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ha蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感疫苗免疫原性影响

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中国动物传染病学报 2024年

作者：潘晟辉牛世奇王晨阳吕雪华张志飞许榜丰滕巧泱闫大为苑纯秀李泽君刘芹防中国农业科学院上海兽医研究所

为了评价ha蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感病毒ha蛋白免疫原性的影响，本研究将ha蛋白裂解位点从PSRSSR↓GLF突变为TSNSS↓GLF，引入了两个N-糖基化位点，将其命名为ha-2N。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建出两株表达H9/ha的重组火... 详细信息

为了评价ha蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感病毒ha蛋白免疫原性的影响，本研究将ha蛋白裂解位点从PSRSSR↓GLF突变为TSNSS↓GLF，引入了两个N-糖基化位点，将其命名为ha-2N。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建出两株表达H9/ha的重组火鸡疱疹病毒（rHVT-ha和rHVT-ha-2N），通过间接免疫荧光实验鉴定重组病毒中的外源蛋白H9/ha均可以正确表达，Western Blot结果显示经过裂解位点改造后的ha蛋白不发生裂解，说明缺失裂解位点后，ha蛋白不能正常裂解为ha1与ha2蛋白，保持了融合前状态。将重组病毒分别免疫SPF鸡，采集血清进行H9抗体效价的监测，结果显示，针对ha蛋白裂解位点改造过的重组病毒可以在宿主体内诱导免疫应答，但是抗体效价低于带有裂解位点的重组病毒，此结果说明了ha蛋白裂解位点突变明显降低了基于HVT载体的H9N2亚型禽流感疫苗免疫原性。本研究对H9N2亚型禽流感疫苗设计与免疫效力评估具有参考意义。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒 ha蛋白裂解位点火鸡疱疹病毒

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒ha蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

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畜牧兽医学报 2024年第5期55卷 2123-2134页

作者：吕亚迪杨洁谢文婷徐婷陈瑞爱华南农业大学兽医学院广州510642 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心肇庆526238 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司肇庆526238 肇庆大华农生物药品有限公司肇庆526238

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的ha蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF... 详细信息

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的ha蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合ha和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性ha蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的ha蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-ha和rDHN3mF-2ha。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(ha)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后ha基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的ha蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2ha较rDHN3mF-ha更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感ha蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒 ha蛋白新城疫病毒免疫原性载体疫苗免疫保护效率

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H5N8亚型禽流感病毒ha蛋白的原核及真核表达及兔多克隆抗体的制备

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中国病原生物学杂志 2024年第7期19卷 745-750页

作者：刘静王聪颖梁志鹏梁昭平刘闰栀张新宇何杰珩陈高婕闫战飞池仕红袁生郭锦玥黄淑坚温峰佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528225 华南农业大学兽医学院

目的构建H5N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)ha基因的原核和真核表达载体,分别在*** Rosetta(DE3)和Sf9中进行表达,并制备兔多克隆抗体。方法采用RT-PCR扩增H5N8亚型AIV的ha基因,并将其克隆至原核表达载体pTac-His-MBP-P... 详细信息

目的构建H5N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)ha基因的原核和真核表达载体,分别在*** Rosetta(DE3)和Sf9中进行表达,并制备兔多克隆抗体。方法采用RT-PCR扩增H5N8亚型AIV的ha基因,并将其克隆至原核表达载体pTac-His-MBP-PreScission中,再转化至Rosetta(DE3)中,利用IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE及蛋白免疫印迹(Western blot, WB)鉴定ha蛋白的表达,并优化IPTG浓度、诱导时间和温度以提高表达效率。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗H5N8亚型AIV的ha蛋白多克隆抗体,通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测其特异性和效价。同时,将ha基因克隆到真核表达载体pFastBacHTA中,将其瞬时转染Sf9细胞并扩增3代,最后通过WB和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay, IFA)验证表达产物。结果成功构建了ha基因的原核重组质粒pTac-ha-DE3和真核重组质粒pFast-ha。经SDS-PAGE及WB验证该蛋白分子质量约110 ku,最佳表达条件为IPTG浓度为0.8 mmol/L、温度37℃和诱导时间为4 h。ELISA检测显示兔多克隆抗体效价为1∶102 400。成功将真核重组质粒pFast-ha转化入DH10Bac感受态细胞中,证明ha基因成功转座。Bacmid-ha转染Sf9细胞后观察到细胞病变,WB和IFA检测表明重组杆状病毒Bac-ha感染的Sf9细胞能够表达ha蛋白。结论本研究初步探究了H5N8亚型AIV ha蛋白的表达条件及免疫原性,并且具有良好的免疫原性和反应原性,为后续建立ELISA诊断试剂盒及H5N8 AIV疫苗的研制提供了一定的参考价值。

关键词：禽流感病毒 H5N8亚型 ha蛋白原核表达真核表达多克隆抗体

表达H7N9亚型禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒构建及其免疫效果评估

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中国家禽 2024年

作者：万志敏李亚锋孙建文姜文杰赵喆泓汤婷谢泉李拓凡邵红霞秦爱建钱琨叶建强扬州大学兽医学院禽类预防医学教育部重点实验室江苏省动物预防医学重点实验室江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州大学农业科技发展研究院(国际联合实验室) 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州市邗江区西湖畜牧兽医技术推广服务站

为构建H7N9亚型禽流感病毒和血清4型禽腺病毒（FAdV-4）的二联疫苗候选株，试验通过CRISPR/Cas9和Cre-Loxp系统，以课题组前期构建的表达EGFP蛋白的重组病毒FAdV4-EGFP为载体，构建能够稳定表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素（ha）蛋白的重... 详细信息

为构建H7N9亚型禽流感病毒和血清4型禽腺病毒（FAdV-4）的二联疫苗候选株，试验通过CRISPR/Cas9和Cre-Loxp系统，以课题组前期构建的表达EGFP蛋白的重组病毒FAdV4-EGFP为载体，构建能够稳定表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素（ha）蛋白的重组血清4型腺病毒；并通过PCR、间接免疫荧光试验（IFA）、Western blot试验以及SPF鸡保护性试验等方法，探究此重组病毒体外生物学特性并评估其为鸡提供的保护力。结果显示：研究成功构建能稳定表达H7N9禽流感亚型病毒ha蛋白的重组血清4型腺病毒，命名为FAdV4-H7;FAdV4-H7能在LMH细胞高效复制，并能在LMH细胞传代15次后仍能稳定表达ha蛋白；FAdV4-H7不仅高度致弱，而且能诱导机体产生高滴度针对H7N9亚型禽流感病毒HI抗体和FAdV-4的中和抗体，能为SPF鸡提供足够保护来抵抗致死性FAdV-4感染。研究表明，试验成功构建了重组病毒FAdV4-H7，为H7N9亚型禽流感病毒和FAdV-4的联防联控提供了二联苗候选疫苗株。

关键词： H7N9亚型禽流感病毒 ha蛋白重组血清4型腺病毒 CRISPR/Cas9 疫苗

H5N1亚型禽流感病毒ha蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

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河南农业科学 2024年第3期53卷 125-132页

作者：屈小天王雅楠许倩茹李雪洋张申立张二芹张改平河南农业大学生命科学学院河南郑州450046 吉林大学动物医学院吉林长春130062 河南农业大学动物医学院/国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450046 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002

为制备H5N1亚型禽流感病毒ha蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组ha蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-ha,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将... 详细信息

为制备H5N1亚型禽流感病毒ha蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组ha蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-ha,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-ha通过电转化法导入根癌农杆菌Eha105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,ha基因已插入到水稻基因组中,重组ha基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,ha蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组ha蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组ha蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组ha蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒ha重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组ha蛋白。

关键词： H5N1亚型禽流感病毒 ha蛋白水稻胚乳表达蛋白质纯化

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ha蛋白位点变异影响H7N9亚型流感病毒特性的研究进展

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畜牧兽医学报 2021年第8期52卷 2093-2106页

作者：严雅瑶顾敏刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室扬州225009 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009 江苏省人兽共患病学重点实验室扬州225009

2013年春,我国首次出现人感染H7N9亚型禽流感疫情,对家禽养殖和公众健康均产生了严重危害,并且在第5波流行期又演变出血凝素(hemagglutinin,ha)蛋白裂解位点处存在插入突变的高致病性禽流感病毒株。ha作为A型流感病毒表面表达丰度最高... 详细信息

2013年春,我国首次出现人感染H7N9亚型禽流感疫情,对家禽养殖和公众健康均产生了严重危害,并且在第5波流行期又演变出血凝素(hemagglutinin,ha)蛋白裂解位点处存在插入突变的高致病性禽流感病毒株。ha作为A型流感病毒表面表达丰度最高的糖蛋白,在介导病毒与宿主细胞表面受体的结合、促进病毒囊膜与细胞膜的融合、刺激机体产生中和抗体等方面具有至关重要的作用。本文围绕H7N9病毒,简要综述了ha蛋白的结构与功能,及其关键功能氨基酸位点变异影响病毒生物学特性的研究进展,以期为深入解析ha蛋白在H7N9病毒感染致病中的作用提供重要参考。

关键词：流感病毒 H7N9 ha蛋白功能氨基酸位点感染与致病

欧亚类禽型H1N1猪流感病毒ha蛋白的表达及免疫原性评估

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中国农业科学 2019年第5期52卷 930-938页

作者：贾云慧许程志隋金钰吴运谱许榜丰陈艳杨焕良乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室

【目的】表达欧亚类禽型(eurasian avian-like,EA)H1N1猪流感病毒(SIV)的血凝素(ha)蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013(H1N1)(ZJ245)的ha基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-ha(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光(IFA)检测和Western blot检测ha蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-ha(ZJ245)经肌肉注射途径、以100μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠(I组和II组),间隔3周后进行加强免疫(二免);同等数量的小鼠以相同方式注射100μL无菌PBS作为非免疫对照组(III组和IV组)。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制(HI)试验和病毒中和(VN)试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠(I组和III组)用50μL(106.0EID50)的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组(II组和IV组)用A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)(HLJ44)病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-ha(ZJ245)的免疫保护效果。【结果】经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的ha基因的已正确克隆至真核表达质粒p CAGGS中获得重组质粒pCAGGS-ha(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的ha蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-ha(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。106.0 EID50的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-ha(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;106.0 EID50的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低(Pha(ZJ245)能够有效表达病毒ha蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒pCAGGS-ha(ZJ245)具有良好的免疫原性。

关键词：欧亚类禽型H1N1猪流感病毒 ha蛋白重组质粒免疫原性 DNA疫苗

H1N1亚型猪流感病毒ha蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

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中国农业科学 2022年第4期55卷 816-824页

作者：杨时鳗许程志许榜丰吴运谱贾云慧乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室辽宁中医药大学实验动物中心

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的，笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行ha基因替换以后，病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点，为进一步揭示流... 详细信息

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的，笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行ha基因替换以后，病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点，为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。【方法】对ZD71和SY130的ha蛋白氨基酸序列进行比对，确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物，构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量（EID50）。将拯救的亲本病毒、ha单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞，测定病毒的体外复制能力；将上述各株病毒以50μL含106EID50的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠，分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器，匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况；将病毒分别以50μL含101-106 EID50的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠，感染后每天称量小鼠体重，当小鼠体重下降比率超过25%时判定为死亡，统计死亡情况，测定病毒的小鼠半数致死量（MLD50），评估各突变病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒进行分析比较后，获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。【结果】ZD71和SY130病毒ha蛋白共存在4个氨基酸差异位点，分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认，分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况，结果发现与亲本病毒rZD71相比较，突变病毒rZD71-ha/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后，复制滴度均显著提高；与rSY130相比较，突变病毒rSY130-ha/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后，复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现ha 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒rZD71相比，225位氨基酸由G突变为E后，病毒rZD71-ha/G225E的MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0 log10EID50；病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到，而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。【结论】ha蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用，提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况，为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。

关键词：猪流感病毒 ha蛋白氨基酸致病性

ha蛋白S227N突变对H7N9亚型禽流感病毒生物学特性与疫苗免疫原性的影响

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中国兽医学报 2021年第3期41卷 505-511页

作者：胡增垒石磊赵江艳顾晗胡娇曹永忠刘秀梵扬州大学教育部农业与农产品安全国际联合实验室江苏扬州225009 扬州大学农业科技发展研究院江苏扬州225009 扬州大学兽医学院农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009 扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室江苏扬州225009

某些种类H7N9亚型禽流感疫苗诱导的血凝抑制(HI)抗体较低,可能与诊断抗原受体结合特性和HI试验的敏感性有关。本研究主要评价H7N9亚型禽流感病毒(AIV)ha蛋白受体结合区第227位丝氨酸(S)到天冬氨酰(N)的突变对病毒复制、受体结合特性与... 详细信息

某些种类H7N9亚型禽流感疫苗诱导的血凝抑制(HI)抗体较低,可能与诊断抗原受体结合特性和HI试验的敏感性有关。本研究主要评价H7N9亚型禽流感病毒(AIV)ha蛋白受体结合区第227位丝氨酸(S)到天冬氨酰(N)的突变对病毒复制、受体结合特性与免疫原性的影响。结果显示,S227N突变对H7N9亚型AIV的复制性能无明显影响,可显著降低病毒与α-2,3及α-2,6唾液酸受体的亲和力,并导致该位点在ha蛋白表面构象改变。此外,S227N突变显著提高HI试验的敏感性与H7N9亚型灭活疫苗诱导的HI抗体滴度,对H7N9亚型免疫血清的交叉反应性无明显影响。结果表明,ha S227N突变可改变H7N9亚型AIV的受体结合特性、提高HI试验的敏感性、增强H7N9亚型疫苗的免疫原性。研究结果对于H7N9亚型禽流感疫苗免疫原性的改善及疫苗的临床评价有重要参考意义。

关键词： H7N9亚型禽流感 ha蛋白受体结合特性免疫原性疫苗 HI试验