞表面标记物的可能性。方法：采用免疫组织化学方法(Envision二步法)对胃癌组织(传统组织切片100例和组织芯片110例)及癌旁正常对照组织(40例)进行CD44和hiwi蛋白检测。结果：(1)传统组织切片中,CD44蛋白在胃癌组织中(阳性率84.00%)高表达,明显高于癌旁正常胃黏膜组织(阳性率27.50%)(χ2=41.817,P0.05)。hiwi蛋白在胃癌组织中(阳性率69.00%)高表达,明显高于癌旁正常胃黏膜组织(阳性率17.50%)(χ2=30.536,Phiwi在胃癌组织中表达与胃癌的肿瘤直径、浸润深度、分化程度、淋巴结转移及临床TNM分期相关(P0.05)。(2)组织芯片中,CD44蛋白在胃癌组织中(阳性率57.27%)高表达,明显高于癌旁正常胃黏膜组织(阳性率27.50%)(χ2=10.108,P0.05),而与胃癌的浸润深度、淋巴结转移及临床TNM分期相关(Phiwi蛋白在胃癌组织中(阳性率70.00%)高表达,明显高于于癌旁正常胃黏膜(阳性率17.50%)(χ2=32.812,Phiwi在胃癌组织中与胃癌的肿瘤直径、浸润深度、分化程度、淋巴结转移及临床TNM分期相关(P0.05)。(3)胃癌组织中,CD44蛋白和hiwi蛋白表达具有正相关性(传统组织切片：rs=0.639,Phiwi蛋白在胃癌中高表达,与胃癌预后不良相关,提示CD44和hiwi可能作为预测胃癌生物学行为的指标。(2)肿瘤干细胞标记物CD44与干细胞因子hiwi具有正相关关系,提示两指标可能在肿瘤发生发展过程中起协同作用。(3)hiwi可能作为新的胃癌干细胞标志物,协同CD44共同作为筛选分离胃癌干细胞的指标。

关键词： CD44 hiwi 肿瘤干细胞标记物胃癌干细胞免疫组织化学

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白桦脂酸对人AGS胃腺癌细胞hiwi和Cyclin B1基因表达的调控作用

白桦脂酸对人AGS胃腺癌细胞Hiwi和Cyclin B1基因表达的调控作用

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作者：杨立靖华中科技大学

学位级别：硕士

目的:本实验以人胃腺癌AGS细胞为研究对象,观察白桦脂酸对AGS细胞增殖、凋亡及周期的影响,并探讨其分子机制。方法:用噻唑蓝（MTT）法检测来白桦脂酸对AGS细胞增殖的影响,用AnnexinV-PI双标流式细胞术来检测AGS细胞凋亡率,用Hoechst... 详细信息

目的:本实验以人胃腺癌AGS细胞为研究对象,观察白桦脂酸对AGS细胞增殖、凋亡及周期的影响,并探讨其分子机制。方法:用噻唑蓝（MTT）法检测来白桦脂酸对AGS细胞增殖的影响,用AnnexinV-PI双标流式细胞术来检测AGS细胞凋亡率,用Hoechst 33258染色分析AGS细胞发生凋亡后的形态学变化。经白桦脂酸处理后的AGS细胞,其细胞周期的变化经PI染色后用流式细胞仪来检测。hiwi和Cyclin B1蛋白的变化用单标流式细胞术检测,而其mRNA表达水平的相对高低用逆转录PCR（RT-PCR）来检测。结果:在体外实验中,白桦脂酸能以时间和剂量依赖方式显著抑制AGS细胞的增殖,其24 h的IC50值为18.25 ug/mL （95%可信区间:15.16-27.31 ug/mL）。当白桦脂酸的浓度达到12 ug/mL以上时,AGS细胞出现明显的凋亡,经Hoechst 33258染色可见典型的凋亡小体。白桦脂酸还能使AGS细胞周期阻滞在G2/M期,而处在S期的细胞数量减少。经白桦脂酸处理24 h的AGS细胞,其hiwi和Cyclin B1蛋白及m RNA的表达水平均以剂量依赖的方式下调。结论:hiwi基因在AGS细胞中高水平异常表达。白桦脂酸在体外实验中,具有抑制AGS细胞增殖,诱导其凋亡并阻滞其于G2/M期的活性作用。而这种作用可能与白桦脂酸能在基因水平上抑制hiwi及Cyclin B1的表达有关。白桦脂酸强大的抗肿瘤细胞活性使其可能成为一种新的抗胃腺癌肿瘤药物。

关键词：白桦脂酸 AGS细胞 hiwi Cyclin B1 细胞周期

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高表达的hiwi调节TβR和CDK与乳腺癌预后关系的研究

高表达的HIWI调节TβR和CDK与乳腺癌预后关系的研究

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作者：曹冀为苏州大学

学位级别：硕士

研究目的:探索异常表达的PIWI基因在人类恶性肿瘤发生发展过程中起着的重要作用,本课题研究PIWI的人类同源基因hiwi在乳腺癌患者中的表达水平,及hiwi基因促进乳腺癌细胞群增殖机制及抑制乳腺癌细胞群细胞凋亡机制,探索hiwi是否能够作为... 详细信息

研究目的:探索异常表达的PIWI基因在人类恶性肿瘤发生发展过程中起着的重要作用,本课题研究PIWI的人类同源基因hiwi在乳腺癌患者中的表达水平,及hiwi基因促进乳腺癌细胞群增殖机制及抑制乳腺癌细胞群细胞凋亡机制,探索hiwi是否能够作为未来临床上评价乳腺癌患者治疗及预后的潜在生化标志物。方法:通过实时聚合酶链式反应分别检测以下各组织:25例为癌旁正常乳腺组织;19例为Ⅰ-Ⅱ期,无腋窝淋巴结等转移的乳腺癌组织;8例为Ⅲ-Ⅳ期,且腋窝淋巴结等已经转移的乳腺癌组织,并用Western blotting检测各组组织蛋白表达水平。对MCF-7乳腺癌细胞株进行培养,获得其后代细胞群。构建hiwi基因过表达和敲除载体,分别为hiwi-pc DNA3.1和hiwi-sh RNA,将其与hiwi基因结合,然后使用LipofectamineTM 2000试剂将构建成功的载体对后代乳腺癌细胞株进行转染,并分为五个组(1、对照组;2、hiwi干扰组;3、hiwi过表达组;4、hiwi干扰救援组;5、hiwi过表达救援组)。通过PCR和Western blot测算hiwi m RNA与蛋白表达量,同时以细胞流式分析测算细胞凋亡率。最后测试CDK4、CDK6、CDK8、TβRⅠ与TβRⅡ的表达水平同hiwi表达的相关性。结果:PCR与Western blot检测结果显示乳腺癌组织中MAEL、hiwi与HILI相对m RNA表达量明显增高,而PIWIL3与hiwi2无明显改变。转染后的细胞株检测结果显示过表达组呈现hiwi m RNA的最高表达,干扰组呈现hiwi m RNA的最低表达,而对照组、过表达救援组和干扰救援组则呈现出相对平均水平,且过表达组与干扰组表达水平与其余三组相比,其差异有统计学意义(Phiwi在蛋白质表达方面,过表达组和其他组相比探测到最强信号而干扰组则探测到最弱信号。在Cyclin D和CDK基因的m RNA及蛋白表达方面,hiwi过表达组中CDK4、CDK6和CDK8基因的表达水平较其余四组都有明显增高,且与这几组间的差异有统计学意义(Phiwi表达量与TβRⅠ、TβRⅡ、CDK4、CDK6和CDK8的表达相关(Phiwi过表达组有最低的细胞凋亡率,而干扰组却有最高的凋亡率,且这两组与其他三组相比,差异均有统计学意义(Phiwi的较高表达呈明显负相关(Phiwi与HILI的表达明显增高,且与肿瘤分期密切相关。2.高表达的hiwi能导致乳腺癌患者较差的预后,而HILI则欠缺这样的相关性。hiwi是更为合适的评价乳腺癌疾病进展与预后的潜在生化标志物。3.过表达的hiwi能够提升细胞活性并抑制细胞凋亡,干扰hiwi的表达则细胞凋亡率明显升高。4.hiwi的表达与TβRⅠ和TβRⅡ表达水平有负相关性,而与CDK4、CDK6和CDK8基因在内的细胞周期调控因子表达水平呈正相关,从微观层面可以调控乳腺癌的进展。

关键词： PIWI hiwi 乳腺癌 TβR CDK

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肿瘤睾丸抗原hiwi过表达与肿瘤血管生成关系的研究

肿瘤睾丸抗原hiwi过表达与肿瘤血管生成关系的研究

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作者：孟玉菡华中科技大学

学位级别：硕士

目的:确定肿瘤睾丸抗原hiwi在多种肿瘤组织中的表达情况。方法:应用RT-PCR和细胞免疫荧光技术在8种肿瘤细胞株如A2780、Hela、Siha、MCF-7等中检测hiwi以及Ang-2和Tie-2的表达,应用免疫组化方法检测hiwi在多种肿瘤组织中的表达。结果:h... 详细信息

目的:确定肿瘤睾丸抗原hiwi在多种肿瘤组织中的表达情况。方法:应用RT-PCR和细胞免疫荧光技术在8种肿瘤细胞株如A2780、Hela、Siha、MCF-7等中检测hiwi以及Ang-2和Tie-2的表达,应用免疫组化方法检测hiwi在多种肿瘤组织中的表达。结果:hiwi在宫颈癌细胞株Hela、乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435s、卵巢癌细胞A2780、和子宫内膜癌细胞113中高表达。与卵巢良性病变、慢性宫颈炎、乳腺增生、子宫内膜良性病变相比,hiwi在卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌及子宫内膜癌中显著升高,具有明显差异（P＜0.01）,结论:hiwi在多种肿瘤细胞及肿瘤组织中过表达,并在肿瘤发生过程中起重要作用。目的:确定肿瘤睾丸抗原hiwi与肿瘤血管生成的关系。方法:应用免疫组化方法检测Ang-2和Tie-2在多种肿瘤组织和相应良性病变组织中的表达,采用Fisher精确检验、ANOVA SNK检验和Nemenyi-Wilcoxon-Wilcox检验分析,相关性检验采用Spearman等级相关分析。结果:Ang-2及Tie-2在宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌及子宫内膜癌中显著升高,有明显差异（P＜0.01）,另外,在宫颈癌、乳腺癌和卵巢癌中hiwi的表达与Ang-2的表达有正相关性,在卵巢癌中hiwi的表达与Tie-2的表达有正相关性。结论:hiwi在肿瘤血管中高表达,并且可作为潜在的治疗肿瘤血管生成的靶基因。

关键词： hiwi 基因表达肿瘤发生肿瘤血管生成血管生成素2

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细胞龄相关分子在不同月龄大鼠睾丸和附睾的表达

细胞龄相关分子在不同月龄大鼠睾丸和附睾的表达

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作者：段永刚华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分c-kit、hiwi和波形蛋白在不同月龄大鼠睾丸和附睾的表达目的:检查c-Kit、hiwi和波形蛋白在不同月龄大鼠睾丸和附睾组织中的表达差异,研究睾丸和附睾在成熟和衰老过程中表达的规律性改变,为研究男性生殖系统衰老提供理论依据。... 详细信息

第一部分c-kit、hiwi和波形蛋白在不同月龄大鼠睾丸和附睾的表达目的:检查c-Kit、hiwi和波形蛋白在不同月龄大鼠睾丸和附睾组织中的表达差异,研究睾丸和附睾在成熟和衰老过程中表达的规律性改变,为研究男性生殖系统衰老提供理论依据。方法:运用免疫组织化学(S-P法)检查6月龄、12月龄和24月龄SD大鼠睾丸和附睾组织中c-Kit、hiwi和波形蛋白抗血清免疫反应强度,并对其进行比较分析。结果:c-Kit特异性免疫反应阳性主要表达于精原细胞,其他细胞表达水平甚弱。附睾上皮、附睾管腔内成分亦有c-Kit阳性表达。hiwi在大鼠睾丸和附睾组织中表达也很丰富,6月龄和12月龄大鼠中各级生精细胞,特别是精原细胞和初级精母细胞为免疫反应强阳性细胞;支持细胞、间质细胞、类肌细胞和血管内皮细胞亦为hiwi阳性细胞。附睾上皮有hiwi阳性表达。但是24月龄大鼠睾丸和附睾组织中随年龄增长hiwi表达下调(P>0.05)。波形蛋白在睾丸和附睾组织中表达模式为6月龄大鼠睾丸和附睾组织中低表达,24月龄大鼠睾丸和附睾组织表达明显上调(P >0.01)。结论:c-kit、hiwi在24月龄动物睾丸和附睾组织中表达下调,波形蛋白表达随增龄而明显增强。结果提示,睾丸和附睾组织的衰老与细胞和细胞信号转导异常密切相关. 第二部分Gas7在不同月龄大鼠睾丸和附睾的表达实验一Gas7-GST融合蛋白的表达和多克隆抗体的制备目的:制备Gas7多克隆抗体,为深入研究Gas7在睾丸和附睾的结构与功能的关系提供特异工具。方法:PCR扩增编码大鼠Gas7羧基末端456bp的DNA片段,DNA重组入原核表达质粒pGEX-3X,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-Gas7融合蛋白。经谷胱甘肽-琼脂糖珠(Glutathione Sepharose 4B)介质填充的层析柱分离纯化蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体,Western Blot检测抗体的免疫效果和抗体的特异性。结果:成功构建pGEX-3X-Gas7原核表达载体,获得分子量约为43kD的融合蛋白,免疫家兔后得到抗Gas7的多克隆抗体。通过Western Blot检测显示,抗体的效价在1:100 000以上;在脑组织和睾丸组织的表达与国外报道一致,同时发现在附睾组织亦有表达。结论:重组质粒表达的Gas7- GST融合蛋白具有良好的抗原性,成本效益良好。制备的特异性和高效价的抗Gas7的多克隆抗体,能够满足针对Gas7免疫印迹和免疫组化技术检查等实验要求。实验二Gas7蛋白及其mRNA在不同月龄大鼠睾丸和附睾的表达目的:检查Gas7蛋白及其mRNA在不同月龄大鼠睾丸和附睾组织中的表达差异,研究睾丸和附睾在成熟和衰老过程中规律性变化,旨在研究男性生殖系统衰老的病理机制。方法:运用免疫组织化学方法(S-P法)和组织原位杂交技术检查6月龄、12月龄和24月龄SD大鼠睾丸和附睾组织中Gas7蛋白及其mRNA表达情况,并对其进行比较分析。结果:免疫组化S-P法显示,Gas7蛋白在6月龄和12月龄睾丸和附睾组织中呈低表达,主要表达于减数分裂后的圆形精子细胞、长形精子细胞的尾部、间质细胞、类肌细胞、附睾管壁及精子尾部;在24月龄睾丸和附睾组织表达明显上调。原位杂交方法显示结果与免疫组化结果相似,Gas7mRNA阳性棕黄色颗粒杂交信号在6月龄和12月龄睾丸和附睾组织中呈低表达,而在24月龄睾丸和附睾组织呈高表达。结论:Gas7蛋白及其mRNA随年龄增长在大鼠睾丸和附睾表达明显增强。该结果提示,睾丸和附睾组织的衰老与细胞和细胞信号转导异常密切相关,即老化分子的堆积而影响细胞行为。

关键词： c-Kit hiwi 波形蛋白睾丸附睾衰老 Gas7 原核表达多克隆抗体免疫印迹法 Gas7蛋白 Gas7mRNA 大鼠

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