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结肠癌中β3GnT8与转录因子c-jun的相关性探讨及其在侵袭迁移进程中的功能研究

结肠癌中β3GnT8与转录因子c-jun的相关性探讨及其在侵袭迁移进程...

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作者：于美云苏州大学

学位级别：硕士

目的:探究转录因子c-jun对糖基转移酶β3Gn T8的转录调控作用及研究β3Gn T8与c-jun在结肠癌侵袭迁移中的分子机制。方法:(1)培养三种人结肠癌细胞株SW620、SW480、Lo Vo,并通过Western-blot检测这三种结肠癌细胞中c-jun和β3Gn T8蛋白... 详细信息

目的:探究转录因子c-jun对糖基转移酶β3Gn T8的转录调控作用及研究β3Gn T8与c-jun在结肠癌侵袭迁移中的分子机制。方法:(1)培养三种人结肠癌细胞株SW620、SW480、Lo Vo,并通过Western-blot检测这三种结肠癌细胞中c-jun和β3Gn T8蛋白的表达水平及通过Transwell法检测c-jun和β3Gn T8高、低表达的细胞在24h时的侵袭迁移能力;(2)Ch IP技术检测c-jun与β3Gn T8基因启动子区的结合作用;(3)将c-jun过表达质粒、c-jun sh RNA干扰载体及其空载体通过lip2000脂质体介导的方法分别转染至c-jun和β3Gn T8蛋白的表达低的SW480细胞和表达程度高的Lo Vo细胞中;(4)荧光显微镜观测转染带有GFP标记载体的细胞株,Real time-PCR及Western-blot检测转染后SW480中c-jun上调后和Lo Vo细胞中c-jun下调后β3Gn T8、cd147以及相关分子的m RNA和蛋白的表达变化;(5)流式细胞术检测c-jun对β3Gn T8参与合成的细胞表面多聚乳糖胺糖链的表达水平;(6)Transwell和细胞划痕修复实验检测SW480中c-jun上调后和Lo Vo中c-jun下调后,对细胞侵袭和迁移能力的影响;(7)筛选获得β3Gn T8和β3Gn T2基因的有效si RNA片段;(8)将c-jun过表达载体与筛选获得的β3Gn T8、β3Gn T2基因的最有效干扰片段通过脂质体介导共转染结肠癌SW480细胞,RT-PCR检测β3Gn T8 m RNA的表达变化,并通过Transwell检测各组细胞的迁移能力。结果:(1)Western-blot检测三株结肠癌细胞株中c-jun和β3Gn T8的蛋白表达水平由低到高依次为SW480→SW620→Lo Vo,Transwell结果显示24h时SW480细胞转移细胞数极少,而Lo Vo转移细胞数很多;(2)Ch IP实验结果显示c-jun与β3Gn T8基因启动子区有相互结合;(3)通过荧光显微镜观察、Real time-PCR及Western-blot检测发现SW480中c-jun上调后,与空白对照组相比,β3Gn T8、hg-cd147及MMPs的m RNA和蛋白表达水平均升高;Lo Vo细胞中c-jun下调后,与空白对照组相比,β3Gn T8、hg-cd147及MMPs的m RNA和蛋白表达水平均下降;(4)流式细胞术实验结果显示,SW480中c-jun上调后,与空白对照组相比,细胞表面多聚乳糖胺链含量增加;Lo Vo细胞中c-jun下调后,与空白对照组相比,细胞表面多聚乳糖胺链含量降低;(5)细胞划痕损伤修复实验显示SW480中c-jun上调后,与空白对照组相比,损伤程度变小,提示细胞迁移能力增强;而Lo Vo细胞中c-jun下调后,与空白对照组相比,损伤程度变大,提示细胞迁移能力降低;(6)Transwell小室检测发现SW480中c-jun上调后,与空白对照组相比,穿膜细胞数明显增多,提示细胞侵袭和迁移能力增强;而Lo Vo细胞中c-jun下调后,与空白对照组相比,穿膜细胞数明显降低,提示细胞侵袭和迁移能力降低。(7)Real time-PCR筛选获得siβ3Gn T8-1754和siβ3Gn T2-1336两个最有效干扰片段,与c-jun过表达载体共转染SW480细胞后,RT-PCR检测结果显示,与单独转染siβ3Gn T8-1754和siβ3Gn T2-1336组相比,共转染组β3Gn T8 m RNA的表达升高,且高于未处理组;并用Transwell检测发现共转染组穿膜细胞数较c-jun过表达组明显减少,较单独转染siβ3Gn T8-1754和siβ3Gn T2-1336组升高。结论:(1)三株结肠癌细胞株中c-jun和β3Gn T8的蛋白表达水平由低到高依次为SW480→SW620→Lo Vo。(2)转录因子c-jun可能通过调节糖基转移酶β3Gn T8的表达来影响靶糖蛋白cd147的糖基化修饰水平进而参与细胞的转移进程。

关键词： β3GnT8 c-jun hg-cd147 多聚乳糖胺链侵袭迁移

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β3GnT8在结肠癌细胞株转移中的分子机制及转录因子c-jun对β3GnT8的调控作用

β3GnT8在结肠癌细胞株转移中的分子机制及转录因子c-jun对β3GnT...

引用

作者：倪建龙苏州大学

学位级别：硕士

目的：研究糖基转移酶β3GnT8在结肠癌细胞侵袭转移中的分子机制及探讨转录因子c-jun对β3GnT8的转录调控作用。方法：（1）Tranwell细胞迁移和侵袭实验分别检测LS-174T，SW620，SW480，LoVo四株结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。（2）West... 详细信息

目的：研究糖基转移酶β3GnT8在结肠癌细胞侵袭转移中的分子机制及探讨转录因子c-jun对β3GnT8的转录调控作用。方法：（1）Tranwell细胞迁移和侵袭实验分别检测LS-174T，SW620，SW480，LoVo四株结肠癌细胞的迁移和侵袭能力。（2）Western-blot检测β3GnT8和cd147在四株结肠癌细胞中的蛋白表达水平。（3）流式细胞术和Lectin-blot检测四株结肠癌细胞株中多聚乳糖胺链的表达水平。（4）将β3GnT8的真核正义表达载体及空载体、β3GnT8干扰载体及对照载体通过脂质体分别介导转染至低转移的结肠癌细胞株LS-174T和高转移的结肠癌细胞株LoVo。（5）Western-blot检测转染后LS-174T中β3GnT8上调后和LoVo细胞中β3GnT8下调后cd147糖基化的改变。（6）Tranwell细胞迁移和侵袭实验检测转染后LS-174T中β3GnT8上调后和LoVo中β3GnT8下调后，其细胞迁移和侵袭能力的变化。（7）克隆转录因子c-jun全长基因序列并构建c-jun正义表达载体。（8）将c-jun真核正义表达载体及空载体通过脂质体转染胃癌SGC-7901细胞，并通过G418筛选稳转细胞株。（9）荧光显微镜观察转染荧光载体的细胞株，RT-PCR和Western-blot检测c-jun、β3GnT8和cd147的mRNA和蛋白表达;流式细胞术及Lectin-blot检测c-jun对细胞糖蛋白中多聚乳糖胺链的表达影响;细胞增殖和细胞周期实验检测转染c-jun后细胞增殖能力的变化。结果：（1）Transwell小室检测四株结肠癌细胞株中侵袭和迁移能力发现结肠癌细胞株的转移能力从低到高依次为LS-174T，SW620，SW480，LoVo。（2）Western-blot检测发现随着结肠癌转移程度的增加，β3GnT8和hg-cd147的表达也随之升高，且β3GnT8和hg-cd147的表达具有一定的相关性。（3）流式细胞术和Lectin-blot实验结果显示，多聚乳糖胺链的表达也随着结肠癌转移程度的增加而升高，并且被多聚乳糖胺链修饰的cd147糖蛋白的分子量大小在49kDa-90kDa之间。（4）LS-174T中β3GnT8上调后，与空白对照组相比，hg-cd147的糖基化表达升高，其侵袭和迁移能力也增强;LoVo细胞中β3GnT8下调后，与空白对照组相比，hg-cd147的糖基化表达下降，其侵袭和迁移能力也降低。（5）构建c-jun正义表达载体，正反向测序结果在NCBI基因库中BLAST同源检索后显示正义载体中插入的c-jun目的片段正确（6）通过荧光显微镜观察、RT-PCR、western-blot等检测，c-jun正义表达载体成功转入细胞并得到稳定转染细胞株SGC-7901。（7）Western-blot检测发现，c-jun基因上调后，与对照组相比β3GnT8和hg-cd147的表达均升高。（8）细胞增殖和细胞周期实验检测发现，c-jun基因上调后，与对照组相比细胞增殖能力增强。结论：（1）四株结肠癌细胞株的转移能力从低到高依次为LS-174T，SW620，SW480，LoVo。（2）β3GnT8、多聚乳糖胺链、hg-cd147的表达水平随着结肠癌转移程度的增加而升高，并且β3GnT8与hg-cd147的表达呈正相关。（3）在结肠癌细胞中β3GnT8可能通过调节hg-cd147的糖基化水平来影响其侵袭转移能力。（4）筛选出c-jun上调表达的SGC-7901稳转细胞株。（5）转录因子c-jun可能通过促进糖基转移酶β3GnT8的表达来影响糖蛋白hg-cd147的糖基化水平进而促进细胞的增殖能力。

关键词： β3GnT8 多聚乳糖胺链 hg-cd147 结肠癌细胞株转移转录因子 c-jun

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