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Pepino mosaic virus antagonizes plant m^(6)A modification by promoting the autophagic degradation of the m^(6)A writer hakai

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aBIOTECH 2023年第2期4卷 83-96页

作者： Hao He Linhao Ge Zhaolei Li Xueping Zhou Fangfang Li State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests Institute of Plant ProtectionChinese Academy of Agricultural SciencesBeijing100193China State Key Laboratory of Rice Biology Institute of BiotechnologyZhejiang UniversityHangzhou310058China

Autophagy plays an active anti-viral role in plants.Increasing evidence suggests that viruses can inhibit or manipulate autophagy,thereby winning the arms race between plants and viruses.Here,we demonstrate that overexpression of an m^(6)A writer from Solanum lycopersicum,Slhakai,could negatively regulate pepino mosaic virus(PepMV)infection,inhibit viral RNA and protein accumulations by affecting viral m^(6)A levels in tomato plants and vice versa.The PepMV-encoded RNA-dependent RNA polymerase(RdRP)directly interacts with Slhakai and reduces its protein accumulation.The RdRP-mediated decreased protein accumulation of Slhakai is sensitive to the autophagy inhibitor 3-methyladenine and is compromised by knocking down a core autophagy gene.Furthermore,PepMV RdRP could interact with an essential autophagy-related protein,SlBeclin1.RdRP,Slhakai,and SlBeclin1 interaction complexes form bright granules in the cytoplasm.Silencing of Beclin1 in Nicotiana benthamiana plants abolishes the RdRP-mediated degradation of Slhakai,indicating the requirement of Beclin1 in this process.This study uncovers that the PepMV RdRP exploits the autophagy pathway by interacting with SlBeclin1 to promote the autophagic degradation of the Slhakai protein,thereby inhibiting the m^(6)A modification-mediated plant defense responses.

关键词： Pepino mosaic virus hakai Autophagy Beclin1

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hakai介导乙氧基血根碱抗乳腺癌活性及其蛋白相互作用网络

Hakai介导乙氧基血根碱抗乳腺癌活性及其蛋白相互作用网络

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作者：陈学明安徽工业大学

学位级别：硕士

在全球女性癌症患者中,乳腺癌的发病率和死亡率居首位,新增病例不断增长,并且呈现年轻化趋势。尤其是三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer),因具有高迁移和侵袭性以及缺乏明确的治疗靶标,预后较差。化疗是乳腺癌治疗的主要手段... 详细信息

在全球女性癌症患者中,乳腺癌的发病率和死亡率居首位,新增病例不断增长,并且呈现年轻化趋势。尤其是三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer),因具有高迁移和侵袭性以及缺乏明确的治疗靶标,预后较差。化疗是乳腺癌治疗的主要手段之一,但临床常用的化疗药物仍存在副作用强以及易产生耐药等问题,迫切需要研究和开发新的乳腺癌治疗药物。乙氧基血根碱(Ethoxysanguinarine,ESG)是一种从传统中草药博落回中提取的苯并啡啶类生物碱,具有抗病毒、抗菌、抗炎和抗癌等生物活性,但其抗乳腺癌作用以及分子机制还未阐述清楚。本文主要研究ESG的抗乳腺癌活性,特别是对高转移性三阴性乳腺癌的作用及机制,并利用蛋白质组学技术对所涉及的hakai蛋白的相互作用网络进行初步分析,具体内容包括以下三个部分:(1)ESG对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。利用MTT法,发现ESG能剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞MCF7以及高转移性三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,48 hr的IC值分别为2.008±0.424μM和1.233±0.119μM。流式细胞仪检测结果显示,ESG可诱导乳腺癌细胞发生凋亡,免疫印迹结果进一步显示,凋亡相关通路蛋白Caspase-8、Caspase-9以及PARP均发生明显的切割,提示ESG可激活外源性以及内源性两种凋亡通路诱导乳腺癌细胞发生凋亡。ESG和临床常用的三阴性乳腺癌治疗药物多西紫杉醇(Docetaxel,Doc)的联合作用结果显示,两者能够协同抑制MDA-MB-231细胞的增殖,机制上,可能与ESG抑制CIP2A/PP2A/p AKT通路有关。(2)ESG对乳腺癌细胞迁移的影响。划痕实验和Transwell实验结果表明,ESG能够显著抑制MDA-MB-231的迁移。分子机制研究发现,ESG可引起上皮标志物E-cadherin上调和间充质标志物N-cadherin下调,且上调E-cadherin可能与其抑制E-cadherin蛋白的E3泛素连接酶hakai有关,提示ESG具有潜在的抑制乳腺癌上皮充间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)能力。ESG和Doc联合作用结果显示,二者低剂量联合使用能协同抑制MDA-MB-231细胞迁移,机制上,同样与ESG能够下调hakai蛋白有关。以上结果显示,hakai蛋白在ESG的抗乳腺癌活性中具有重要功能。(3)hakai蛋白相互作用网络研究。鉴于hakai蛋白在乳腺癌中的蛋白作用网络还未阐述清楚,采用临近依赖的生物素识别技术(Proximity-dependent Biotin Identification Technology,Bio ID),从蛋白质组学水平系统分析了hakai蛋白的相互作用网络。首先,成功构建了只表达生物素连接酶的Bio ID-only载体以及表达hakai和生物素连接酶融合蛋白的hakai-Bio ID载体。随后,通过阳离子脂质体转染方法,将两种载体分别转入MDA-MB-231细胞,免疫荧光共定位结果表明,二者都能在MDA-MB-231细胞中正常表达和定位。此外,免疫印迹结果显示,Bio ID-only以及hakai-Bio ID融合蛋白均实现高效的表达且具备生物素标记功能。最后,利用链霉亲和素修饰的磁珠从细胞中分别纯化生物素化的蛋白,经质谱鉴定和后续的筛选,共发现85种潜在的hakai相互作用蛋白;富集分析显示,这些蛋白参与核小体结合、RNA结合、粘附蛋白结合和ER结合等调控通路,包括多种在癌症中具有重要功能的蛋白,如EGFR、RAB11A和KRAS等。综上所述,本研究发现ESG能调控CIP2A/PP2A/p AKT以及hakai/E-cadherin通路,进而抑制乳腺癌细胞增殖、迁移并诱导凋亡,且和Doc联合使用具有协同作用,可为基于ESG结构的抗乳腺癌药物开发奠定基础。此外,利用Bio ID技术,鉴定出85种候选的hakai相互作用蛋白,多种蛋白与癌症的发生发展或治疗密切相关,后续的深入研究有利于进一步阐明hakai蛋白在乳腺癌中的功能。

关键词：乳腺癌乙氧基血根碱多西紫杉醇 hakai 临近依赖的生物素识别技术

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功能化四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备及用于hakai质粒DNA的分离纯化以及负载

功能化四氧化三铁磁性纳米颗粒的制备及用于Hakai质粒DNA的分离纯...

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作者：吴雨晴安徽工业大学

学位级别：硕士

磁性纳米颗粒(Magnetic nanoparticles,MNPs)作为一类新型功能材料,因其众多的优良性能被广泛应用于生物医学等领域。本文主要研究功能化的四氧化三铁MNPs在核酸分离纯化以及基因递送两方面的应用,具体内容分为三部分:(1)hakai蛋白作为... 详细信息

磁性纳米颗粒(Magnetic nanoparticles,MNPs)作为一类新型功能材料,因其众多的优良性能被广泛应用于生物医学等领域。本文主要研究功能化的四氧化三铁MNPs在核酸分离纯化以及基因递送两方面的应用,具体内容分为三部分:(1)hakai蛋白作为肺癌治疗新靶标的探索性研究。我们首次发现hakai蛋白在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞系中高表达,且利用siRNA技术敲低hakai的表达能显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移以及侵袭,提示hakai蛋白在NSCLC发生以及发展中起到重要作用,可作为一个潜在的治疗新靶点。这部分结果为我们后续的功能化四氧化三铁磁性纳米材料对hakai质粒DNA的分离纯化以及负载研究奠定了基础。(2)合成乙二胺修饰的酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒(EDASHT-MNPs)并深入研究其在核酸分离纯化中的应用。我们首先对经典的共沉淀法合成步骤加以修改并获得MNPs,进一步对该材料进行酒石酸氢钠包裹以及乙二胺修饰,获得EDA-SHT-MNPs,利用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射仪(DLS)、X-射线光电子能谱分析(XPS)等对MNPs的微观形貌以及EDA-SHTMNPs的表面电位、表面修饰等进行表征。随后,我们一方面系统探究了EDASHT-MNPs对细菌的hakai质粒DNA的提取情况以及提取产物的生物活性;另一方面,为了验证EDA-SHT-MNPs提取DNA是否具有广谱性,我们进一步检测其对哺乳动物细胞基因组DNA的提取效果。结果表明,本课题合成的EDASHT-MNPs能高效提取质粒DNA以及基因组DNA且不影响DNA的生物活性;此外,与商品化试剂盒相比,EDA-SHT-MNPs在DNA提取总量和纯度方面均具有优势,体现出较好的应用价值。(3)新型磁性纳米材料用于基因转染或基因治疗的初步研究。如上所述,在第一部分研究工作中,我们发现hakai蛋白可作为一个潜在NSCLC治疗靶标。且在第二部分工作中,我们已证明表面功能化的磁性纳米材料具有较好的DNA结合能力。在这部分工作中,利用聚酰胺-胺树枝状大分子(Polyamidoamine dendrimer,PAMAM)具有良好的生物相容性特点,结合在第二部分中所获得的磁性纳米材料,重新设计并合成出一种新型磁性纳米材料,以hakai基因为研究对象,探索该材料在基因转染或基因治疗中的应用。我们先以乙二胺为核心、丙烯酸甲酯为原料,通过迈克尔加成反应以及迭代法合成了三代聚酰胺-胺树枝状大分子(generation-3 polyamidoamine dendrimer,G3),然后利用G3直接包裹四氧化三铁磁性纳米颗粒或者修饰酒石酸氢钠包裹的四氧化三铁磁性纳米颗粒,得到两种表面修饰阳离子聚合物的磁性纳米颗粒,分别命名为G3-MNPs以及G3-SHT-MNPs。通过TEM、DLS等方法,我们表征了该材料的微观形貌、表面电位以及尺寸大小。进而,利用体外核酸结合和细胞毒性实验,我们分别检测了两种材料与hakai质粒DNA的结合情况以及对细胞的毒性作用。初步的研究结果显示,与G3-MNPs相比,G3-SHT-MNPs与质粒的体外结合效果较好,且毒性更低,体现出较好的生物相容性。以上结果表明,G3-SHT-MNPs可作为潜在的基因转染以及治疗载体,未来进一步的开发,有望用于基于hakai或其它靶标的基因治疗研究。综上所述,本文首次证明hakai蛋白可作为一个潜在的NSCLC治疗新靶标,以hakai基因为研究对象,本文成功合成了EDA-SHT-MNPs以及G3-SHT-MNPs,并证明前者能高效的提取细菌中hakai质粒DNA以及细胞基因组DNA,可用于后续的核酸提取应用研究等;后者体现出潜在的基因转染以及治疗功能,具有重要的应用前景。

关键词：磁性纳米颗粒 hakai 核酸分离纯化基因递送

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