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hiv原病毒耐药二代测序检测体系的建立及其临床应用研究

HIV原病毒耐药二代测序检测体系的建立及其临床应用研究

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作者：李嘉晖南京中医药大学

学位级别：硕士

研究目的:人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiency virus,hiv）耐药严重影响hiv感染者生活质量及预后,是重要的公共卫生问题。血浆hivRNA耐药是临床中常用的hiv耐药检测手段,但仅适用于病毒复制活跃的hiv感染者,对于病毒抑制的病人并... 详细信息

研究目的:人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiency virus,hiv）耐药严重影响hiv感染者生活质量及预后,是重要的公共卫生问题。血浆hivRNA耐药是临床中常用的hiv耐药检测手段,但仅适用于病毒复制活跃的hiv感染者,对于病毒抑制的病人并不适用。尽管有效抗反转录病毒治疗（ART）后血浆hivRNA难以检出,但细胞内hiv原病毒仍旧维持稳定,此时检测hiv原病毒耐药成为可行的替代选择。由于现有的ART方案并不能杀死原病毒,我们预计产生耐药后hiv原病毒是野生株和耐药突变株的混合体。鉴于Sanger测序技术检出原病毒耐药的能力受到耐药突变株所占比例的影响,当耐药株所占比例较低时会出现假阴性结果。我们推测相对Sanger测序,二代测序检测hiv原病毒耐药理论上更具优势,但相关数据较为缺乏。本研究将评估不同测序平台（Sanger测序vs二代测序）,以及PCR扩增策略（分段扩增vs单个长链pol基因扩增）对hiv耐药检出的影响。研究方法:本研究纳入66例血浆hiv RNA耐药检测证实的hiv耐药株感染者,其中包括26例病毒未抑制感染者和存在历史hiv RNA耐药检测结果的40例病毒抑制的感染者。采用EDTA抗凝管采集静脉血,随后分离血浆和外周血单个核细胞（PBMC）,分别提取RNA和基因组DNA,分别用于血浆hivRNA耐药检测和hiv原病毒耐药检测。本研究通过巢式PCR扩增hiv pol区:（1）分段扩增分别扩增（其中PR/RT区位于HXB2的2166-3441nt,包含编码蛋白酶的99个氨基酸和编码逆转录酶的290个氨基酸;INT区位于HXB2的4160-5197nt,包含编码整合酶的288个氨基酸）;（2）单个长链pol基因扩增（其位于HXB2的2166-5197nt,是几乎全长的pol区,包含编码蛋白酶、逆转录酶和整合酶所有的氨基酸）。采用Sanger测序进行血浆hiv RNA耐药检测,采用Sanger测序和二代测序进行hiv原病毒耐药检测。采用Geneious Prime应用软件（2022.0.2）,处理Sanger测序数据,获得目的片段的共识序列,将共识序列传输至斯坦福耐药数据库分析耐药位点。对于二代测序结果,采用加拿大政府NGS耐药数据库在线分析软件进行分析。研究结果:66例的入组病人中包含男性66（100%）例,其中位年龄为35（IQR:30,44）岁,其感染的hiv病毒株亚型包括38（57.6%）例CRF01AE型、7（10.6%）例B型、6（9.1%）例B+C型,4（6.1%）例CRF07BC型。对于26例病毒未抑制的患者,其中位血浆hivRNA载量为14400（IQR:1938,140750）拷贝/mL,中位CD4+T淋巴细胞计数为129（IQR:18,318）个/μL。对于40例病毒抑制的患者,其持续病毒抑制的中位时间为 3.09（IQR:2.14,3.71）年,中位 CD4+T 淋巴细胞计数为 429（IQR:284,566）个/μL。在该66例患者中,血浆hiv RNA对NRTIs、NNTRIs和PIs耐药的比例为81.8%,84.8%和 3.0%,其中 M184V、M184I、K65R、K103N、V106M、Y181C 耐药突变的检出率分别为 56.1%、7.58%、30.3%、30.3%、30.3%、27.3%,其 Sanger测序检出 hiv 原病毒耐药与血浆hivRNA耐药检测的一致性分别为0.428、0.269、0.374、0.676、0.341、0.609。当二代测序的阈值设为3%,该方法检出的M184V、M184I、K65R、K103N、V106M、Y181C的hiv原病毒耐药与hivRNA耐药的一致性分别为0.529、0.103、0.415、0.852、0.547、0.574。对于26例病毒未抑制的患者,血浆hiv RNA对NRTIs、NNTRIs和PIs耐药的比例为 65.4%,76.9%和 3.8%,其中 M184V、K65R、K103N、V106M、Y181C 耐药突变的检出率分别为42.3%、19.2%、42.31%、15.4%、23.1%,其Sanger测序检出hiv原病毒耐药与血浆hiv RNA耐药检测的一致性分别为0.92、0.866、0.92、1、1。当二代测序的阈值设为3%,该方法检出的M184V、K65R、K103N、V106M、Y181C的hiv原病毒耐药与hiv RNA 耐药的一致性分别为 0.922、0.885、0.922、0.866、0.806。对于40例病毒抑制的患者,血浆hiv RNA对NRTIs、NNTRIs和PIs耐药的比例为92.5%、90.0%和 2.5%,其中 M184V、M184I、K65R、

关键词： hiv耐药 hiv原病毒 Sanger测序二代测序

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