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hiv-1假病毒感染未成熟树突状细胞实验研究

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中国免疫学杂志 2017年第10期33卷 1441-1446页

作者：朱娜刘雪丽仇妮张洁婷吴诗品李体远郭焱李昌金宁一青岛市中心医院药学部青岛266042 暨南大学第二临床医院深圳市人民医院深圳518000 长春中医药大学基础医学院长春130117 军事医学科学院军事兽医研究所省部共建吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130062

目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的hiv-1假病毒;通过hiv-1假病毒感染未成熟树突状细胞(immatural dendritic cell,iDC)实验探讨病毒与细胞的相互作用。方法:利用慢病毒包装系统构建携带E... 详细信息

目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的hiv-1假病毒;通过hiv-1假病毒感染未成熟树突状细胞(immatural dendritic cell,iDC)实验探讨病毒与细胞的相互作用。方法:利用慢病毒包装系统构建携带EGFP基因的hiv-1假病毒,通过RT-PCR扩增hiv-1假病毒中的EGFP基因;hiv-1假病毒感染iDC,对hiv-1假病毒感染iDC后的基因组整合和转录水平进行检测,观察被感染iDC中EGFP基因的表达。结果:构建的hiv-1假病毒通过RT-PCR结果显示扩增得到EGFP基因;hiv-1假病毒感染iDC后,在基因组整合和转录水平检测中都扩增得到了EGFP基因,荧光显微镜观察被hiv-1假病毒感染的iDC,观察到iDC表达绿色荧光蛋白。结论:成功构建携带EGFP基因的hiv-1假病毒;hiv-1假病毒可以感染iDC,并将其遗传物质整合到iDC基因组中,并经过转录和翻译使iDC表达EGFP。

关键词： hiv-1假病毒未成熟树突状细胞感染实验

hiv-1假病毒筛选药物体系的建立及DY系列化合物抗hiv-1活性研究

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HIV-1假病毒筛选药物体系的建立及DY系列化合物抗HIV-1活性研究

作者：王萍昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]建立并优化VSVG/hiv-1NL4-3 Luc假病毒筛选抗hiv-1药物体系,对初筛活性好的化合物进行体外抗hiv-1活性研究。[方法]采用Promega公司的荧光素酶活性分析系统,比较了VSVG/hiv-1NL4-3Luc对4种不同细胞的感染力。采用3种不同实验条件... 详细信息

[目的]建立并优化VSVG/hiv-1NL4-3 Luc假病毒筛选抗hiv-1药物体系,对初筛活性好的化合物进行体外抗hiv-1活性研究。[方法]采用Promega公司的荧光素酶活性分析系统,比较了VSVG/hiv-1NL4-3Luc对4种不同细胞的感染力。采用3种不同实验条件对不同类型hiv-1上市药物进行活性评价,进一步验证了该模型的可行性与有效性。随后,应用该系统对特定靶点化合物进行筛选,并与hiv-1ⅢB病毒筛选体系所得结果进行比较。最后,对该系统筛选的活性较好的样品采用MTT法检测了化合物对不同细胞株的毒性作用,用ELISA测p24的方法进行不同病毒株的药效评价。[结果]VSVG/hiv-1NL4-3 Luc对CRFK细胞的感染力最强,报告基因的表达水平与加入的病毒量呈剂量依赖关系。比较3种不同实验条件下不同阳性药物抑制VSVG/hiv-1NL4-3 Luc的EC50,发现方法3条件最优。而用该方法对化合物进行筛选,发现其EC50与病毒hiv-1ⅢB所得EC50基本一致。对几个抗病毒活性较高的化合物进行进一步的研究发现：DY1108、DY1118、DY1203和DY1204对C8166、MT-4、H9及PBMC细胞无明显细胞毒性,CC50均>200μg/ml;DY1119、DY1208和DY1209具有广谱的抗hiv-1活性,对实验株(hiv-1ⅢB)、耐药株(NRTI耐药株hiv-174V、PI耐药株hiv-1RF/V82F/184V、FI耐药株hiv-1NL4-3 gp41 (36G) N42S)和临床株(hiv-1KM018、hiv-1TC-1、hiv-1Wan)的复制均具有很强的抑制作用,ECso均在纳克每毫升水平,而NNRTI耐药株(hiv-1A17)对这些化合物表现出不同程度的耐药;其余化合物对实验株、耐药株和临床株也表现出较好的抑制效果;DY1119、DY1208和DY1209对hiv-1重组逆转录酶有较好地抑制作用,IC50分别为0.496μg/ml、0.038μg/ml、0.060μg/ml,其余抑制作用较弱。[结论]本研究成功建立并优化了基于VSVG/hiv-1NL4-3 Luc假病毒的抗hiv药物筛选体系,该平台可进行NNRTI、NRTI和INI的筛选,不适用于PI和FI的筛选。此假病毒模型的建立节省了人力、物力和财力,我们在2级生物安全实验室即可进行大规模的药物筛选和抗hiv-I活性评价。对化合物的抗hiv-1活性研究表明,DY1119、DY1208IDY1209对不同病毒株有很强的体外抗hiv-1活性,我们希望能给致力于研发抗hiv-1药物的研究者提供抗病毒活性的参考,促进抗hiv-1药物的发展。

关键词： hiv-1假病毒药物筛选优化应用抗hiv-1活性

利用报告基因比较悬浮细胞与贴壁细胞对hiv-1假病毒感染效率的差异

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微生物学报 2012年第7期52卷 921-926页

作者：苏艳苏玲玲殷涛张宝江新疆农业大学动医学院基础医学重点实验室乌鲁木齐830000 新疆畜牧科学院乌鲁木齐830000 新疆兵团兽医总站乌鲁木齐830000

【目的】研究用人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,hiv)-1假病毒感染带有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)报告基因和hiv受体CD4+CCR5+的Tzmbl细胞,分析悬浮状态与贴壁状态对hiv-1假病毒感染Tzmbl细胞的影响,为进一... 详细信息

【目的】研究用人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,hiv)-1假病毒感染带有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)报告基因和hiv受体CD4+CCR5+的Tzmbl细胞,分析悬浮状态与贴壁状态对hiv-1假病毒感染Tzmbl细胞的影响,为进一步进行hiv生物学研究与中和抗体实验室评价提供实验基础。【方法】通过将pNL43 R-E-与编码hiv膜蛋白的质粒共转染293T细胞,收集上清,获得hiv假病毒。该假病毒感染悬浮的和贴壁的Tzmbl细胞后可表达β-gal报告蛋白,通过X-gal染色和仪器分析可测定表达β-gal报告基因的细胞数与细胞感染率。【结果】hiv假病毒感染悬浮细胞的效率高于其对贴壁的Tzmbl细胞感染的效率,且细胞的感染率的改变与病毒的型相关。【结论】该研究结果可为进一步利用具有单轮感染活性的hiv假病毒进行生物研究和中和抗体实验提供研究方法。

关键词： hiv-1假病毒悬浮细胞贴壁细胞报告基因细胞感染

树突状细胞的分离培养及hiv-1假病毒感染实验研究

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树突状细胞的分离培养及HIV-1假病毒感染实验研究

作者：朱娜长春中医药大学

学位级别：硕士

目的：以人外周血来源的单个核细胞为前体细胞，建立体外快速分离和诱导培养未成熟树突状细胞(Immatural dendritic cell, iDC)的方法;构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的hiv-1假病毒;通过HI... 详细信息

目的：以人外周血来源的单个核细胞为前体细胞，建立体外快速分离和诱导培养未成熟树突状细胞(Immatural dendritic cell, iDC)的方法;构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的hiv-1假病毒;通过hiv-1假病毒感染iDC实验探讨病毒与细胞的相互作用。方法：采用Ficoll密度梯度离心和MACS磁珠分选系统，收集高纯度的CD14单核细胞;用rhGM-CSF、rhIL-4联合诱导CD14单核细胞，获得未成熟树突状细胞(iDC)，应用流式细胞术鉴定细胞表面标记和抗原吞噬能力，用普通光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞表面和内部结构特征;利用慢病毒包装系统构建携带EGFP基因的hiv-1假病毒，通过RT-PCR扩增hiv-1假病毒中的EGFP基因;最后利用hiv-1假病毒感染iDC，对hiv-1假病毒感染iDC后的基因组整合和转录水平进行检测，观察被感染iDC中EGFP基因的表达。结果：流式细胞仪检测结果表明，CD14免疫磁珠技术获得CD14单核细胞纯度达94％以上，诱导分化第4天的iDC具有吞噬能力，CD195的表达在95％以上，普通光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察到细胞出现典型DC特征;构建的hiv-1假病毒通过RT-PCR结果显示扩增得到EGFP基因;hiv-1假病毒感染iDC后，在基因组整合和转录水平检测中都扩增得到了EGFP基因，荧光显微镜观察被hiv-1假病毒感染的iDC，观察到iDC表达绿色荧光蛋白。结论：经过体外快速诱导培养获得大量具有典型特征的iDC，其可以应用于进一步实验研究;成功构建携带EGFP基因的hiv-1假病毒;hiv-1假病毒可以感染iDC，并将其遗传物质整合到iDC基因组中，并经过转录和翻译使iDC表达EGFP。

关键词：树突状细胞 hiv-1假病毒感染实验

基于假病毒技术探讨黄芩苷抗hiv-1活性研究

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中国医院药学杂志 2022年第2期42卷 129-135页

作者：庞晓军黎东旺陈丽华钦州市第二人民医院广西钦州535000 广西医科大学药学院广西南宁530021

目的:基于假病毒技术探究黄芩苷抗hiv-1活性作用。方法:利用hiv-1骨架质粒NL4-3 mCherry Luciferase、hiv-1包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G和人胚肾细胞HEK-293T构建hiv-1假病毒药物筛选体系,并对该体系进行优化和安全性验证。测定黄芩苷对293... 详细信息

目的:基于假病毒技术探究黄芩苷抗hiv-1活性作用。方法:利用hiv-1骨架质粒NL4-3 mCherry Luciferase、hiv-1包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G和人胚肾细胞HEK-293T构建hiv-1假病毒药物筛选体系,并对该体系进行优化和安全性验证。测定黄芩苷对293T细胞活性、hiv-1假病毒活性、hiv-1逆转录酶(RT)活性、RNA依赖的DNA聚合酶(RDDP)活性以及核糖核酸酶H(RNase H)活性的影响。将黄芩苷分别与hiv-1 RT的晶体结构(2ZD1)、RNase H的晶体结构(3QIN)进行分子对接,探讨黄芩苷与hiv-1 RT、RNase H的相互作用及结合性能。结果:成功构建出了具有双报告检测基因的hiv-1假病毒药物筛选体系,该体系只有单轮感染活性;黄芩苷对293T细胞活性的抑制作用随浓度的增大而增加,黄芩苷在100μmol·L^(-1)浓度以下对293T细胞的活力影响较小(P>0.05);黄芩苷对hiv-1假病毒具有一定的抑制作用,给药浓度越高,其相应的萤光素酶基因和红色荧光基因表达则越低,在100μmol·L^(-1)高浓度下其抑制率可达60%左右;黄芩苷对hiv-1 RT活性和RNase H表现出明显的抑制作用(Phiv-1 RDDP活性的抑制作用较弱,其IC;约为1.686 mmol·L^(-1);黄芩苷与hiv-1 RT、RNase H蛋白的结合区域均为对应的酶活区域,其分子对接打分值分别为|-10.991|、|-8.485|;黄芩苷能够与hiv-1 RT酶蛋白的LYS101、ILE180氨基酸残基形成氢键作用,与TRP229氨基酸残基形成π-π作用,与VAL106、TYR181、TYR188、VAL108等氨基酸残基形成多个疏水作用;黄芩苷结构母核上的苯环可以与RNase H酶蛋白中的一个Mn;形成一个阳离子-π作用,黄芩苷还能与GLY444、ASP498、GLN500、TYR501氨基酸残基形成氢键作用。结论:黄芩苷在体外具有较好的抗hiv-1活性,其主要的作用靶点为hiv-1 RT和hiv-1 RNase H。

关键词：黄芩苷 hiv-1假病毒逆转录酶核糖核酸酶H 分子对接