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华东理工大学学报（自然科学版） 2024年第1期50卷 62-70页

作者：罗清平彭妍 ALI Mohsin 庄英萍郭美锦华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237 上海国佳生化工程技术研究中心有限公司上海200237

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)衣壳(Capsid)蛋白是制备抗猪圆环2型病毒亚单位疫苗的有效免疫抗原,能在大肠杆菌及杆状病毒/昆虫细胞表达系统中获得表达,然而在哺乳细胞中的表达研究仍然缺乏。瞬时表达条件考察结果显示... 详细信息

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)衣壳(Capsid)蛋白是制备抗猪圆环2型病毒亚单位疫苗的有效免疫抗原,能在大肠杆菌及杆状病毒/昆虫细胞表达系统中获得表达,然而在哺乳细胞中的表达研究仍然缺乏。瞬时表达条件考察结果显示,采用宿主hek293f细胞及PEI-40kDa转染试剂能获得35%病毒PCV2 Capsid基因细胞转染效率。转染试剂PEI(Polyethylenimine)与DNA比例差异会影响复合物形成大小及形态,复合物形成15~80 nm颗粒有利于转染效率的提高。实验以免疫逃逸型猪圆环病毒2b型NDSU41513病毒株,设计了新型PCV2 Capsid (△1-41aa)-fc(pig) protein(PCfP)分子。在3 L反应器中成功实现了hek293f细胞瞬时表达PCfP,表达水平达到3.8 mg/L。PCfP蛋白能够自主装形成约为41 nm类病毒颗粒,诱导小鼠机体内产生强烈的体液免疫反应,具有很高的应用潜力。

关键词：猪圆环病毒2型瞬时表达 hek293f 类病毒颗粒疫苗

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SSB/La蛋白在hek293f细胞中的高效表达、纯化及初步应用

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检验医学与临床 2024年第S1期21卷 115-119页

作者：周清华刘嘉玥邵亚丹徐延伟赵巧辉李桂林郑州伊美诺生物技术有限公司河南郑州450016 UWC常熟世界联合学院江苏常熟215500 郑州安图生物工程股份有限公司河南郑州450016

目的天然SSB/La抗原存在难获取、成本高等问题,故使用hek293f细胞尝试表达重组SSB/La蛋白。方法调取人SSB/La序列并进行基因密码子优化和合成,亚克隆至哺乳动物重组表达质粒后转染hek293f细胞,完成培养后组合使用DEAE离子交换层析和Ni... 详细信息

目的天然SSB/La抗原存在难获取、成本高等问题,故使用hek293f细胞尝试表达重组SSB/La蛋白。方法调取人SSB/La序列并进行基因密码子优化和合成,亚克隆至哺乳动物重组表达质粒后转染hek293f细胞,完成培养后组合使用DEAE离子交换层析和Ni亲和层析纯化目的蛋白。结果重组SSB/La蛋白在hek293f细胞中成功表达,随后纯化获得了高纯度的重组SSB/La蛋白,且进一步通过抗SSB抗体检测试剂盒初步证实了重组SSB/La蛋白具有优良的性能。结论成功实现了SSB/La蛋白制备,为其工业化生产及商业化应用奠定坚实的理论基础。

关键词： SSB/La hek293f 蛋白表达纯化初步应用

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用于重组蛋白生产hek293细胞瞬时表达系统的优化

用于重组蛋白生产HEK293细胞瞬时表达系统的优化

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作者：马凯新乡医学院

学位级别：硕士

背景大多数治疗性重组蛋白是在哺乳动物细胞平台中生产的,其中中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是重要的重组蛋白质生产平台,但其产生的蛋白质有不同于人细胞的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)。非人源... 详细信息

背景大多数治疗性重组蛋白是在哺乳动物细胞平台中生产的,其中中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是重要的重组蛋白质生产平台,但其产生的蛋白质有不同于人细胞的翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)。非人源的PTMs会引起人细胞中的免疫原性应答等问题,使用人源化细胞系如人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cells,hek)293则可以有效避免这种风险。hek293细胞已被用于重组蛋白的瞬时表达,但通常表达水平较低,难以满足应用需求。高效hek293瞬时表达系统核心技术被国外垄断,因此建立并优化自主产权的hek293瞬时表达系统具有重要意义。目的建立hek293高效瞬时表达系统,提高重组蛋白的表达水平。方法1.转染条件和培养工艺优化:构建含有SV40大T抗原、p21CIP+P27cip、P18+a fGf、PDI+bcl-x L、XBP-1S+ERO1-La、P18+IGf-1的共转表达载体,利用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGfP)表达载体筛选出最佳的共转载体;将穿膜肽DLR8、CHR4、CPPMK2与转染试剂以不同方式组合使用,利用EGfP表达载体筛选出最佳的穿膜肽和使用方法;利用EGfP和分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phos-phatase,SEAP)表达载体对转染所用孵育Buffer、转染后换液时间、转染后悬浮时间、悬浮培养基的选择和p DNA最佳浓度等条件进行优化。2.双顺反子载体优化:构建含不同前导(Leader)序列的双顺反子载体,转染hek293f细胞,利用荧光显微镜、流式细胞术、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immune,ELISA)、蛋白质印迹法(Western blot)、化学发光仪对不同的目的基因进行定量或定性分析,筛选出可以显著增强表达的Leader和载体构建最佳方法。优化双顺反子抗体表达载体并利用上面得到最佳优化方案进行阿达木单抗表达。3.重组蛋白的表达的工艺优化:在最佳转染条件的基础上通过低温培养、小分子添加剂使用、基因递送载体优化等相结合的手段进一步提高SEAP、HSA、IL-6等重组蛋白的表达。结果1.筛选到了最佳的共转载体p STAB-SV40,可提高EGfP表达水平3倍以上(Phek293f细胞表达系统成功表达了HSA、IL-6、SEAP等重组蛋白。以IL-6为例,在最佳转染条件的基础上通过共转载体、DLR8增强转染、丁酸钠添加使IL-6的体积产量分别提高了2.26倍、3.58倍、5.26倍(Phek293f瞬时表达系统,成功表达了SEAP、IL-6、HSA、阿达木单抗等重组蛋白。

关键词：重组蛋白 hek293f 共转染工艺优化瞬时基因表达

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CD137L融合蛋白真核表达载体的构建与表达

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药物生物技术 2021年第3期28卷 233-238页

作者：徐胜王淑珍中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京211198

真核表达系统因具有完整的翻译后修饰、表达蛋白免疫原性较小而成为制药行业生产蛋白药物的新方向。该研究目的是构建CD137L融合基因真核表达载体,瞬时转染hek293f细胞实现高效表达并进行蛋白纯化与活性分析。以该实验室保存的含有CD137... 详细信息

真核表达系统因具有完整的翻译后修饰、表达蛋白免疫原性较小而成为制药行业生产蛋白药物的新方向。该研究目的是构建CD137L融合基因真核表达载体,瞬时转染hek293f细胞实现高效表达并进行蛋白纯化与活性分析。以该实验室保存的含有CD137L融合基因的质粒p ET11a-fP为模板,采用PCR技术在目的基因N端添加长腹水蚤荧光素酶信号肽和Kozak基因序列、C端添加6×His纯化标签,使用XbaⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶酶切并插入pc DNA3.1(+)载体,并对其进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂PEI将构建成功的pc DNA3.1-fP真核表达质粒瞬时转染进入hek293f细胞,对转染复合物比例及表达时间等参数进行优化。SDSPAGE电泳和Western印迹检测结果表明每毫升细胞转染1.5μg质粒和7.5μg转染试剂、表达4 d时融合蛋白表达水平最高。镍柱亲和纯化结果显示,每升培养基上清可以纯化获得1 mg目的蛋白,功能活性分析表明CD137L融合蛋白能够有效激活人PBMC细胞增殖和抑制人HUVEC细胞的生长。综上所述,该研究成功构建了CD137L融合基因的真核表达载体并在hek293f细胞中实现了分泌表达,为该融合蛋白的进一步稳定表达、大规模放大和成药性研究奠定了基础。

关键词： CD137L 融合蛋白真核表达瞬时转染 hek293f 蛋白纯化信号肽

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