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白藜芦醇对镉诱导hek 293t细胞自噬与凋亡的影响

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复旦学报（自然科学版） 2022年第1期61卷 52-60页

作者：王芸芸刘小綪邵峦峦杨颖蒋琦辰毛伟平南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学重点实验室江苏南京210046

为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(hek 293t)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以hek 293t细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫... 详细信息

为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(hek 293t)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以hek 293t细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫印记分析检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、溶酶体标志蛋白cathepsin L、组蛋白去乙酰化酶相关蛋白SIRt1和凋亡蛋白caspase-3的表达水平,激光共聚焦检测细胞自噬质粒(GFP-LC3)和溶酶体相关膜蛋白结合因子(LAMP2)的表达量,同时检测活性氧(ROS)水平,倒置相差显微镜和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示:白藜芦醇进一步增强镉诱导hek 293t细胞的自噬,且这种效应发生在自噬体溶酶体融合之前,其作用原理可能与白藜芦醇的抗氧化性有关并与SIRt1基因有密切联系,以上结果说明白藜芦醇对镉诱导的细胞自噬有一定的调控作用,此外,细胞凋亡与自噬之间关系紧密,白藜芦醇可抑制镉诱导的细胞凋亡。

关键词：白藜芦醇镉 hek 293t细胞自噬细胞凋亡

慢病毒载体介导的外源基因在hek-293t细胞中的稳定高效表达

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慢病毒载体介导的外源基因在HEK-293T细胞中的稳定高效表达

作者：颜仁和南方医科大学

学位级别：硕士

基因工程(gene engineering)诞生于20世纪70年代,是指在体外将不同来源的基因分子插入病毒、质粒或其他载体分子,构成遗传物质的新组合,然后将其导入到合适的宿主细胞内,从而使得外源基因在其中“安家落户”并能持续稳定的繁殖,以及在... 详细信息

基因工程(gene engineering)诞生于20世纪70年代,是指在体外将不同来源的基因分子插入病毒、质粒或其他载体分子,构成遗传物质的新组合,然后将其导入到合适的宿主细胞内,从而使得外源基因在其中“安家落户”并能持续稳定的繁殖,以及在新的遗传背景下实现功能表达和产生人类所需要的蛋白质。利用基因工程表达功能蛋白和一些具有重要研究价值的蛋白是基因工程的重要内容,目前利用基因工程表达外源蛋白的研究已经被广泛应用在卫生保健、科学研究和工业等各个不同的领域。外源蛋白的主要表达系统包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。每种表达系统有其各自的优点,同时在重组蛋白生产的种类、数量以及操作的简易性和生产成本等方面也有各自的制约。大肠杆菌表达系统是最古老的、应用最广泛的一种原核表达系统。它的优点是人们对它的背景研究最透彻、操作方便、生产成本低和重组蛋白产量高。但它也有明显的缺点,例如缺乏真核系统转录及翻译后的表达修饰加工功能,所生产的蛋白活性差,常以不溶性的包涵体形式表达,且其细胞周质内含有种类繁多的内毒素。酵母表达系统不仅具有原核表达系统生长迅速和表达量高的特点,同时还有蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等的功能。其缺点是在表达外源基因时常常会造成产物蛋白的不均一、降解和信号肽加工不完全等问题。且它只具有真核生物表达系统的部分加工修饰功能,无法加工修饰结构复杂的外源蛋白。昆虫细胞表达系统由于其表达量高且具有比较完善的蛋白翻译后加工修饰功能,正被广泛应用于复杂生物蛋白的生产。但其糖基化的寡糖链与哺乳动物细胞系统有所差别,不能正确的修饰加工复杂哺乳动物蛋白的N-糖基化,且操作繁琐、培养成本较高。相反的,哺乳动物细胞表达系统则很好地克服了上述各载体的缺点,具有非常完善的糖基化修饰功能和折叠机制,可以理想地对表达的蛋白进行翻译后加工、修饰并分泌到细胞外,相对于原核、酶母及昆虫细胞等表达系统,哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白活性更接近于天然蛋白,更适合于各种生物蛋白的表达。因此,哺乳动物细胞表达系统有望成为理想的真核生物蛋白表达系统,尽管其也存在一些缺点,如蛋白表达量低、基因表达调控复杂、花费时间长且成本更高等。外源蛋白的有效表达需要选择合适的表达系统,同时必须考虑蛋白结构复杂程度、技术条件、实验要求等因素。哺乳动物细胞表达系统虽然表达量低,但因其能正确表达出活性接近天然蛋白的结构复杂的外源蛋白,因此成为目前蛋白生产系统发展的主流方向。而哺乳动物细胞表达系统应用于表达外源蛋白的一个关键步骤就是获得一个能稳定高效表达外源基因的克隆。目前将外源基因导入细胞主要有两种方法,一种就是利用化学方法(比如脂质体、磷酸钙、PEI等)或物理方法(例如显微注射、电穿孔等)通过瞬时转染直接将DNA导入细胞;另一种就是利用病毒载体感染介导外源基因进入细胞,如慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等。瞬时转染方法通常表达效率低、成本高且整合基因不稳定,外源基因有可能随细胞分裂而逐渐丢失,目的蛋白的表达时限短暂。而病毒载体如慢病毒载体介导的感染通常表达效率高且外源基因能与细胞基因组发生重组,从而实现目的蛋白的持久、稳定表达。慢病毒载体(Lentiviral vector, LV)是逆转录病毒载体的一种亚型,是在HIV-1病毒基础上改建而来的病毒载体系统,能高效地将目的基因导入动物或人的原代细胞或细胞系中。慢病毒载体基因组是正链RNA,其基因组进入细胞后,能在反转录酶及整合酶的作用下将病毒RNA反转录为DNA并整合到细胞基因组中。整合后的DNA在细胞中转录成mRNA,回到细胞浆中,翻译目的蛋白。慢病毒载体能有效感染并整合到分裂及非分裂细胞中,包括脑细胞、肝细胞、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。慢病毒载体介导的基因表达持续且稳定,原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因组的分裂而分裂。目前,病毒载体已成为动物体内及体外表达外源基因的有力工具,慢病毒载体在人类细胞系中已经被成功应用于生产百毫克级别的有活性的外源蛋白。而要利用慢病毒载体在hek 293t细胞中高效稳定表达外源活性蛋白并以此为工具探索重组蛋白生产技术,建立快速生产平台,我们需要选择一个合适的慢病毒载体,然后利用这个载体携带外源基因在hek-293t细胞中表达,并检测其表达水平及稳定性。综上,本文分为两部分,第一部分通过比较包含不同表达元件的慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白GFP在hek-293t细胞中的表达水平及稳定性,筛选一个合适的慢病毒载体。第二部分通过将丙型肝炎病毒(HCV)E1基因克隆到慢病毒表达载体中,并包装成慢病毒感染hek-293t细胞后筛选单克隆细胞系,并检测E1蛋白表达水平及稳定性来检验这个慢病毒载体表达结构复杂蛋白的能力,探索重组蛋白生产技术,建立快

关键词：慢病毒载体 hek 293t细胞蛋白表达 UCOE 绝缘子启动子丙型肝炎病毒E1基因

人源WNt16 hek 293t稳转细胞株构建、蛋白纯化与活性检测方法研究

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四川医学 2023年第12期44卷 1233-1238页

作者：王克芬陈海迪章嘉成周鑫邓成武永康四川大学华西医院实验医学科前沿医学疾病分子网络前沿科学中心四川成都610044 四川大学华西金堂县第一人民医院四川成都610499

目的无翅型MMtV整合位点家族成员16(WNt16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNt16基因的hek 293t细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-tag)实现高效纯化WNt16蛋白。方法使用tK-PCDH-copGFP-... 详细信息

目的无翅型MMtV整合位点家族成员16(WNt16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNt16基因的hek 293t细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-tag)实现高效纯化WNt16蛋白。方法使用tK-PCDH-copGFP-t2A-Puro载体,将WNt16 CDS-HIS序列通过XbaI和BamHI位点连接载体,构建慢病毒载体质粒;将该质粒与pSPAX2和pMD2.G一起共转染hek 293t细胞,制备携带WNt16基因的慢病毒;利用慢病毒感染hek 293t细胞,并通过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定稳定过表达WNt16的细胞株;利用镍螯合琼脂糖凝胶与HIS标签的高亲和性纯化WNt16蛋白,使用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测纯化效果;用纯化的WNt16蛋白刺激Jurkat细胞,使用Western Blot法检测Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,以评估WNt16蛋白的活性。结果成功构建过表达WNt16基因的慢病毒表达载体,并用其感染hek 293t细胞。经过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定,我们获得了稳定表达WNt16的hek 293t细胞株。使用HIS标签成功纯化了WNt16蛋白,并用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测了纯化效果。最后,我们用纯化的WNt16蛋白刺激Jurkat细胞,并用Western Blot法检测了Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,WNt16蛋白能够显著增加Jurkat细胞中β-catenin蛋白的表达,表明纯化的WNt16蛋白具有激活WNt/β-catenin通路的生物学活性。结论本研究成功实现了WNt16蛋白的高效表达和纯化,并初步研究了其功能。这为进一步探究WNt16在细胞生物学中的作用提供了重要的实验基础。

关键词： WNt16 hek 293t细胞过表达稳转细胞株纯化 HIS标签

人γ干扰素转座子质粒构建及其在hek293t细胞中的表达

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生物技术 2021年第6期31卷 521-526,572页

作者：陈秋玉徐闰刘灵康韦茏芹吴文德郑喜邦李恭贺广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 湖北天勤生物科技有限公司武汉分公司湖北武汉433025

[目的]克隆人γ干扰素(hIFNγ)基因,借助自剪切肽P2A,构建hIFNγ-P2A-RFP(红色荧光蛋白)融合基因转座子表达载体,并在hek293t细胞中检测其表达水平。[方法]首先,以脂多糖(LPS)激活人外周血淋巴细胞,提取总RNA,经Rt-PCR扩增hIFNγ基因;... 详细信息

[目的]克隆人γ干扰素(hIFNγ)基因,借助自剪切肽P2A,构建hIFNγ-P2A-RFP(红色荧光蛋白)融合基因转座子表达载体,并在hek293t细胞中检测其表达水平。[方法]首先,以脂多糖(LPS)激活人外周血淋巴细胞,提取总RNA,经Rt-PCR扩增hIFNγ基因;再通过重叠延伸PCR,获得hIFNγ-P2A-RFP融合基因,并将其插入PB002G转座子载体。经双酶切和DNA测序鉴定,将重组质粒转染hek 293t细胞,荧光显微镜观察RFP表达,Western Blotting检测hIFNγ蛋白表达。[结果]克隆了hIFNγ基因,成功构建了PB-hIFNγ-P2A-RFP重组质粒;荧光显微镜观察发现RFP在hek 293t细胞表达,转染效率达39.3%;Western Blotting检测显示,特异性蛋白条带约为21 kDa,与预期的hIFNγ蛋白大小一致。[结论]成功构建了人γ干扰素PB转座子真核表达质粒,该质粒在hek 293t细胞中高效表达。

关键词：人γ干扰素重叠延伸PCR 自剪切肽P2A PiggyBac转座子 hek 293t细胞

重金属基因编码荧光探针的构筑、表征及生物成像研究

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重金属基因编码荧光探针的构筑、表征及生物成像研究

作者：韦柳丹南宁师范大学

学位级别：硕士

随着工农业飞速发展,重金属污染事件屡见不鲜,严重威胁着公民的身心健康,尤其是以Hg、Cd、Pb等为首的重金属离子对生命体的危害最为严重。目前,关于重金属离子Hg、Cd、Pb胁迫的整体细胞毒性的详细机制尚未完全阐明。因此,构筑高灵敏性... 详细信息

随着工农业飞速发展,重金属污染事件屡见不鲜,严重威胁着公民的身心健康,尤其是以Hg、Cd、Pb等为首的重金属离子对生命体的危害最为严重。目前,关于重金属离子Hg、Cd、Pb胁迫的整体细胞毒性的详细机制尚未完全阐明。因此,构筑高灵敏性、高选择性、高时空分辨的荧光探针实时原位的监测有毒重金属离子,并从细胞水平上解读其中毒的化学机理和细胞自我保护应激调节机制至关重要。根据以上研究的需求,本论文依据Mer R家族金属调控蛋白及其与目标金属离子结合后复合物的的三维空间结构信息,选取了金属离子结合的关键结构功能区域的残基进行拼接,构建了仍然能够与金属离子Hg、Cd保持原有配位构型结合的金属结合肽。随之把该小肽嵌入到荧光蛋白桶状结构的loop环中,旨在利用构建的金属结合肽对目标金属离子优异的结合性能以及与目标金属离子结合后诱导的构象变化,并将该构象变化的能量信息有效转化为与之偶联的荧光蛋白荧光强度的可视化信息,实现不同感应机理的基因编码荧光探针的高效设计。具体研究的工作内容和研究成果如下:（1）基于以上方法策略,我们设计了用于检测Hg的基因编码荧光探针SFGFP-MerBD。首先,我们利用分子克隆技术进行了荧光探针SFGFP-MerBD重组质粒载体的构建以及优化,并通过SDS-PAGE表征探针蛋白的表达量,证明了构建的荧光探针可在细菌体内大量表达。其次,对纯化后的蛋白进行了一系列体外性能表征实验。对于荧光探针灵敏性和选择性表征实验,第一,通过设计的探针和骨架蛋白SFGFP响应Hg的荧光强度变化发现,只有插入MerBD小肽的荧光探针能够响应Hg,并且灵敏性响应Hg的检测范围为1.26 n M～2500 n M,在一定范围荧光猝灭效率和Hg浓度对数呈线性关系。第二,通过Hg与一些主族金属离子和过渡金属离子的竞争实验分析发现,该探针对Hg有强的特异性,并能抵抗其他金属离子的干扰。第三,通过荧光探针的竞争性紫外滴定实验,拟合了Hg结合探针后引起荧光猝灭的亲和力常数,Kd为2.00±0.08×10M。对于荧光探针响应Hg机理的表征实验。第一,通过对金属离子结合位点的突变实验以及对紫外光谱波长230 nm～290 nm范围的观察,证明了荧光探针上的金属结合肽MerBD与Hg仍然保持着特殊的三角配位构型环境。第二,紫外可见分光光度计和圆二色光谱在波长340nm～520 nm范围内的对比分析发现,随着蛋白溶液中Hg浓度的增加,改变了质子化和去质子化荧光蛋白生色团的相对比例。并且在CD光谱波长范围内发现椭圆率显著增加。以上确切地表明了Hg结合金属离子结构域成功引起小肽的构象变化,并且把该构象变化有效传递到SFGFP的β-桶结构,从而实现高灵敏性的检测Hg。第三,通过高灵敏度稳瞬态荧光光谱仪表征证明了,加入Hg对荧光寿命影响不大,属于静态猝灭过程。最后,对荧光探针细胞内成像的研究实验,结果表明了所设计的荧光探针可以动态、可逆、快速地响应细胞环境中Hg浓度的变化。（2）结合汞离子荧光探针的设计经验,我们设计了用于检测Cd的基因编码荧光探针SFGFP-CadBD。首先,我们利用分子克隆技术进行了荧光探针SFGFP-CadBD重组质粒载体的构建,并通过SDS-PAGE表征证明了该荧光探针可以在细菌内大量表达,并且常温下便能有效折叠产生绿色荧光。其次,对纯化后的蛋白进行了一系列体外性能表征实验。第一,通过荧光可见分光光度计表征设计的探针和骨架蛋白SFGFP响应Cd的性能对比,充分证明设计的探针响应Cd主要是由于插入小肽CadBD引起的。检测Cd的浓度范围为0.1μM/L～24μM/L。第二,通过对结合位点的突变,发现任何单突变后响应Cd的荧光强度都有不同程度的下降。同时,加入Cd后,紫外光谱波长200 nm～280 nm范围内也出现相应波谱峰被抬高。如此更确切地说明了四个结合位点仍然保持原构型参与金属离子Cd的配位。第三,在加入20μM高浓度单金属时,设计的探针不仅能够猝灭Cd,对Cu、Fe、Ni、Hg也有一定响应。推测原因为构建的金属结合肽由于缺少位点site II的协同作用,而导致荧光探针选择性与原本的Cad R存在差异。因此,对于满足该探针SFGFP-CadBD响应金属离子Cd的特异性方面,还有很大优化空间。最后,通过体外表征筛选而获得的荧光探针成功在hek 293t细胞中成像,并且可以指示细胞内存在的Cd浓度变化。本研究建立了基于蛋白质三维空间结构高效设计基因编码荧光探针的新策略,为更多以蛋白质精细空间结构为导向的基因编码荧光探针的理性设计提供理论基础及实验依据,同时为重金属离子Hg、Cd、Pb亚细胞结构水平的荧光成像及动态信息的定位追踪增添新利器。

关键词：重金属污染基因编码类荧光探针 hek 293t细胞

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玻连蛋白的克隆和纯化及其生物学活性验证

玻连蛋白的克隆和纯化及其生物学活性验证

作者：黄书贵电子科技大学

学位级别：硕士

玻连蛋白(VtN)是存在于人体血浆及细胞外基质中分子量为75 k Da的多功能糖蛋白,在血浆内的含量较高,正常为200-400 mg/L。人体内的玻连蛋白分子主要在肝脏内合成,之后被转运到各个器官和组织。VtN含有RGD整合素结合结构域,能介导细胞的... 详细信息

玻连蛋白(VtN)是存在于人体血浆及细胞外基质中分子量为75 k Da的多功能糖蛋白,在血浆内的含量较高,正常为200-400 mg/L。人体内的玻连蛋白分子主要在肝脏内合成,之后被转运到各个器官和组织。VtN含有RGD整合素结合结构域,能介导细胞的粘附和迁移,除此之外它还能与多种细胞因子结合,能够发挥多种生理作用,在血管再生、肿瘤发展、凝血、体液免疫等多种生理进程中发挥重要作用。在体外的细胞培养中VtN常常作为促进细胞贴壁和生长的成分加入无血清培养基中,能够促进多种细胞的生长和分化。天然血清来源的VtN的纯化主要靠肝素亲和层析等方法,但是来源有限且价格昂贵。通过体外细胞培养的方式表达VtN是现在科研中VtN的主要来源,并且已开发了多种VtN表达细胞株和纯化方式,实现了VtN完整重组蛋白或其部分功能片段在大肠杆菌、哺乳动物细胞、烟草等多种细胞或有机体内的表达,但尚未见到用hek 293t细胞表达完整VtN的论文出现。本实验分别尝试了用hek 293t细胞、CHO细胞和大肠杆菌表达重组VtN,重点探究了用hek 293t细胞表达玻连蛋白的条件和方法。通过磷酸钙DNA共沉淀的瞬时转染法,将含有VtN分子编码序列的cDNA片段与pEXL-FtH-GFP或pcDNA3.1-YFP质粒载体重组并转染293t细胞,在转染后2-3天收获细胞培养液并离心,利用VtN上的组氨酸标签可以与镍柱特异性结合的原理将其纯化,之后通过SDS-PAGE、Western Blot检测,发现VtN得到表达,用紫外分光光度计检测浓度,得出细胞培养液中VtN浓度约为20.62mg/L。接着对产物进行了透析及真空冷冻干燥等进一步的纯化操作。对纯化产物进行功能验证,发现所克隆的VtN分子有生物学活性,具有促进细胞贴壁生长和增殖的功能。

关键词：玻连蛋白分子克隆 hek 293t细胞蛋白纯化

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HIV-vif基因的RNA干扰试验研究

HIV-vif基因的RNA干扰试验研究

作者：江雪艳复旦大学

学位级别：硕士

随着人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人数的增加,艾滋病的流行已经给国家经济和社会带来了巨大负担。但目前的抗病毒药物无法给患者提供彻底的治疗,因此更多的研究开始转变以往的治疗思路,探索新的更有效更经济的艾滋病治疗方法。RNAi(RNA in... 详细信息

随着人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人数的增加,艾滋病的流行已经给国家经济和社会带来了巨大负担。但目前的抗病毒药物无法给患者提供彻底的治疗,因此更多的研究开始转变以往的治疗思路,探索新的更有效更经济的艾滋病治疗方法。RNAi(RNA interference,RNA干扰)研究的出现,为HIV的抑制及治疗提供了一种新的尝试。RNAi干扰效应是指双链RNA在生物细胞内对序列特异性基因转录和表达的抑制作用。RNAi的研究为控制HIV感染带来希望,通过SiRNA对病毒生活周期的多个水平作用,可显著抑制病毒的复制。目前已有研究报道了通过对HIV-1 gag,tat,rev和宿主CD4及CCR5受体进行RNA干扰,进而达到抑制HIV病毒复制的目的,并且研究取得了一定的进展,为抗HIV治疗开辟了一条新路。HIV-1的特点之一是具有多个调节基因,这些基因可编码相应的调控蛋白,如Nef、tat、Rev、Vif、Vpr、Vpx、Vpu等,它们在RNA转录、转录后加工、蛋白质翻译直到病毒颗粒从细胞膜释放的过程中发挥重要的调节作用。Vif蛋白被归于附属蛋白质,编码一个含有192个氨基酸,相对分子质量大约23000的胞质蛋白,vif基因比HIV-1基因组中env、gag等突变率高的基因相对保守。但10多年前就已经知道Vif是HIV-1感染所必须的调控蛋白,vif基因缺陷性(△vif)的HIV-1和SIV在体内无法复制,在体外虽可正常复制并产生病毒颗粒但其感染性比野生型降低近1000倍以上。vif缺陷性的病毒颗粒在形态学上也表现异常。在子弹头状病毒核心的电子密集物质明显减少,而核心与包膜之间的空间里电子密集物质明显增加,使核心形状呈多样化。另外,在感染细胞中的反转录过程以及病毒颗粒中的内源性反转录也是明显受损,因而不能感染靶细胞。有趣的是,vif缺陷性的病毒在一些肿瘤细胞系可以顺利的进行复制。根据△vif HIV-1是否能够在其内复制可将细胞分为“允许细胞”和“非允许细胞”。△vif HIV-1病毒可以进入非允许细胞中,但在反转录过程中或反转录之后到整合之前由于某种尚不清楚的机制导致感染终止。早期研究发现,除了感染性降低1000倍以上外,△vif HIV-1同野生型HIV-1相比较,二者在RNA结构及蛋白表达等方面均未发现任何差别。近期由于载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein B mRNAediting enzyme catalytic polypeptide like 3G,APOBEC3G)的发现以及对APOBEC3G与Vif相互作用机制的深入研究,使越来越多的研究者开始重视vif基因及其表达产物在HIV生命周期中的作用。经过科研人员数年的努力,现在RNA干扰的机制已经得到比较清楚的阐述。RNAi是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制,是指内源性或外源性大约为21～23bp的核苷酸与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)在细胞内特异地降解该mRNA,从而致使特异性的基因有效封闭的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PtGS)。RNAi作为一种简单、快速、特异、高效、经济、效果可预测的技术,具有明显的优点,它比反义核酸技术优越,比基因敲除简单,具有很好的应用前景。具体可用于基因功能分析、研究信号传导通路的新途径、新药物的研究和开发、基因治疗、病毒感染治疗以及肿瘤治疗等各个方面。作为一种新的基因治疗药物,SiRNA可作为已有抗HIV病毒药物的辅助治疗,与其它抗病毒药物不会互相产生干扰,效果更好,相信随着对RNAi机制的进一步认识,这一技术能够成为抗病毒,特别是抗HIV感染的有力武器。因此本研究选择HIV-1 vif基因作为RNAi的靶目标,通过设计针对vif的特异性SiRNA对HIV病毒RNA进行干扰降解,进而达到降低或抑制病毒复制的目的。研究中我们成功的设计了3段vif特异性SiRNA,对转接入pEGFP-N1质粒中的vif基因进行干扰,并分别在核酸和蛋白水平进行了验证,结果证明了RNAi可以有效且特异性的下调Vif蛋白的表达。本课题的研究目的就是利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录水平进行下调,达到抑制Vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。研究首先选择人胚肾293t(hek 293t)细胞作为宿主细胞,EGFP融合蛋白作为报告基因,观察HIV-1 Vif蛋白在细胞内的表达情况,为后续的RNAi做好准备。第一部分先建立pEGFP-N1-vif融合质粒,进行hek 293t细胞转染,荧光显微镜观察转染细胞

关键词：人类免疫缺陷病毒(HIV) 艾滋病 vif(基因) vif(蛋白) RNAi SiRNA hek 293t细胞 pEGFP-N1质粒

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亮氨酸调节自噬的信号通路研究

亮氨酸调节自噬的信号通路研究

作者：朱娅琴华中农业大学

学位级别：硕士

本试验旨在研究亮氨酸对细胞自噬水平的调节,及其调节是否依赖雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mtOR)信号通路,以及亮氨酸的信号传递到自噬相关蛋白是否必须通过mtOR上游调节蛋白中的Rheb、Raptor或GβL,为开展营养素感... 详细信息

本试验旨在研究亮氨酸对细胞自噬水平的调节,及其调节是否依赖雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mtOR)信号通路,以及亮氨酸的信号传递到自噬相关蛋白是否必须通过mtOR上游调节蛋白中的Rheb、Raptor或GβL,为开展营养素感应的信号通路的深入研究提供策略。本试验主要包括三部分：(1)培养人胚肾细胞(hek 293t),进行时间梯度(0h,0.5h,1h,2h,4h)亮氨酸饥饿后透射电镜观察是否产生自噬泡及其产生的规律,并运用western blot方法检测LC3-Ⅱ和p62的表达丰度变化规律。将LC3-GFP表达质粒转染至hek 293t细胞中表达,对细胞进行时间梯度(0h,0.5h,1h,2h,4h)亮氨酸饥饿后共聚焦显微镜观察荧光分布规律。(2)在0.5h,1h,2h,4h中选取自噬最明显的两个时间点(2h,4h),将细胞进行亮氨酸饥饿,以及有、无雷帕霉素(RAPA)存在条件下亮氨酸饥饿后重新补充亮氨酸,分别检测LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的表达丰度。(3)运用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术分别干扰ntOR信号通路中的Rheb、Raptor或GβL表达后,在0.5h,1h,2h,4h中选取自噬最明显的两个时间点(2h,4h),将细胞进行亮氨酸饥饿及饥饿后重补充,检测LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的表达丰度。研究结果如下：(1)亮氨酸饥饿0h的细胞未观察到自噬泡,LC3-GFP的荧光弥散分布于整个细胞胞浆。亮氨酸饥饿0.5h即产生了自噬泡,LC3-GFP的荧光也由弥散分布于胞浆转变为部分聚集状态。在4h内,自噬泡和LC3-GFP的荧光聚集程度随亮氨酸饥饿时间延长而增加,4h达到顶峰。Oh未检测到LC3-Ⅱ的表达,p62的表达量是所有时间点中最高的。亮氨酸饥饿0.5h后,LC3-Ⅱ的表达丰度呈极显著增加(P0.05),pS6K1的表达丰度呈极显著降低(P0.05)。Leu饥饿时间为4h时,LC3-Ⅱ、p62和pS6K1的丰度变化趋势与2h时一致。(3)干扰Rheb或Raptor后,亮氨酸饥饿2h与饥饿后重新补充的结果相同。相对于0h组,LC3-Ⅱ的表达丰度均呈极显著增加(P细胞产生自噬,且自噬在一定时间内随饥饿时间的延长而加剧。重新补充亮氨酸能缓解自噬,并且这种缓解作用依赖于mtOR信号通路。Rheb和Raptor是mtOR上游调节蛋白中传递亮氨酸信号的关键因子,是连接亮氨酸和细胞自噬的串联桥梁。GβL不是亮氨酸信号传递至自噬所必需的。

关键词：自噬亮氨酸 mtOR Rheb Raptor hek 293t细胞

外源mmu-miR-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究

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外源mmu-miR-505在哺乳动物细胞中的表达及功能研究

作者：马骁骁东华大学

学位级别：硕士

目的：miRNA是一类长约22 nt具有调节功能的保守的非编码小RNA,在调控发育时序,细胞增殖与凋亡以及肿瘤发生中起着重要的作用。同时miRNA也参与了神经细胞的自我更新、脊椎动物的发育、心脏、肌肉以及神经系统的形成等多种生物学过程和... 详细信息

目的：miRNA是一类长约22 nt具有调节功能的保守的非编码小RNA,在调控发育时序,细胞增殖与凋亡以及肿瘤发生中起着重要的作用。同时miRNA也参与了神经细胞的自我更新、脊椎动物的发育、心脏、肌肉以及神经系统的形成等多种生物学过程和信号通路。哺乳动物的雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin, mtOR)是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,具有多种生物学功能,与蛋白质合成、免疫、细胞运动及代谢、细胞凋亡及自噬等均有联系。通过查阅文献我们发现miRNA-505也许通过影响ASF/SF2的表达,而参与调控mtOR通路。为了进一步研究miRNA-505的生物学功能,我们分别利用质粒pcDNAtM6.2、慢病毒载体FUGW及Fsy,构建了在哺乳动物细胞中表达miRNA-505-3p,-5p的载体,它们分别受到病毒来源启动子CMV(巨细胞病毒)、哺乳动物细胞内源性启动子UBC(泛素酶)及神经元特异性启动子Syn(突触蛋白Ⅰ)调控,以获得具有不同表达效率及组织特异性的载体。脂质体法将重组质粒转染至原代培养的神经元细胞与hek 293t等细胞系中,检测细胞中miRNA-505的表达量与相关蛋白ASF/SF2的变化。方法：将miR-505-3p与miR-505-5p成熟体分别构建成sh R N A形式,装入pcDNAtM6.2-GW/ EmGFP-miR表达载体中,采用PCR方法从pcDNAtM6.2-GW/ EmGFP-miR-505-3p,5p表达载体质粒扩增出miR-505-3p/5p shRNA基因编码区173bp、175bp片段,通过限制性酶切、t4 DNA连接酶连接,分别将miR-505-3p,5p shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与Fsy中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p。在脂质体介导下将构建成功的慢病毒载体转染至原代培养的神经元细胞和hek 293t等细胞系,荧光显微镜下观测EGFP的表达,流式细胞仪监测转染效率,Rt-PCR方法检测细胞中miR-505的表达量。western blot方法检测细胞中相关蛋白ASF/SF2的变化。结果：1、成功构建带有miRNA-505 shRNA基因片段的四种慢病毒载体FUGW-miR-505-3p, FUGW-miR-505-5p, Fsy-miR-505-3p和Fsy-miR-505-5p。2、荧光显微镜下观察到,慢病毒载体Fsy-miR-505转染的原代培养的神经元中EGFP荧光强度较高;hek 293t细胞系中,重组质粒总体转染效率较高,FUGW-miR-505转染的细胞EGFP荧光强度最高,Fsy-miR-505转染的细胞EGFP荧光强度最弱。3、实时荧光定量PCR结果显示,转染pcDNA-miR-505-3p、 FUGW-miR-505-3p与Fsy-miR-505-3p的细胞中miR-505-3p增多;转染pcDNA-miR-505-5p、FUGW-miR-505-5p与Fsy-miR-505-5p的细胞中miR-505-5p明显增多。4、Western blot结果显示,共转染miR-505-3p表达质粒和ASF/SF2表达质粒的细胞中ASF/SF2蛋白降低。结论：结果表明Fsy-miR-505-3p/5p在原代培养的神经元细胞中特异性表达,而在hek 293t等细胞系中表达比其他两种质粒FUGW-miR-505-3p/5p、pcDNA-miR-505-3p/5p低;Western blot结果表明在Hela细胞中miR-505-3p抑制ASF/SF2蛋白的表达,从而说明ASF/SF2是miR-505-3p的一个靶蛋白。

关键词： mmu-miR-505 ASF/SF2 细胞转染 hek 293t细胞