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作者：伍琳华东师范大学

学位级别：硕士

当细胞受到体外或者体内的氧化物质刺激时,会产生一系列变化,并生成活性氧(ROS)。活性氧是机体正常代谢的副产物,当其产生过量时便会对细胞造成损伤,包括损伤蛋白质、核酸、细胞膜等。一定程度的氧化损伤累积可以诱发相关疾病,如：动脉... 详细信息

当细胞受到体外或者体内的氧化物质刺激时,会产生一系列变化,并生成活性氧(ROS)。活性氧是机体正常代谢的副产物,当其产生过量时便会对细胞造成损伤,包括损伤蛋白质、核酸、细胞膜等。一定程度的氧化损伤累积可以诱发相关疾病,如：动脉粥样硬化、肺纤维化、癌症、神经退行性疾病和衰老等等。研究表明,蛋白质是细胞氧化损伤最直接的作用对象,它与氧化自由基作用的几率大约是核酸的20倍。因此细胞内的抗氧化机制,很大程度上是发生在蛋白水平的。细胞内主要的抗氧化损伤机制应该是从清除过量的氧化损伤蛋白质着手。而据文献报道,20S蛋白酶体在降解氧化损伤蛋白质过程中起到了十分重要的作用。种11S蛋白酶体调节因子(REGy/PA28y)被报导参与调节20S蛋白酶体以一种非泛素和ATP依赖的方式降解蛋白质。我们的研究发现,一定浓度的H2O2处理HeLa细胞时,p21的蛋白质水平会迅速降低,而其mRNA水平却基本没有变化。而在稳定敲除REGy的HeLa细胞系中,氧化处理之后,p21的蛋白水平几乎没有变化。用不同浓度及不同种类的氧化剂处理也可以得到类似的结果,这说明REGy在氧化的p21蛋白质降解过程中起着十分重要的作用。因此,本文对REGy这种介导氧化蛋白降解的作用进行了进一步的研究和探索,通过对REGy介导降解的另一种目的蛋白——丙型肝炎病毒核心蛋白(hcv core)进行氧化处理研究,也发现了同样的趋势。本文构建了hcv core的表达载体质粒,转入稳定敲除REGy以及不敲除(对照组)的HeLa细胞系中表达,经过氧化处理后,发现其降解趋势和p21一致。此外,在一组REGy无功能和正常功能的细胞系中,REGy正常功能的细胞中hcv core经氧化应激后也表现出了REGy依赖降解的现象,而氧化应激对REGy无功能细胞中hcv core的表达几乎无影响。这些现象说明,REGγ在氧化损伤蛋白的清除过程中十分重要。本文通过体外降解、免疫共沉淀和胰蛋白酶样活性检测实验还证明：氧化应激在一定程度上增强20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性,并加强了REGγ与20S蛋白酶体的相互结合。另一方面,通过对细胞衰老凋亡标志蛋白的表达检测和细胞形态观察实验,也证实了氧化蛋白p21和hcv core的降解现象与细胞氧化引起的衰老和凋亡没有直接关系。这些结果以新视角补充了REGy对氧化损伤蛋白的调控机制。尽管我们对于氧化蛋白的清除机制并不十分清楚,还需要进一步的实验研究。但是,本文的研究方式和结果为氧化蛋白的降解提供了一条新的通路,也为氧化相关疾病的研究提供了理论依据。

关键词： REGγ 蛋白酶体 p21 hcv core 氧化应激

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hcv core protein enhancing negative regulator A20 expression and relevant mechanism study in macrophages

HCV core protein enhancing negative regulator A20 expression...

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第十届全国免疫学学术大会

作者： Xiaotian Song Zhiyan Yao Jianling Yang Zhengzheng Zhang Lin Wei Hebei Medical University

Aim:Hepatitis C virus(hcv)infection is characterized by a strong propensity toward chronicity.During chronic hcv infection,hcv core protein is implicated in dysregulating innate immune responses.Here we explore the effects of hcv core protein on macrophage and the potential signal pathways involved.Methods:Monocyte-derived human macrophage line(MΦ-THP-1)was treated with hcv core protein.The level of cytokines were determined by CBA and the changes of intracellular proteins were analyzed by Western blot.Lentivirus packaged short hairpin RNA were used to silencing A20 and g C1q R expression.Results:we demonstrated that hcv core protein induced macrophage A20 expression and IL-6,IL-1βand TGF-β1secretion.A20 is a powerful inhibitor of cytokine signaling.Silencing A20 dramatically enhanced the production of these cytokines.Additionally,Pull-down assay showed that hcv core protein could interact with g C1q R but not TLR2 and TLR4,and silencing g C1q R abrogated hcv core-induced A20 high expression,which suggested that hcv core protein promoted A20 expression in macrophage via combining with g C1q R.Moreover,we found that hcv core protein could induce phosphorylation of p38,JNK,ERK,NF-κB p65 and NF-κB p105 in macrophage.While inhibition of p38,JNK and NF-κB but not ERK activity significantly reduced A20 expression.Conclusion:These results suggest that hcv core/g C1q R ligation induces A20 expression in macrophage via p38,JNK and NF-κB pathways,which may lead to a low-grade chronic inflammation condition in host.It represents a novel mechanism by which hcv usurps the host for persistence.

关键词： hcv core Macrophage g C1q R Negative Regulator A20

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Hepatitis C virus core protein triggers expansion and activation of CD4＋CD25＋ regulatory T cells in chronic hepatitis C patients

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Cellular & Molecular Immunology 2015年第6期12卷 743-749页

作者： Naicui Zhai Xiumei Chi Tianyang Li Hongxiao Song Haijun Li Xia Jin Ian Nicholas Crispe Lishan Su Junqi Niu Zhengkun Tu Institute of Translational Medicine The First Hospital Jilin University Changchun China Department of Hepatology The First Hospital Jilin University Changchun China Institute Pasteur of Shanghai Chinese Academy of Sciences Shanghai China Department of Pathology University of Washington Seattle WA USA Lineberger Comprehensive Cancer Center School of Medicine University of North Carolina at Chapel Hill Chapel Hill NC USA

CD4＋CD25＋FoxP3 ＋ regulatory T ceils （Tregs） are increased in patients with chronic hepatitis C, which may contribute to the sustained suppression of hepatitis C virus （hcv）-specific T-cell responses and viral persistence in hcv-infected individuals. We postulated that hcv core protein （hcvc） directly contributes to the expansion of Tregs in hcv-infected patients, and we provide evidence to support this hypothesis in the report. Peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） and sera were collected from 87 treatment-naive chronic hcv-infected patients, CD4＋CD25＋ Tregs were measured by flow cytometry, and hcv RNA and hcvc levels were detected using qPCR and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）, respectively. CD4＋, CD8＋, CD4＋CD25＋ and CD4＋CD25- T cells were purified from healthy donors and cultured with recombinant hcvc and Toll-like receptor （TLR） ligands. Flow cytometry was used to analyze cell proliferation, and ELISA was performed to measure cytokine production. In the 87 chronic hcv-infected patients, hcvc showed a significant correlation with hcv RNA and CD4＋CD25＋Tregs. Mechanistic studies showed that hcvc, together with anti-CD3 antibody, augmented CD4＋CD25＋ Treg proliferation, but inhibited CD4＋CD25- T-cell proliferation and IFN-γ production, in a dose-dependent and Treg-dependent manner. Moreover, unlike the TLR3 ligand （poly hC） and the TLR4 ligand （lipopolysaccharide, LPS）, the TLR2 ligand （lipoteichoic acid, LTA） and hcvc both inhibited TCR-induced CD4＋ T-cell proliferation and IFN-γ secretion in a Treg-dependent manner. These data indicate that hcvc, like other TLR2 ligands, triggers CD4＋CD25＋ Treg activation and expansion to inhibit host immune responses, which may play a critical role in viral persistence in hcv-infected patients.

关键词： CD4＋CD25＋ regulatory T cells hcv core Toll-like receptor

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人类丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白12（HCBP12）的克隆表达与功能研究

人类丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白12（HCBP12）的克隆表达与功能...

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作者：李越大连医科大学

学位级别：硕士

研究背景与目的丙型肝炎病毒(hcv)感染所致丙型肝炎是慢性肝病及肝细胞癌(HCC)的原因之一;但迄今尚无疫苗和特异有效的治疗方式.深入研究丙型肝炎病毒的感染与致病机制具有重大的现实意义。在筛选了肝细胞内能与hcv core相互结合的蛋白... 详细信息

研究背景与目的丙型肝炎病毒(hcv)感染所致丙型肝炎是慢性肝病及肝细胞癌(HCC)的原因之一;但迄今尚无疫苗和特异有效的治疗方式.深入研究丙型肝炎病毒的感染与致病机制具有重大的现实意义。在筛选了肝细胞内能与hcv core相互结合的蛋白,并将其中一个在HCC中作用不清的新基因命名为hcv core结合蛋白12(HCBP12)的基础上,本研究拟通过亚细胞定位、原核表达、抗体制备和肝细胞内结合蛋白的筛选等几个方面初步阐释该基因在HCC发病过程中的生物学功能。方法1.构建重组绿色荧光表达载体pEGFP-C1-HCBP12,转染HepG2细胞,24hr后在荧光倒置显微镜下观察荧光情况。2.构建原核表达载体pET-32a(+)-HCBP12,转化BL21宿主菌后经IPTG诱导,获得了带有组氨酸标签的重组融合蛋白的优化表达,并用SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白的特异性进行分析和验证。然后利用Ni+亲和柱纯化表达蛋白并免疫新西兰兔,获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBP12为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。3.构建酵母细胞表达载体pGBKT7-HCBP12,转化AH109酵母菌株并获得表达,利用Western blot对表达蛋白进行验证。与含有肝细胞文库质粒的Y187酵母菌株配合,进行酵母双杂交,筛选与HCBP12具有相互作用的蛋白。结果1.细胞浆出现明显的绿色荧光信号,提示HCBP12主要定位于胞浆内。2.HCBP12融合蛋白在原核表达系统成功表达。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价>1:512,000, Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。3.HCBP12融合蛋白经Western blot验证在酵母菌株表达成功。利用酵母双杂交技术筛选出12个与HCBP12相互作用的蛋白,其中包括人类载脂蛋白C-I/B、人类线粒体蛋白、人类金属硫蛋白2A、人类β-2微球蛋白、人类羧酸脂酶4和人类丝氨酸肽酶抑制剂等已知功能蛋白及1个未知功能蛋白。将新基因提交GenBank数据库,并命名为HCBP12BPA。结论本研究证实了HCBP12定位于肝细胞浆内,可与肝细胞的载脂蛋白、金属硫蛋白2A、β-2微球蛋白、羧酸脂酶等多种蛋白结合,在肝细胞的增殖、凋亡,细胞内物质代谢等过程具有不可忽视的作用。本研究成功利用大肠杆菌原核表达系统对其进行了诱导表达,表达蛋白通过亲和层析技术进行了纯化,并应用纯化蛋白成功制备了具备高效价、高特异性的兔抗HCBP12多克隆抗体。这些都为日后应用其他包括免疫组化、哺乳动物双杂交、细胞增殖、细胞信号转导等方法深入研究HCBP12在HCC发生发展过程中的意义奠定了物质基础。

关键词：丙型肝炎病毒 hcv core 结合蛋白多克隆抗体酵母双杂交

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Epigenetic silencing of SFRP1 induced by hepatitis C virus core protein enhances HCC aggressiveness through induction of epithelial-mesenchymal transition

Epigenetic silencing of SFRP1 induced by hepatitis C virus c...

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2012全国临床微生物与感染免疫学术研讨会

作者： Quan Huiqin~1,Zhou Fan~1,Nie Dan~1,Chen Qingmei~1,Shan Xiaoliang~1,Cai Xuefei~1,Zhou Zhi~1,Chen Ke~1, He Tongchuan~(2,3),Huang Ailong~1,Tang Ni~1 1.the Second Affiliated Hospital and the Key Laboratory of Molecular Biology of Infectious Diseases designated by the Chinese Ministry of Education,Chongqing Medical University 2.Stem Cell Biology and Therapy Laboratory,The Children’s Hospital,Chongqing Medical University 3.Molecular Oncology Laboratory,Department of Surgery,The University of Chicago Medical Center,Chicago,IL 60637,USA

Aberrant oncogenic activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway contributes to hepatocellular carcinogenesis.In addition to genetic mutations,various epigenetic modifications of the Wnt antagonist secreted frizzled-related protein(SFRP) family have been implicated in regulating Wnt signaling.Here,we report that Hepatitis C virus(hcv) core protein down-regulates SFRP1 expression both at the transcription level and at protein level in the core protein-expressing Huh7 and HepG2 cell lines.SFRPl expression can be robustly restored by either a DNA methylation inhibitor alone or in synergy with a histone deacetylase inhibitor.We further examine the DNA methylation status on the SFRP1 promoter by methylation specific PCR and bisulfite DNA sequencing. The methylation analysis reveals that CpG dinucleotide islands closer to the transcription start site in SFRPl promoter are hypermethylated in core-expressing Huh7 cells,suggesting that hcv core protein may down-regulate SFRP1 expression through inducing hypermethylation of SFRP1 promoter.Chromatin immunoprecipitation analysis reveals that hcv core protein markedly increases the expression levels of DNA methyltransferase -1 and histone deacetylase-1,which are subsequently recruited to the transcription start site of SFRP1 promoter region,leading to the repression of acetyl-Histone H3 binding capacity to SFRP1 promoter and the eventual epigenetic silencing of SFRP1 expression.Further functional analysis demonstrates that core proteinpromoted cell proliferation,migration and invasiveness are abrogated by either Dnmt1 knock-down or the restoration of SFRP1 expression in hepatoma cells.Dnmt1 knockdown or SFRP1 over-expression inhibits hcv core-induced epithelial-mesenchymal transition(EMT) and results in a significant decrease in the expression level of activatedβ-catenin and the Wnt/β-catenin target genes,c-myc and cyclin D1.Taken together,our data strongly suggest that the epigenetic silencing of SFRP1 induced by hcv core may lead to the activation of Wnt signaling pathw

关键词： Epigenetic Methylation SFRP1 Wnt signal pathway hcv core

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hcv核心蛋白抑制SFRP1基因启动子活性的研究

HCV核心蛋白抑制SFRP1基因启动子活性的研究

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2012全国临床微生物与感染免疫学术研讨会

作者：权会琴聂丹周帆陈林林陈庆美单晓亮谢青唐霓重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室

目的探讨hcv核心蛋白(hcv core protein)对Wnt信号通路抑制分子SFRP1启动子活性的影响。方法以人肝癌细胞系Huh7基因组为模板,扩增SFRP1启动子区不同片段(-407～-27 bp,-837～-27 bp,-1 202～-27 bp,-1 619～-27 bp,-2 029～-27 bp),以pGL3-Basic为载体分别构建SFRP1启动子区截短报告质粒。将构建好的质粒与pRL-TK共转染HEK293细胞,确定启动子区活性最强区域;分别用编码hcv核心蛋白的腺病毒(Adcore)或GFP对照腺病毒(AdGFP)感染已转染重组报告质粒的SK-Hep1细胞,观察Adcore对SFRP1启动子活性的调控作用。结果 SFRP1启动子区域-407～-27 bp片段活性最强;与pGL3-Basic对照组相比较,相对荧光素酶活性增加了(37.31±4.45)倍(Phcv core蛋白能够抑制SFRP1基因启动子区活性,其对pGL3-S1的抑制作用最强,与GFP对照组相比较,抑制率为(63.8±1.0)%(Phcvcore蛋白通过抑制SFRP1启动子区活性下调SFRP1基因的表达,可能参与Wnt/β-catenin信号通路的活化,并与原发性肝癌的发生密切相关。

关键词： SFRP1 启动子荧光素酶报告基因载体 hcv core

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