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基于表面电荷可控荧光蛋白在构建智能响应型载体的应用

基于表面电荷可控荧光蛋白在构建智能响应型载体的应用

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作者：赵崑荔湖南大学

学位级别：硕士

基因转导是将目的基因导入靶细胞内,然后释放目的基因,使得目的基因进行表达,从而达到治疗特定疾病的目的。基因转导在广泛基因的结构功能分析,基因的调控表达,基因治疗及基因改造等方面有着广泛的应用等。尽管有很多的转染体系已经发... 详细信息

基因转导是将目的基因导入靶细胞内,然后释放目的基因,使得目的基因进行表达,从而达到治疗特定疾病的目的。基因转导在广泛基因的结构功能分析,基因的调控表达,基因治疗及基因改造等方面有着广泛的应用等。尽管有很多的转染体系已经发展为有效的商业试剂,但存在免疫反应,细胞毒性,稳定性及非智能型响应等问题。因此设计出能根据外界环境刺激与核酸自组装的载体,如ph响应和离子响应型,是十分有必要的。最近,对Scgfp表面进行重构发展出一种表面含有39组氨酸残基的新型超电荷荧光蛋白（h39gfp）。h39gfp表面上组氨酸残基有其独特的化学性质,如ph依赖的电离或接受质子的性质,以及螯合金属离子的能力。因此,我们设想通过ph和金属离子调控h39gfp的表面电荷,使h39gfp能像Scgfp 一样表面呈正电性,从而运载核酸进入细胞内。因此,本文尝试将h39gfp发展为一种外界刺激响应型载体,主要研究内容如下:（1）相对于正常生理条件（ph为7.0-7.4）,肿瘤的微环境处于弱酸条件（ph为5.7-7.0）。组氨酸残基中咪唑基团的pKa为6.10,当溶液的ph为6.0时,理论上h39gfp,所带电荷为+26。此外,基团咪唑与金属离子配位也可使h39gfp表面呈正电性。动态光散射技术,测得h39gfp在弱酸性、Ni2+存在时的Zeta电位分别为4.56± 0.45 mV 和 6.69± 1.16 mV,而 ph 为 7.4 时 h39gfp 的 Zeta 为 1.72 ± 0.24 mv。上述实验结果表明在弱酸或镍离子条件能使h39gfp带大量正电。并通过原子力显微镜证明带大量正电的h39gfp能和核酸形成高为35-70 nm的复合物,而在ph为7.0条件下,h39gfp与核酸的高度仅有5nm,说明h39gfp只有在带大量正电时,可以与核酸结合,同时用带有荧光基团的核酸,通过激光共聚焦显微镜成像支持该结论。证实了在不同刺激下h39gfp可以和核酸自组装。（2）根据h39gfp表面的变化,我们利用微环境变化作为类似激活剂物质去实现“或”和“与”逻辑门的构建。我们将ph的变化和镍离子的存在作为输入条件,h39gfp（或DNA）进入细胞情况作为输出信息,构建出“或”逻辑门。通过激光共聚焦显微成像及流式细胞仪可知,在仅满足一个条件时,h39gfp（DNA）就能进入细胞,完全符合“或”逻辑门。另外,我们还通过定义DNA的加入及镍离子的存在为输入信息,DNA进入细胞情况作为输出信息,构建出“与”逻辑门。并通过激光共聚焦成像可知,当且仅当DNA及镍离子都加入的条件下,DNA才能进入细胞,符合“和”逻辑门。基于以上结果,我们发现在ph6.0条件时,h39gfp能将siRNA带进细胞,在48小时后,通过免疫印迹实验证明,siRNA能很好的干扰目标蛋白β-actin,并达到48%干扰效率,证实了 h39gfp作为核酸载体能保持核酸的相关功能。（3）基于h39gfp作为载体,我们还构建了 ATP响应型的药物释放体系,来提高抗癌药物的释放效率。这里我们利用三磷酸腺苷（ATP）作为引发剂来可控释放抗癌药物。由于其功能化加入了 ATP的核酸适配体,因此可以在ATP浓度较大的环境中,改变构象从而释放已插入DNA的药物阿霉素（Dox）。我们通过流式细胞仪及细胞毒性实验,发现单独的ATP-Duplex/Dox无法进入细胞,并释放Dox,而有h39gfp作为载体时,ATP-Duplex/Dox能很好地进入细胞,证实了 h39gfp/ATP-Duplex/Dox能很好进入细胞并释放药物。

关键词： h39gfp 核酸载体纳米复合物逻辑门 ph-响应镍离子响应 ATP-响应

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基于绿色荧光蛋白的蛋白酶活性检测与核酸运输新方法

基于绿色荧光蛋白的蛋白酶活性检测与核酸运输新方法

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作者：唐榆湖南大学

学位级别：硕士

蛋白酶普遍存在于生物体内,并在各项生命活动中起着重要作用。因此,蛋白酶活性的检测对相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。基因治疗通过将外源基因导入到细胞中的方式来实现精准医学治疗。基因治疗主要针对的是一些严重威胁人类健康... 详细信息

蛋白酶普遍存在于生物体内,并在各项生命活动中起着重要作用。因此,蛋白酶活性的检测对相关疾病的诊断和治疗有着重要的意义。基因治疗通过将外源基因导入到细胞中的方式来实现精准医学治疗。基因治疗主要针对的是一些严重威胁人类健康的疾病,包括遗传病、癌症和感染性疾病(如艾滋病)等。目前,设计安全有效、靶向性好的基因运输载体已经成为了基因治疗的主要挑战。组氨酸侧链中的咪唑基团能够与金属离子配位结合并且可以响应ph变化改变自身电荷。因此本文利用表面带有多个组氨酸的hgfp和N端带有组氨酸标签(his-tag)的gfp,发展了新的蛋白酶分析传感方法,并实现了智能响应型核酸运输,主要研究内容如下:(1)构建了一种新的碱性磷酸酶活性的分析传感方法。组氨酸具有与金属离子配位结合的能力,因此含有多个组氨酸的hgfp与Cu具有很高的亲和力,并且Cu能够有效猝灭hgfp的荧光。当焦磷酸盐(PPi)存在时,PPi能与Cu结合生成配合物,阻止Cu猝灭hgfp的荧光,从而可以实现对PPi的检测。而PPi作为碱性磷酸酶(ALP)的底物,可以被ALP水解生成磷酸盐,丧失结合Cu的能力,因此该方法可以进一步应用于ALP的活性的检测以及抑制剂磷酸盐的分析。本方法具有较宽的线性范围0.1–250 U/L,检测限为0.08 U/L,并且有免标记、快速简便等优点。(2)利用hgfp能够智能运载siRNA进入细胞的性质,实现RNA干扰。课题组前期工作发现,h和Ni能够调控hgfp的表面电荷,使hgfp通过静电作用携带核酸进入细胞。在此基础上,本文利用hgfp成功地将siRNA运送到细胞中,并分别从mRNA水平和蛋白表达水平验证了所运输的siRNA可以有效地干扰目的蛋白的表达。考虑到癌症组织微环境的弱酸性特征,hgfp有望作为一种有效的载体实现功能性生物大分子的智能运输,并应用于癌症治疗。(3)我们探究了N端带有his-tag的gfp与血红素(hemin)之间的相互作用,并发展了一种新的基于gfp/hemin复合物的凝血酶活性检测方法。因为his-tag能够与过渡金属原子配位结合,而hemin的卟啉环结构中有一个Fe原子,因此hemin能够与his-tag结合。同时,hemin作为良好的电子受体,与his-tag结合后能够以光致电子转移的方式猝灭gfp的荧光。我们利用gfp和his-tag之间的凝血酶酶切位点,成功地将gfp/hemin复合物应用于凝血酶活性的检测。

关键词： h39gfp 金属离子碱性磷酸酶 ph响应核酸运输 gfp/hemin复合物凝血酶

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