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小檗碱对高糖环境下hcclm3细胞凋亡与自噬的影响

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中国实验方剂学杂志 2019年第2期25卷 68-73页

作者：刘倩傅缨资晓飞熊耀斌李媛南昌大学第二附属医院南昌330006 江西省医学科学院南昌330006 南昌大学医院南昌330006

目的:探讨小檗碱(berberine,BBR)对高糖环境下人肝癌hcclm3细胞增殖、凋亡及自噬相关基因表达的影响,并探究其可能的抗肿瘤分子机制。方法:把hcclm3细胞加入低、中、高质量浓度葡萄糖中,通过细胞增殖实验(cell counting kit-8,CCK-8)检... 详细信息

目的:探讨小檗碱(berberine,BBR)对高糖环境下人肝癌hcclm3细胞增殖、凋亡及自噬相关基因表达的影响,并探究其可能的抗肿瘤分子机制。方法:把hcclm3细胞加入低、中、高质量浓度葡萄糖中,通过细胞增殖实验(cell counting kit-8,CCK-8)检测发现高质量浓度葡萄糖对hcclm3细胞增殖的作用最明显。基于此,选择高糖培养hcclm3细胞,加入BBR(5,10,20,30,40,50μmol·L^-1进行体外干预24 h,研究各组药物对hcclm3细胞增殖的抑制效果,并设顺铂组对照,通过流式细胞仪观察细胞凋亡率的变化,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和自噬相关基因Atg5,Beclin1 mRNA表达水平。结果:与空白组比较,随着葡萄糖浓度的增加,hcclm3细胞在高糖组中增殖能力最强(P hcclm3增殖的抑制作用与BBR浓度有相关性,BBR(5,10,20,30,40,50μmol·L^-1)组抑制率依次为33. 86%,40. 75%(P 细胞凋亡率随BBR浓度增加有显著上升(P hcclm3细胞增殖具有抑制作用,可能是通过调控Bcl-2的表达,诱导该细胞凋亡,同时又上调Beclin1,Atg5 mRNA表达水平,促进自噬发挥抗肿瘤作用。

关键词：小檗碱 hcclm3细胞高糖凋亡自噬

高转移潜能肝癌hcclm3细胞中侧群细胞的分离及其干细胞特性鉴定

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中国肿瘤生物治疗杂志 2015年第2期22卷 220-224页

作者：郭哲向邦德姜经航张俊钟艳平苏节黎乐群广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科广西南宁530021 广西医科大学第一附属医院超声科广西南宁530021 广西医科大学医学实验中心广西南宁530021

目的:检测高转移潜能肝癌hcclm3细胞株中侧群(side population,SP)细胞比例,分选SP细胞并探讨其生物学特性。方法:4种肝癌细胞株的转移潜能大小依次为hcclm3>MHCC97H>MHCC97L>Huh7,分别予以荧光染料Hoechst33342染色,以加入维拉帕米的... 详细信息

目的:检测高转移潜能肝癌hcclm3细胞株中侧群(side population,SP)细胞比例,分选SP细胞并探讨其生物学特性。方法:4种肝癌细胞株的转移潜能大小依次为hcclm3>MHCC97H>MHCC97L>Huh7,分别予以荧光染料Hoechst33342染色,以加入维拉帕米的拮抗组为对照,流式细胞术检测SP细胞比例;从hcclm3细胞中分选SP细胞和主群(main population,MP)细胞,采用悬浮球培养、Transwell侵袭实验及裸鼠成瘤实验判断hcclm3 SP细胞是否具备肿瘤干细胞生物学特性;RT-PCR检测SP及MP细胞中干细胞相关基因的表达。结果:hcclm3细胞中SP细胞比例为(16.9±1.8)%,显著多于MHCC97H、MHCC97L、Huh7中SP细胞比例[(8.4±0.7)%、(4.6±0.5)%、(1.0±0.2)%,均Phcclm3细胞中,SP细胞悬浮球形成明显高于MP细胞[(25.3±5.1)%vs(11.2±2.6)%,P细胞的侵袭能力显著高于MP细胞(P细胞的裸鼠皮下成瘤能力也明显高于MP细胞。hcclm3细胞的SP细胞中干细胞相关基因ABCG2、CD13、CD44、Nanog、Sox2及Klf4 mRNA平均表达水平分别是MP细胞的5.64、2.26、2.10、3.78、2.37、2.92倍(均Phcclm3细胞的SP细胞中富集了肝癌干细胞,这可能与其较高的转移潜能有关。

关键词：肝癌 hcclm3细胞侧群细胞肿瘤干细胞转移

FoxM1-DBD靶向肽9R-P49的获得及其对肝癌细胞hcclm3的药效和分子机制初步研究

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FoxM1-DBD靶向肽9R-P49的获得及其对肝癌细胞HCCLM3的药效和分子...

作者：常苗西南交通大学

学位级别：硕士

癌症是一种严重危害人类生命健康的重大疾病,包括肝癌在内的恶性肿瘤已成为人类疾病死亡的头号杀手。以肿瘤密切相关的蛋白为靶标进行靶向分子标记或靶向药物研究是癌症诊断与抗癌药物研发的重要方向。在众多靶标蛋白中,转录因子Fox M1... 详细信息

癌症是一种严重危害人类生命健康的重大疾病,包括肝癌在内的恶性肿瘤已成为人类疾病死亡的头号杀手。以肿瘤密切相关的蛋白为靶标进行靶向分子标记或靶向药物研究是癌症诊断与抗癌药物研发的重要方向。在众多靶标蛋白中,转录因子Fox M1在肿瘤的发生发展、转移耐药中起着十分重要的作用,Fox M1被认为是抗癌药物治疗与干预的重要药靶与标记。本实验室前期以Fox M1-DBD作为靶标,利用噬菌体展示技术在噬菌体十二肽库中筛选得到一条高亲和力的多肽P201,研究发现其对肝癌Hep G2细胞具有抑制作用,并通过丙氨酸扫描突变确定了P201中的五个关键氨基酸位点。为了筛选和获得抗肿瘤药效作用更强的优化多肽,本研究采用固定P201中该五个关键氨基酸,随机合成其余位点氨基酸的策略,构建了新的噬菌体二级偏性肽库,筛选和获得了亲和力、靶向性更强的抗肿瘤多肽P49,并探究了其在肝癌hcclm3细胞中的药效作用与初步分子作用机制。本研究成功构建了库容量为6.67×10 pfu的噬菌体二级偏性肽库,以Fox M1-DBD为靶标对构建的肽库进行五轮亲和淘选,经五轮富集,P/N值最高达到16071。对富集平板随机挑选克隆测序,获得33组阳性噬菌体克隆。ELISA检测结果显示,11个单克隆噬菌体亲和力高于含原始序列P201的噬菌体克隆。反筛测定结果显示:含P2、P18、P19、P21和P49号多肽序列的噬菌体克隆与靶标蛋白的结合能力较高且优于含原始序列P201的噬菌体克隆。利用分子模拟对接及生物信息学手段综合分析后,确定排名前四的序列:P2、P8、P21和P49进行多肽合成和进一步研究。CCK-8细胞活力测定确定了合成的该四条优化多肽对A549、hcclm3、Hep G2和MDA-MB-231四种肿瘤细胞均具有不同程度的抑制能力,其中9R-P49对四种肿瘤细胞均有强的抑制作用,尤其在hcclm3细胞中,9R-P49组处理24 h后IC为10.24±0.45μM,显著优于P201多肽。随后,我们以hcclm3细胞为重点研究对象,通过AO/EB双染、流式细胞术、平板克隆形成及Transwell实验,发现9R-P49多肽能显著促进其细胞凋亡、抑制细胞增殖和迁移。RT-PCR和Western blot证明该多肽能够通过下调Fox M1的转录及翻译水平调控细胞的生理功能。进一步研究发现,9R-P49能够下调促癌基因CCNB1、MMP2和Survivin的转录水平及C-myc的蛋白表达水平。最后,我们以9R-P49多肽在IC剂量下,处理hcclm3细胞并进行RNA转录组测序分析,根据Q-value≤0.05,Fold change≥2条件筛选差异基因,结果表明,共存在1154个差异表达基因,其中489个基因表达下调,665个基因表达上调。GO富集分析发现,9R-P49处理组主要富集于血管通透性和中性粒细胞趋化性的调节等条目。而KEGG分析差异表达基因发现,9R-P49处理组涉及免疫调节、癌症、信号转导等途径。其中,人类疾病条目下富集基因最多,暗示该多肽处理与人类疾病治疗密切相关。综上,本研究成功筛选出亲和力、靶向性优于P201的多肽,且多肽9R-P49能够通过下调Fox M1的表达调控抑制hcclm3细胞的增殖、迁移并促进凋亡。本论文为分子靶向Fox M1的抗肿瘤多肽药物的深入研发提供了重要的工作基础和思路。

关键词： FoxM1-DBD 9R-P49 噬菌体展示技术 hcclm3细胞转录组

盐酸石蒜碱通过circASH2L/miR-124-3p轴调控肝癌hcclm3细胞的恶性生物学行为

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中国肿瘤生物治疗杂志 2021年第10期28卷 969-977页

作者：苏珊珊王怀璋唐玉君万家鑫河南中医药大学第二临床医学院肿瘤科河南郑州450011 郑州大学附属肿瘤医院河南省肿瘤医院中西医结合六病区河南郑州450003 河南中医药大学第二临床医学院肛肠科河南郑州450018

目的:探讨盐酸石蒜碱(lycorine hydrochloride,LH)对肝癌hcclm3细胞恶性生物学行为的影响及其对circASH2L/miR-124-3p轴的调控作用。方法:将hcclm3细胞分为不同浓度LH处理组(LH-L、LH-M、LH-H组)和Con、si-NC、si-circASH2L、LH+pcDNA、LH+pcDNA-circASH2L组;以CCK-8法、平板克隆形成实验、流式细胞术、细胞划痕实验和Transwell小室实验分别检测hcclm3细胞的增殖、克隆形成、凋亡、迁移和侵袭;qPCR法检测hcclm3细胞中circASH2L和miR-124-3p的表达量;双荧光素酶报告基因实验检测circASH2L和miR-124-3p的靶向关系;WB法检测cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量。结果:与Con组比较,LH不同浓度组细胞增殖抑制率升高(P细胞数减少(均P细胞增殖抑制率升高(P细胞数减少(均P细胞增殖抑制率降低(P细胞数增多(均P细胞hcclm3的增殖、迁移、侵袭并诱导其凋亡。

关键词：盐酸石蒜碱 circASH2L miR-124-3p 肝癌 hcclm3细胞增殖迁移侵袭

鳖甲煎丸化裁方对肝癌hcclm3细胞增殖和凋亡的影响

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北京中医药大学学报 2018年第6期41卷 471-475页

作者：高业博李卫东刘瑞郭秋均蒋树龙中国中医科学院广安门医院肿瘤科北京100053 中国中医科学院望京医院肿瘤科济宁市第一人民医院肿瘤科

目的探讨鳖甲煎丸化裁方对肝癌hcclm3细胞增殖和凋亡的影响。方法采用SD大鼠每天灌胃鳖甲煎丸化裁方(21 g/kg),7 d后腹主动脉取血离心获得含药血清。96孔板加入不同浓度鳖甲煎丸化裁方含药血清,分别干预24、48、72 h后,每孔加入10μL MT... 详细信息

目的探讨鳖甲煎丸化裁方对肝癌hcclm3细胞增殖和凋亡的影响。方法采用SD大鼠每天灌胃鳖甲煎丸化裁方(21 g/kg),7 d后腹主动脉取血离心获得含药血清。96孔板加入不同浓度鳖甲煎丸化裁方含药血清,分别干预24、48、72 h后,每孔加入10μL MTT溶液,继续培养4 h,检测各含药血清对hcclm3增殖的影响;培养hcclm3细胞后,向各孔内分别加入5%、10%、20%的鳖甲煎丸化裁方含药血清及葫芦素I培养24、48 h后,Annexin V-FITC/PI法检测含药血清对hcclm3凋亡的影响。结果鳖甲煎丸化裁方各浓度含药血清在干预24 h后5%、10%含药血清对细胞增殖的影响不大,与对照组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在各给药组干预48 h后,10%、20%含药血清组的增殖率分别为87.86%和84.60%,与对照组相比较,对细胞的增值率影响具有统计学差异(P细胞造成的凋亡与对照组相比较,无统计学差异(P>0.05),而10%、20%含药血清及葫芦素I(0.5μmol/L)的凋亡率分别为7.90%,12.22%和15.36%,具有统计学差异(P3.89%和19.02%,与对照组比较差异具有统计学意义(Phcclm3增殖并促进其凋亡的作用,作用效果随剂量增加而增强。

关键词：鳖甲煎丸化裁方肝癌 hcclm3细胞细胞增殖凋亡

小檗碱干预高糖环境下hcclm3细胞的抗肿瘤机制研究

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小檗碱干预高糖环境下HCCLM3细胞的抗肿瘤机制研究

作者：刘倩南昌大学

学位级别：硕士

研究背景与目的:糖尿病除了可以引起各种血管及神经病变外,还与恶性肿瘤的发生、发展密切相关,在胰腺、子宫内膜、结直肠、胃、乳房和膀胱等与代谢综合征相关较高的肿瘤中,其并发肝癌(HCC)风险增加最为显著。炎症因子水平升高会增加糖... 详细信息

研究背景与目的:糖尿病除了可以引起各种血管及神经病变外,还与恶性肿瘤的发生、发展密切相关,在胰腺、子宫内膜、结直肠、胃、乳房和膀胱等与代谢综合征相关较高的肿瘤中,其并发肝癌(HCC)风险增加最为显著。炎症因子水平升高会增加糖尿病致病风险,也通过慢性炎症刺激打开转录信号条件,促进肿瘤的发生与发展。小檗碱(Berberine,BBR)是从中药黄连中分离的有效生物碱,现代医学发现小檗碱具有抑制组织代谢和抗癌的作用。本实验模拟糖尿病并发肝癌患者的体内环境,在体外建立肝癌细胞的高糖培养环境,观察hcclm3细胞在高糖环境下迁移、增殖作用,将炎症因子、NF-?B及自噬基因Beclin1等表达水平作为研究指标,探索BBR在抗炎、抗肿瘤方面的作用及可能机制。研究方法:把hcclm3细胞加入不同浓度(含低、中、高)葡萄糖的培养液中,体外培养至对数生长期,通过细胞划痕法、CCK-8法检测发现高糖对hcclm3细胞迁移与增殖的促进作用最明显。基于以上实验结果,选择高糖培养hcclm3细胞,加入不同浓度的BBR(5、10、20μmol/L)分别进行体外干预24h、48h及72h,并设二甲双胍(Metformin,MET)对照组。采用CCK-8法观察不同浓度BBR干预后细胞增殖抑制情况;酶联免疫吸附实验(ELISA)观察不同浓度BBR干预48h后细胞上清液中炎症因子IL-6、TNF-α含量的变化;通过荧光定量核酸扩增实验(QPCR)检测不同浓度BBR干预24h后基因NF-?B、Beclin1表达变化。结果:(1)细胞划痕观察发现,不同糖浓度作用于hcclm3细胞,随着时间及糖浓度的增加,细胞数量增多,迁移能力越强,高糖组培养24小时显示迁移能力及数量达到最佳。CCK-8检测结果发现,hcclm3细胞增殖作用随着葡萄糖浓度的增加而逐渐增强,中、高糖组与空白组比较有统计学差异(Phcclm3细胞24h、48h、72h后,与单纯高糖组比较,BBR对hcclm3细胞增殖抑制率随着BBR浓度增加及作用时间延长有升高趋势,各时间点均以20μmol/L浓度的抑制率最高,分别为48.22%、53.89%和58%,且呈时间浓度依赖性(P3)ELISA法检测结果提示,不同浓度的BBR作用于高糖培养的hcclm3细胞48h后,细胞上清液中的促炎因子IL-6、TNF-α表达量减少,IL-6、TNF-α表达量均在20μmol/L浓度降至最低,与单纯高糖组比较有显著统计学差异(Phcclm3细胞后,BBR能有效降低NF-?B mRNA表达水平,提高Beclin1 mRNA的表达水平。与单纯高糖组比较,BBR各浓度均有显著统计学差异(Phcclm3细胞在高糖环境中迁移及增殖能力增强,BBR对高糖培养的hcclm3细胞生长有一定的抑制作用,呈时间浓度依赖性;2.BBR能有效降低高糖培养hcclm3细胞中促炎因子IL-6、TNF-α表达量,有可能通过发挥抗炎活性抑制hcclm3细胞微环境中的炎症水平;3.BBR干预高糖培养的hcclm3细胞后,NF-?B mRNA表达水平降低,Beclin1 mRNA表达水平提高,提示通过调节NF-?B转录发挥抑炎作用,进一步上调抑癌基因Beclin1 mRNA表达水平可能为其抑制肿瘤增殖的机制之一。

关键词：小檗碱 hcclm3细胞高糖 Beclin1 炎症因子

PPTA抑制肝癌细胞hcclm3的增殖、周期和迁移

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世界华人消化杂志 2016年第30期24卷 4177-4184页

作者：张志杨朱海杭贾平陈春燕郁飞扬州大学临床医学院江苏省扬州市225001 苏北人民医院胃肠中心江苏省扬州市225001

目的初步研究PPTA对肝癌细胞hcclm3增殖、周期和迁移的作用及机制.方法分别采用四甲基偶氦唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、流式细胞术、细胞划痕实验,观察PPTA对肝癌细胞hcclm3增殖、周期和迁移的影响;采用细胞免疫荧光实... 详细信息

目的初步研究PPTA对肝癌细胞hcclm3增殖、周期和迁移的作用及机制.方法分别采用四甲基偶氦唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、流式细胞术、细胞划痕实验,观察PPTA对肝癌细胞hcclm3增殖、周期和迁移的影响;采用细胞免疫荧光实验法观察PPTA对hcclm3细胞肌动蛋白纤维的分布、丝状和片状伪足形成等的影响;采用Western blot法检测肝癌细胞hcclm3中蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)的表达.结果PPTA对hcclm3细胞有抑制作用,抑制hcclm3细胞增殖的IC_(50)在50μmol/L以下.当PPTA浓度为40μmol/L时,对hcclm3细胞周期有抑制作用.PPTA对hcclm3细胞划痕的相对愈合速度有抑制作用,随着浓度的升高抑制作用显著增强.细胞免疫荧光显示,hcclm3细胞中丝状伪足增多,片状伪足减少,细胞排列更为紧密,当PPTA浓度为40μmol/L,作用显著;Western blot显示,当PPTA浓度为20、40μmol/L时,上调hcclm3细胞的AKT表达,下调pAKT表达.结论PPTA抑制肝癌细胞hcclm3的增殖、周期、迁移,其作用机制可能是调控AKT和ERK相关的信号通路.

关键词： PPTA 肝癌 hcclm3细胞增殖周期迁移

let-7a调控自噬对缺氧状态下原发性肝癌hcclm3细胞增殖的影响

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实用肝脏病杂志 2018年第5期21卷 701-704页

作者：佟辉李涛申川彭承宏邱伟华沈柏用祝哲诚上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科上海市200025

目的探讨let-7a调控自噬对缺氧状态下原发性肝癌hcclm3细胞增殖的影响。方法将hcclm3细胞分为常氧组、缺氧组和缺氧let-7a组,分别给予不同的处理。各组设6个平行孔,培养72 h。采用吖啶橙染液法测定hcclm3细胞自噬率,采用MTT法检测hcclm... 详细信息

目的探讨let-7a调控自噬对缺氧状态下原发性肝癌hcclm3细胞增殖的影响。方法将hcclm3细胞分为常氧组、缺氧组和缺氧let-7a组,分别给予不同的处理。各组设6个平行孔,培养72 h。采用吖啶橙染液法测定hcclm3细胞自噬率,采用MTT法检测hcclm3细胞活力,使用流式细胞仪分析hcclm3细胞周期G1,采用酶联免疫吸附法测定培养上清let-7a、细胞周期D1蛋白(cyc D1)和血管内皮生长因子(VEGF)水平。结果缺氧let-7a组细胞存活率为(49.7±9.5)%,显著低于常氧组或缺氧组的(100.0±0.0)%或(119.1±13.1)%(P细胞存活率显著高于常氧组(P细胞周期G1期和细胞自噬率分别为(89.6±16.1)%和(49.3±7.4)%,显著高于常氧组或缺氧组的(56.3±11.0)%和(13.2±8.1)%或(69.7±14.1)%和(23.5±5.5)%(P细胞周期G1期和自噬率显著高于常氧组(P细胞let-7a蛋白水平为(96.1±9.3)μmol/L,显著高于常氧组或缺氧组的(33.4±7.1)μmol/L或(65.3±5.2)μmol/L(P3±8.8)μmol/L和(56.3±6.3)μmol/L,显著低于常氧组或缺氧组的(124.1±7.2)μmol/L和(114.1±5.2)μmol/L或(98.2±6.7)μmol/L和(85.2±8.1)μmol/L(Phcclm3细胞的表达能诱发细胞自噬,使得细胞在G1期往S期的分化过程发生障碍,抑制细胞在缺氧环境中的增殖,其机制可能与细胞CYC D1和VEGF表达下调有关。

关键词：肝细胞癌 hcclm3细胞 let-7a 缺氧细胞自噬

siRNA干扰沉默NUF2基因对肝癌hcclm3细胞迁移和侵袭的影响

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贵州医科大学学报 2017年第2期42卷 147-150页

作者：郭云韬喻超陈礼闻孙诚谊贵州医科大学医院肝胆外科贵州贵阳550004

目的:探讨siRNA干扰对人肝癌hcclm3细胞细胞分裂相关基因NUF2蛋白表达及细胞迁移与侵袭能力的影响。方法:转染siRNA到hcclm3细胞,采用western blot法检测hcclm3细胞的NUF2蛋白表达;应用划痕、Transwell小室侵袭实验检测转染siRNA后,肝癌... 详细信息

目的:探讨siRNA干扰对人肝癌hcclm3细胞细胞分裂相关基因NUF2蛋白表达及细胞迁移与侵袭能力的影响。方法:转染siRNA到hcclm3细胞,采用western blot法检测hcclm3细胞的NUF2蛋白表达;应用划痕、Transwell小室侵袭实验检测转染siRNA后,肝癌hcclm3细胞体外迁移和侵袭能力。结果:siRNA转染组hcclm3细胞NUF2蛋白的表达明显低于对照组,hcclm3细胞迁移和侵袭能力均显著低于对照组,差异有统计学意义(P细胞hcclm3的迁移和侵袭,NUF2可能成为肝癌治疗的新靶点。

关键词：肝肿瘤 NUF2基因 RNA干扰 hcclm3细胞迁移侵袭