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hbv cccdna模型的建立及互作蛋白质组学研究

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HBV cccDNA模型的建立及互作蛋白质组学研究

作者：李双杰山东大学

学位级别：硕士

研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,hbv)属嗜肝DNA病毒科,感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,能够导致急、慢性乙型肝炎、肝硬化甚至肝癌。据世界卫生组织统计,2019年全球有2.96亿人患有慢性乙肝病毒感染,并且约有82万人... 详细信息

研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,hbv)属嗜肝DNA病毒科,感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,能够导致急、慢性乙型肝炎、肝硬化甚至肝癌。据世界卫生组织统计,2019年全球有2.96亿人患有慢性乙肝病毒感染,并且约有82万人死于乙肝病毒感染所导致的肝硬化和肝癌等疾病。我国是乙肝病毒慢性感染较为严重的国家之一,虽然目前已有高效的乙肝疫苗来预防hbv感染,但是临床尚无能够彻底清除hbv感染患者体内病毒的有效治疗方案。因此,进一步阐明hbv在肝细胞内复制的途径和调控机制,寻找有效的临床干预靶点具有重要的临床转化价值和社会意义。共价闭合环状DNA(cccdna)是hbv转录的唯一模板和体内病毒储存库,其具有较高的稳定性和长达几个月到几年的半衰期,是导致hbv持续复制、慢性感染和难以治愈的根本原因。因此,剖析hbv cccdna的生物学特征及其与宿主因子互作机制有望为清除hbv感染提供有效靶点。hbv自然感染后肝细胞内cccdna丰度较低,cccdna微小染色体的结构组成与细胞基因组非常相近,导致自然感染状态下筛选cccdna相互作用的宿主因子较为困难。尽管hbv质粒已广泛应用于病毒复制调控等相关研究,但因携带较多外源性序列,无法很好地模拟自然感染状态,限制了该领域的研究进展。本文利用微环质粒技术构建了高度模拟hbv cccdna的微环质粒模型,并且利用该模型初步开展了 cccdna互作蛋白的筛选工作。研究方法与结果***-hbv的构建与验证为了构建hbv微环质粒,我们首先以hbv prcccdna质粒为模板扩增获得hbv片段,将其与微环质粒pCMV-MC所需骨架部分连接,成功构建了 pmini-hbv parent。将pmini-hbv parent转化进ZYCY10P3S2T菌种中,该菌种经过阿拉伯糖诱导产生PhiC31整合酶和I-SceI内切酶,整合酶通过整合位点诱导重组产生目的质粒和骨架质粒,内切酶通过识别骨架质粒上的酶切位点降解骨架质粒,最终获取了高纯度的目的hbv微环质粒MC-hbv。然而,将MC-hbv在体外转染肝癌细胞系后,并未检测到高水平的hbv抗原表达和新生cccdna的产生,提示MC-hbv不能有效支持hbv复制。通过对MC-hbv转录本的外源内含子区域进行RNA结构预测发现,其二级结构呈现复杂的发夹结构,而非简单的棒状结构。根据碱基互补配对原则,通过补加序列、优化RNA二级结构,获得了改良的hbv微环质粒(mMC-hbv)。将mMC-hbv质粒转染进肝癌细胞系后,发现上清中能够检测到高水平的HBsAg和HBeAg,亦可检测到细胞内pgRNA和新生cccdna的产生。更为重要的是,以mMC-hbv转染细胞培养上清中的病毒再次感染Huh7-NTCP和HepG2-NTCP细胞后,亦可检测到hbv抗原的表达和pgRNA、cccdna的产生。以上结果显示,mMC-hbv能够在体外支持hbv复制。***-hbv能够产生具有表观遗传学特征的cccdnacccdna的多种表观修饰状态与hbv复制存在密切联系。为了验证mMC-hbv模型是否能够产生具备典型表观遗传学特征的hbv cccdna,我们收集mMC-hbv转染的HepG2细胞,或利用其上清中的病毒粒子再感染的HepG2-NTCP细胞。ChIP-qPCR结果显示,hbv cccdna上能够检测到乙酰化/甲基化修饰的组蛋白及乙酰基转移酶p300、CBP存在不同程度的的富集。同时,过表达HBx能够增强mMC-hbv转染细胞中cccdna结合的乙酰化H4水平,而IFN-α处理则发挥抑制作用。以上结果显示,mMC-hbv可以产生具有表观遗传学特征的cccdna。***-hbv小鼠模型的建立为进一步验证mMC-hbv是否能够用于建立hbv小鼠模型,将不同剂量的mMC-hbv 微环质粒尾静脉高压注射进 C57BL/6 小鼠体内,每周检测血清中 HBsAg 水平。结果显示,在注射后4周左右,小鼠血清内仍可检测到较高水平的HBsAg,提示mMC-hbv 可用于建立急性 hbv 感染小鼠模型。***-hbv的生物素标记和pull-down体系的建立为了建立高效的cccdna互作分子筛选体系,我们进一步将mMC-hbv微环质粒进行体外生物素标记即Biotin-mMC-hbv,通过偶连链霉亲和素的磁珠进行pull-down实验,Dot blot结果显示Biotin-mMC-hbv能够被偶联链霉亲和素的磁珠结合,提示mMC-hbv成功被生物素化标记,并可用于pull-down检测分析。5.基于Biotin-mMC-hbv的cccdna互作蛋白分析为筛选与hbv cccdna互作的宿主蛋白,我们将Biotin-mMC-hbv以及对照mMC-hbv、线性

关键词： hbv cccdna mMC-hbv 生物素标记互作蛋白质

hbv cccdna P区变异的检测方法及临床意义的研究

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HBV cccDNA P区变异的检测方法及临床意义的研究

作者：谢榕广西医科大学

学位级别：硕士

第一部分：肝细胞全长hbv cccdna扩增与提取方法的建立目的：建立肝细胞全长hbv cccdna扩增与提取方法的体系。方法：（1）使用QIAamp DNA Mini kit试剂盒提取肝组织细胞总DNA,以ATP依赖DNA酶（PSAD）消化非环状DNA,纯化后... 详细信息

第一部分：肝细胞全长hbv cccdna扩增与提取方法的建立目的：建立肝细胞全长hbv cccdna扩增与提取方法的体系。方法：（1）使用QIAamp DNA Mini kit试剂盒提取肝组织细胞总DNA,以ATP依赖DNA酶（PSAD）消化非环状DNA,纯化后提取产物;（2）采用hbv cccdna特异性引物滚环扩增（RCA）CHB患者肝细胞全长hbvcccdna;（3）使用hbv cccdna跨缺口特异性引物通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测RCA扩增产物。结果：（1）载量幅度为103-1010copies/ml的标准质粒和53例CHB患者肝组织标本（包括4例血清hbv DNA＜1.0×103copies/ml相应肝组织）使用hbv cccdna特异性引物RCA扩增3.2kb的肝细胞全长hbv cccdna的阳性检出率为100%;（2）10例非hbv感染的肝组织标本和10例hbv相关感染患者的血清使用hbv cccdna特异性引物RCA扩增3.2kb标本的肝细胞全长hbv cccdna的阳性检出率为0%;（3）53例CHB患者肝组织使用hbv cccdna特异性引物进行RCA扩增,扩增产物再采用跨缺口的hbv cccdna引物进行RT-PCR扩增,阳性率为100%。结论：hbv cccdna特异性引物RCA扩增肝细胞全长hbv cccdna的方法特异性高,敏感性好。第二部分耐NAs患者肝细胞hbv cccdna P区变异检测的临床意义探讨目的：检测耐NAs患者肝细胞hbv cccdna P区变异以探讨其临床意义。方法：研究对象：耐药1组29例为NAs治疗发生病毒学突破的CHB患者;耐药2组4例,为LAM初治耐药,经治达中国《指南》停药标准复发的CHB患者;对照组20例为从未抗病毒治疗的CHB患者。实验方法：使用多对引物巢式PCR检测患者hbv基因型;水煮法提取血清rcDNA, hbv cccdna特异性引物RCA扩增肝细胞全长hbv cccdna;用hbv P区多对引物对肝细胞hbv cccdna和血清rcDNA基因耐药进行巢式PCR扩增,直接测序法对扩增产物进行变异位点的检测。结果：（1）耐药1组,M204I/V、L180M、A181T在肝细胞hbv cccdna的检出频率分别为31%、20.7%、3.4%,在血清rcDNA的检出频率分别为31%、27.6%、3.4%;对照组未检测出任何经典耐药位点;（2）耐药1组,补偿位点S202G、V173L、T184I、V207L、A222T在肝细胞hbv cccdna的检出频率分别为6.9%、3.4%、6.9%、10.3%、6.9%,在血清rcDNA的检出频率分别为3.4%、3.4%、6.9%、6.9%、10.3%;（3）8个变异位点：N134E、Y151F、P177R、R192L、R193L、V253T、T259S、A223S目前未见报道;（4）同一患者肝细胞hbv cccdna与血清rcDNA同时检出相同变异位点的比率44.83%;（5）耐药2组3例患者复发和初治耐药血清rcDNA所检测到的变异位点完全相同,2例患者停药时肝细胞hbv cccdna仍然能检测到与初治耐药、复发血清rcDNA相同的变异位点。结论：（1）应用RCA扩增肝细胞全长hbv cccdna,直接测序法检测出的P区变异位点及频率与临床用药史相符;（2）肝细胞hbv cccdna P区变异位点的检测可作为NAs基因耐药诊断方法,尤其是当血清hbv DNA＜1.0×103copies/ml;（3）同一患者肝细胞hbv cccdna与血清rcDNA变异位点不完全一致;（4）RCA扩增肝细胞全长hbv cccdna,直接测序检测肝细胞hbv cccdna P区变异的方法有助于探讨NAs耐药机制和耐药基因的动力学改变。

关键词：滚环扩增 hbv cccdna 全长肝细胞变异慢乙肝病毒学突破

hbv cccdna水平及临床因素对判断肝细胞癌术后预后的价值

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HBV cccDNA水平及临床因素对判断肝细胞癌术后预后的价值

作者：白彦楼天津医科大学

学位级别：硕士

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是发病率高、预后差的恶性肿瘤之一。术后高复发率是最终导致患者死亡的重要原因,严重影响HCC的预后。寻找复发的危险因素,从而采取有效措施预防和治疗复发是提高术后生存率的最重要策... 详细信息

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是发病率高、预后差的恶性肿瘤之一。术后高复发率是最终导致患者死亡的重要原因,严重影响HCC的预后。寻找复发的危险因素,从而采取有效措施预防和治疗复发是提高术后生存率的最重要策略之一。现有研究表明,肝癌术后复发相关的主要预后因素包括：肿瘤大小、结节数目、血管浸润、肿瘤有无包膜、术前AFP、转氨酶水平、术中有无输血及hbv感染等。目的：利用实时荧光定量PCR的方法检测肝组织及血清hbv共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, cccdna）水平,探讨hbv cccdna水平及临床因素对肝细胞癌术后预后的影响。方法：收集60例自2003年12月-2006年8月住院的乙型肝炎相关HCC患者,记录患者术前Child-Pugh分级、是否肝硬化、AFP、肿瘤数目、大小、生长方式等指标,所有病例均留取新鲜的癌组织、癌旁组织和外周血标本,于-80℃冰箱保存。55例获得完整随访,肝组织DNA以限制性内切酶HindⅢ联合质粒安全的ATP依赖DNA酶（Plasmid-Safe-ATP-Dependent DNase, PSAD）进行消化,然后采用荧光定量PCR检测（?）hbv cccdna和hbv DNA;分析其与临床、病理特征等指标对无瘤生存率、总体生存率的影响。累积生存率计算采用寿命表法;单因素分析采用Kaplan-Meier,（?）将单因素分析有统计学意义的变量引人Cox比例风险模型分析,P＜0.05为差异有统计学意义。结果：60例患者中男性51人,女性9人,平均年龄53.37±11.49岁,5例无完整的随访资料。55例随访资料完整的患者,最长随访时间88个月,1、3、5年总体生存率为73%、51%和38%,中位总体生存期36.3个月,生存期超过6年9例,生存期超过7年2例;1、3、5年无瘤生存率为63%、29%和19%,中位无瘤生存期16.0个月。实时荧光定量PCR分析表明,血清hbv cccdna仅有1例阳性（1/35）,肝癌组织hbv cccdna阳性率20.0%（11/55）,根据13F（总hbv DNA引物）、13F+PSAD、13F+内切酶+PSAD、71F（hbv cccdna选择性引物）、71F+PSAD、71F+内切酶+PSAD组间定量结果比较,选择性引物、PSAD和Hind Ⅲ内切酶三者联合应用,可降低约5个数量级的非特异扩增。癌组织、癌旁组织总hbv DNA、hbv cccdna之间均存在正相关（r=0.437、0.478,P＜0.05）;外周血总hbv DNA与癌组织hbv cccdna呈低度正相关性（r=0.359,P＜0.001）,与癌旁组织hbv cccdna无相关性（r=0.264, P=0.052）。 HBsAg（-）占20%（11/55）,11例HBsAg（-）病例癌及癌旁组织中hbv DNA检出率100%。HBsAg（+）组肝癌及癌组织hbv DNA水平较较HBsAg（-）组差异有统计学意义（P=0.002、0.045）,而HBsAg（+）组肝癌及癌组织hbv cccdna水平较HBsAg（-）组差异无统计学意义（P=0.068、0.435）。单因素分析显示术前AFP水平（P=0.039）、生长方式（P＜0.001）、肿块数目（P＜0.005）、血管侵犯（P＜0.001）、TNM分期（P=0.007）、肿块直径（P=0.028）是影响术后总体生存率的预后因素。Cox模型多因素分析显示肿块数目（P=0.011）、血管侵犯（P=0.001）是影响术后总体生存率的独立预后因素。单因素分析显示癌组织hbv cccdna水平（P=0.028）、术前AFP水平（P=0.021）、生长方式（P=0.019）、肿块数目（P=0.006）、血管侵犯（P=0.048）、TNM分期（P=0.027）、病理分级（P=0.030）是术后无瘤生存率的预后因素。Cox模型多因素分析显示,癌组织hbv cccdna水平（P=0.007）、生长方式（P=0.002）是影响术后无瘤生存率的独立预后因素。结论：本研究表明利用内切酶及PSAD消化肝组织DNA联合hbv cccdna选择性引物,进行实时荧光定量PCR检测,可以更特异的测定癌及癌旁组织hbvcccdna水平。通过5年以上的随访观察,发现癌组织hbv cccdna水平＜31og10copies/μg的患者术后无瘤生存率较高,肝组织hbv cccdna可用于评估患者的预后。同时验证单发肿瘤、无血管侵犯的患者术后总体生存率较高;肝癌膨胀性生长的患者术后无瘤生存率较高。

关键词：肝细胞癌肝切除术 hbv cccdna 预后肿瘤转移复发

慢性乙型肝炎患者肝组织hbv cccdna定量检测及临床应用

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慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测及临床应用

作者：王永力华中科技大学

学位级别：硕士

目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,hbv)共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,cccdna)是乙肝病毒前基因组RNA(Pregenomic RNA,pg RNA)复制的原始模板,对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。以往文献... 详细信息

目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,hbv)共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,cccdna)是乙肝病毒前基因组RNA(Pregenomic RNA,pg RNA)复制的原始模板,对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。以往文献报告了多种进行hbv cccdna定量检测的方法,各有其利弊。本研究拟采用荧光定量聚合酶链反应即荧光定量PCR(Fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)的检测方法进行hbv cccdna定量检测,初步探讨hbv cccdna荧光定量检测方法在慢性乙型肝炎患者肝组织中的临床应用及意义。方法:通过使用hbv cccdna、hbv Total DNA以及hbv pg RNA的特异性引物和探针,将含有hbv基因的p hbv1.3-B6质粒作为标准品,根据hbv质粒的不同拷贝数,建立FQ-PCR检测的标准曲线,通过实时荧光定量PCR检测hbv cccdna、BV Total DNA以及hbv pg RNA含量;用Jukart细胞DNA作为检测管家基因β-actin的标准品,根据人类基因组DNA(Human genomicDNA,hg DNA)的不同拷贝数,建立FQ-PCR检测的标准曲线,通过实时荧光定量PCR检测β-actin基因含量,计算肝细胞数,并对每个肝细胞内含有的hbv cccdna、hbv Total DNA以及hbv pg RNA进行标准化;并在He PGAD38细胞和THP-1细胞中验证该方法。检测hbv感染患者肝组织hbv cccdna定量,包括终末期肝病患者(包括肝硬化和肝癌)11例和核苷酸类似物(Nucleos(t)ide analogs,NAs)经治的慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者5例(于基线和继续NAs治疗48周时肝穿刺活检取样)。通过检测患者肝组织的相关病毒学指标,分析肝细胞hbv cccdna、hbv Total DNA和hbv pg RNA定量在临床实践中的意义。结果:1.在He PGAD38细胞中成功检测到hbv cccdna、hbv Total DNA和hbv pg RNA,其含量分别为3.89 copies/cell(IQR 3.44-4.49)、1289.43 copies/cell(IQR859.96-6038.50)、6.42 copies/cell(IQR 5.06-7.85),而阴性对照的THP-1细胞未能检查到相关指标。*** Ag阴性的终末期肝病患者中,未经抗病毒治疗的患者肝细胞hbv cccdna和hbv Total DNA水平显著高于已接受抗病毒治疗的患者(分别为Phbv DNA阳性的患者肝细胞hbv cccdna水平明显高于血清hbv DNA转阴的患者(P=0.0238),而肝细胞hbv Total DNA定量水平两组无显著性差异(P>0.05)。3.本研究3例HBe Ag阳性核苷经治患者基线时肝组织hbv cccdna、hbv Total DNA和hbv pg RNA定量分别为0.93 copies/cell、1.62 copies/cell、0.05 copies/cell(均取中位数);2例HBe Ag阴性患者肝组织hbv cccdna、hbv Total DNA和hbv pg RNA定量分别为0.05 copies/cell、0.38 copies/cell、0.01 copies/cell(均取中位数)。HBe Ag阳性患者肝细胞hbv cccdna、hbv Total DNA和hbv pg RNA含量均高于HBe Ag阴性患者,两组比较没有统计学差异(P>0.05)。继续NAs抗病毒治疗48周后肝组织检测,3例HBe Ag阳性肝组织hbv cccdna、hbv Total DNA和hbv pg RNA定量的中位数分别为0.31 copies/cell、0.22 copies/cell、0.06 copies/cell;2例HBe Ag阴性患者肝组织hbv cccdna、hbv Total DNA和hbv pg RNA的含量分别为0.05copies/cell、0.22 copies/cell、0.00 copies/cell。治疗48周后,HBe Ag阳性患者肝细胞hbv cccdna、hbv Total DNA含量均较基线时降低(无统计学差异,P>0.05)。HBe Ag阴性患者hbv Total DNA和hbv pg RNA定量中位数在48周较基线时有所下

关键词：乙型肝炎病毒慢性乙型肝炎终末期肝病 hbv cccdna 检测方法

Impact of hbv replication in peripheral blood mononuclear cell on hbv intrauterine transmission

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Frontiers of Medicine 2017年第4期11卷 548-553页

作者： Xiaohong Shi Xuefei Wang Xixi Xu Yongliang Feng Shuzhen Li Shuying Feng Bo Wang Suping Wang Department of Epidemiology School of Public Health Shanxi Medical University Taiyuan 030001 China Department of Obstetrics and Gynaecology The Third PeopIeHospital of Taiyuan City Taiyuan 030001 China

This study determined the effect of hepatitis B virus （hbv） replication in peripheral blood mononuclear cell （PBMC） from HBsAg-positive mothers on hbv intrauterine transmission. A total of 150 HBsAg- positive mothers and their neonates were recruited in this study. Within 24 h after birth, hbv serological markers, serum hbv DNA, PBMC hbv relaxed circular DNA （rcDNA）, and covalently closed circular DNA （cccdna） were measured in the HBsAg-positive mothers and their neonates before passive-active immune prophylaxis. The relationship between hbv replication in PBMC and hbv intrauterine transmission was examined through Chi- square test and logistic regression. The rate of hbv intrauterine transmission was 8.00% （12/150） in the 150 neonates born to HBsAg-positive mothers. The positivities of PBMC hbv rcDNA and cceDNA in the HBsAg- positive mothers were 36.67% （55/150） and 10% （15/150）, respectively. Maternal PBMC hbv cccdna was a risk factor of hbv intrauterine transmission （OR = 6.003, 95% Ch 1.249-28.855）. Maternal serum HBeAg was a risk factor of PBMC hbv rcDNA （OR = 3.896, 95% CI： 1.929-7.876） and PBMC hbv cccdna （OR = 3.74, 95% CI： 1.186--11.793） in the HBsAg-positive mothers. Administration of hepatitis B immune globulin was a protective factor ofPBMC hbv cccdna （OR = 0.312, 95% CI： 0.102-0.954） during pregnancy. The positivity ofPBMC hbv rcDNA was related to that of cccdna in the HBsAg-positive mothers （Zz= 5.087, P = 0.024）. This study suggests that PBMC is a reservoir of hbv and an extrahepatic site for virus replication and plays a critical role in hbv intrauterine transmission.

关键词： PBMC hbv cccdna hbv rcDNA hbv intrauterine transmission

Hepatitis B virus replication

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World Journal of Gastroenterology 2007年第1期13卷 48-64页

作者： Juergen Beck Michael Nassal Department of Internal Medicine II/Molecular Biology University Hospital FreiburgGermany

Hepadnaviruses, including human hepatitis B virus （hbv）, replicate through reverse transcription of an RNA intermediate, the pregenomic RNA （pgRNA）. Despite this kinship to retroviruses, there are fundamental differences beyond the fact that hepadnavirions contain DNA instead of RNA. Most peculiar is the initiation of reverse transcription： it occurs by protein-priming, is strictly committed to using an RNA hairpin on the pgRNA, ε, as template, and depends on cellular chaperones; moreover, proper replication can apparently occur only in the specialized environment of intact nucleocapsids. This complexity has hampered an in-depth mechanistic understanding. The recent successful reconstitution in the test tube of active replication initiation complexes from purified components, for duck hbv （Dhbv）, now allows for the analysis of the biochemistry of hepadnaviral replication at the molecular level. Here we review the current state of knowledge at all steps of the hepadnaviral genome replication cycle, with emphasis on new insights that turned up by the use of such cellfree systems. At this time, they can, unfortunately, not be complemented by three-dimensional structural information on the involved components. However, at least for the ~ RNA element such information is emerging, raising expectations that combining biophysics with biochemistry and genetics will soon provide a powerful integrated approach for solving the many outstanding questions. The ultimate, though most challenging goal, will be to visualize the hepadnaviral reverse transcriptase in the act of synthesizing DNA, which will also have strong implications for drug development.

关键词： Chaperone-mediated reverse transcription hbv cccdna Hepadnavirus, P protein Pregenomic RNA Protein-priming reverse transcriptase RNA encapsidation signal

裂-A-五环三萜衍生物的合成及其体外抗hbv活性研究

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裂-A-五环三萜衍生物的合成及其体外抗HBV活性研究

作者：李志健南方医科大学

学位级别：硕士

慢性乙型肝炎是乙肝病毒(hbv)在宿主中不断增殖而引起的长期的进展性疾病,部分病程可迁延转为重型肝炎、肝硬化甚至肝癌。目前的治疗药物存在应答率低、副作用大、易产生耐药抗性以及停药后反弹等不足。中医药在病毒性疾病的治疗中具有... 详细信息

慢性乙型肝炎是乙肝病毒(hbv)在宿主中不断增殖而引起的长期的进展性疾病,部分病程可迁延转为重型肝炎、肝硬化甚至肝癌。目前的治疗药物存在应答率低、副作用大、易产生耐药抗性以及停药后反弹等不足。中医药在病毒性疾病的治疗中具有明显优势,也是获得先导化合物的重要来源。本论文基于前期研究,对具有抗病毒、保肝护肝作用的中药有效成分进行结构修饰,为寻找发现高效低毒的抗hbv药物提供依据。1.目的对具有抗病毒、保肝护肝的中药有效成分五环三萜化合物进行结构修饰,寻找具有抗hbv活性的先导化合物。2.方法2.1目标化合物的合成:以齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)、甘草次酸(GA)等五环三萜化合物为原料,采用Jones试剂氧化、Baeyer-Villiger氧化、碱水解等反应,制备裂-A-五环三萜衍生物,通过现代波谱技术手段对得到的各化合物进行结构鉴定。2.2对HepG2.2.15细胞的毒性:采用噻唑蓝(MTT)比色法,观察各化合物对细胞存活率的影响,并计算半数毒性浓度(CC50)。2.3对HBsAg、HBeAg分泌的抑制作用:采用酶联免疫法(ELISA),观察各化合物对hbv表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响,计算化合物对抗原的半数抑制浓度(IC50);采用流式细胞技术对活性较好的化合物进行验证。2.4对hbvDNA、hbvcccdna复制的抑制作用:采用荧光定量PCR法(FQ-PCR)筛选出具有较强抑制hbvDNA复制作用的化合物,再以FQ-PCR法评价筛选出的各化合物对cccdna复制的抑制作用。上述测得数据均采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析,判断组间差异是否有统计学意义。3.结果3.1 合成了七个裂-A-五环三萜-3,4-内酯:OA-2-1BV、OA-2-2BV、OA-Br-1-1、OA-4、GA-2、UA-2和F-1;三个内酯的水解产物OA-3、GA-3和UA-3;其中化合物GA-3、OA-2-2BV、OA-Br-1和OA-Br-1-1为新化合物,各化合物的结构经1H-NMR、13C-NMR、DEPT、IR、MS等现代波谱技术得到确证。3.2除OA-Br-1(CC50=100.4μM)外,其余各化合物半数毒性浓度CC50值均大于 400μM。3.3合成的裂-A-五环三萜-3,4-内酯对HBsAg、HBeAg两个抗原分泌的抑制作用均比原料有不同程度的提高,而水解产物相对于内酯化合物活性有轻微下降。活性最好的化合物OA-2-2BV和OA-4对HBeAg分泌的抑制作用随浓度增加而增大,ELISA实验测得二者IC50值分别为0.14μM和0.86μM,阳性对照药OA为813.6μM;流失细胞实验测得在25μM时,二者对HBeAg分泌抑制率分别达到33.5%和34.0%。各化合物对HBeAg分泌的抑制效果要优于对HBsAg的抑制。此外,裂-A-齐墩果烷型化合物(OA与GA系列)活性优于熊果烷型(UA系列)。C12/C13碳碳双键对抗原分泌的抑制活性有较大的贡献。3.4 合成的裂-A-五环三萜-3,4-内酯 OA-2-1BV、OA-2-2BV、OA-Br-1-1、OA-4、GA-2、UA-2和F-1对hbv DNA复制的抑制效果要优于其起始原料(hbvcccdna 复制的 IC50分别为 32.7μM、33.5μM和12.3μM,且呈现剂量依赖性,提示化合物GA-3是一个很有潜力的抗hbv先导化合物。在抑制hbv DNA复制方面,同样齐墩果烷型化合物(OA与GA系列)优于熊果烷型(UA系列)。C12/C13碳碳双键对hbv DNA复制的抑制活性有较大的贡献。4.结论裂-A-五环三萜衍生物能显著提高五环三萜化合物的抗hbv活性,相较于原料OA,化合物OA-2-2BV和OA-4对e抗原的分泌的抑制作用提高约1000倍;化合物GA-3对hbvDNA的抑制率为91.56%,与阳性对照药拉米夫定相当;化合物OA-2-2BV、OA-4和GA-3抑制hbv cccdna复制的IC50分别为32.7μM、33.5μM和12.3 μM,且呈现剂量依赖性。化合物GA-3是一个很有潜力的抗hbv先导化合物。裂-A-齐墩果烷型环化合物(OA与GA系列)抗hbv的活性优于熊果烷型(UA系列);C12/C13碳碳双键对抗hbv活性可能有较大的贡献。

关键词：裂-A-五环三萜衍生物乙肝病毒表面抗原乙肝病毒e抗原流式细胞技术乙肝病毒DNA hbv cccdna

hbv相关性肝病肝移植患者PBMCs及肝脏组织中hbvcccdna检测

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HBV相关性肝病肝移植患者PBMCs及肝脏组织中HBVcccDNA检测

作者：张荣重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:hbv相关性肝病肝移植术后乙肝复发已成为影响肝移植病人长期存活和生活质量的重要原因之一,其具体机制不明。通过对hbv相关性肝病患者行肝移植术的不同时期PBMCs及肝脏组织中hbv cccdna及血清中hbv DNA的检测,找到hbv感染可能的外... 详细信息

目的:hbv相关性肝病肝移植术后乙肝复发已成为影响肝移植病人长期存活和生活质量的重要原因之一,其具体机制不明。通过对hbv相关性肝病患者行肝移植术的不同时期PBMCs及肝脏组织中hbv cccdna及血清中hbv DNA的检测,找到hbv感染可能的外周细胞定位及探讨肝移植术后乙肝复发的可能途径。方法:用淋巴细胞分离液从外周血中分离出PMBCs,采用荧光定量PCR检测37例乙肝病毒相关性肝病患者行肝移植术前、术后及术后乙肝复发后三个时期的PBMCs及肝脏组织中hbv cccdna及血清hbv DNA. 结果:在37例乙肝相关性肝病患者行肝移植前,PBMCs和肝脏组织中hbv cccdna检测阳性分别为12例和6例,检出率分别为32.43%和16.22%,PBMCs中hbv cccdna拷贝范围为3.028～6.508×104Copies/ml,肝脏组织中hbv cccdna拷贝范围为4.158～6.234×104 Copies/ml。行肝移植后,PBMCs中hbv cccdna及血清中hbv DNA检测阳性各为1例和0例。6例肝移植术后乙肝复发的病例中PBMCs中hbv cccdna阳性为4例,肝脏组织中hbv cccdna阳性为1例,全部6例血清hbv DNA为阳性。结论:hbv相关性肝病患者肝移植术后,绝大多数病毒负荷已被清除的情况下,残留于PBMCs中的hbv以hbv cccdna为模板,重新在体内大量复制,然后再迁移到肝脏,从而导致肝移植术后乙肝复发,为进一步防治肝移植术后乙肝复发提供了新的思路。

关键词： hbv hbv cccdna PBMCs 肝移植乙肝复发

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抗乙型肝炎病毒药物的筛选和研究

抗乙型肝炎病毒药物的筛选和研究

作者：周侠中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

目的 (1)利用HepG2.2.15细胞培养体系,以HBsAg和HBeAg为指标对样品库(包括天然产物单体和粗提物)进行体外抗乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,hbv)活性筛选;(2)对筛选出有活性的化合物,进行初步构效关系探讨。检测hbv DNA拷贝数,初步研究... 详细信息

目的 (1)利用HepG2.2.15细胞培养体系,以HBsAg和HBeAg为指标对样品库(包括天然产物单体和粗提物)进行体外抗乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,hbv)活性筛选;(2)对筛选出有活性的化合物,进行初步构效关系探讨。检测hbv DNA拷贝数,初步研究其作用机制;(3)同时建立一种检测hbv cccdna的方法,研究抗hbv药物的作用机制和作用特点。方法选用阿德福韦酯为阳性药,用MTT法检测样品对HepG2.2.15细胞的毒性,ELISA法检测细胞上清中HBsAg、HBeAg的变化,以细胞的半数毒性浓度TC、半数抗原分泌抑制浓度IC、治疗指数TI(TI=TC/IC)为指标,对本实验室化合物库358个天然产物进行初筛,筛选出抗hbv的活性化合物。对初筛有活性样品,进一步复筛确认。选择两类代表性的活性化合物:白藜芦醇(resveratrol,反式3,4’,5-三羟基-二苯乙烯)和黄酮类化合物(flavonoids,以C6-C3-C6为母体结构)进行初步构效关系研究。合成和收集白藜芦醇衍生物15个,黄酮类化合物及其衍生物16个。用实时荧光定量PCR法(Taqman探针法)观察白藜芦醇及其衍生物与黄酮类化合物对HepG2.2.15细胞中hbv DNA拷贝数的影响。流式细胞仪检测白藜芦醇对HepG2.2.15的调亡作用,进一步探讨白藜芦醇抗hbv机制。另外,本课题进行了干复津、聚乙二醇化重组集成干扰素变异体注射液(PEG-IFNSA)体外抗hbv的研究。建立检测hbv cccdna的方法简述如下:构建hbv cccdna质粒作为标准品,用实时荧光定量PCR法(SYBR Green Ⅰ染料法)对hbv cccdna进行绝对定量,观察干复津、PEG-IFNSA对HepG2.2.15细胞中hbv cccdna的影响。结果 (1)阳性药阿德福韦酯对HepG2.2.15细胞的半数细胞毒性浓度TC为42.4±5.2μg/ml,抑制细胞分泌HBsAg、HBeAg的半数浓度IC分别为17.2±2.1μg/ml和84.8±4.3μg/ml,治疗指数TI分别为2.5±0.2和0.5±0.2。 (2)样品的筛选。对358个天然产物进行820样品次初筛和复筛,共筛选出68个化合物TI在1～2之间,60个化合物TI在2～10之间,26个化合物TI≥10。 (3)白藜芦醇及其衍生物在体外抗hbv作用。白藜芦醇的TC为

关键词：天然产物抗乙型肝炎病毒药物筛选 hbv cccdna 实时荧光定量PCR