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沙棘花青素提取物对双氧水诱导的h1299细胞损伤的保护作用及Nrf2/hO-1通路的影响

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食品工业科技 2023年第6期44卷 396-404页

作者：郑玉荣陈龙王晓李军李宝国山东中医药大学山东济南250355 齐鲁工业大学(山东省科学院)山东省分析测试中心山东济南250014

目的:研究沙棘花青素提取物(The anthocyanidin extract of hippophae rhamnoides L.,hRAE)对双氧水诱导h1299细胞氧化损伤的保护作用及其机制。方法:利用双氧水诱导h1299细胞氧化损伤模型,采用MTT法检测hRAE对细胞活力的影响,采用荧光... 详细信息

目的:研究沙棘花青素提取物(The anthocyanidin extract of hippophae rhamnoides L.,hRAE)对双氧水诱导h1299细胞氧化损伤的保护作用及其机制。方法:利用双氧水诱导h1299细胞氧化损伤模型,采用MTT法检测hRAE对细胞活力的影响,采用荧光探针DCFh-DA检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量;采用试剂盒分别测定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathion peroxidase,GSh-Px)及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量;采用Western Blot法检测血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,hO-1)、醌氧化还原酶-1(NAD(P)h quinine oxidoreductase 1,NQO1)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch like ECh-associated protein 1,Keap1)和核转录因子E2相关因子(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)的蛋白质水平;采用相关数据库和软件对沙棘花青素提取物的关键活性成分表儿茶素和儿茶素与氧化应激关键靶点蛋白Nrf2进行分子对接验证。结果:MTT实验表明,在0~800μg/mL浓度范围内hRAE对细胞活力无显著性抑制作用(P>0.05);与模型组相比,给药组中MDA水平下降,SOD、CAT和GSh-Px等活性均有不同程度升高(PhRAE可显著(PhO-1、NQO1、KEAP和Nrf2的蛋白质水平(Ph1299细胞氧化损伤,其机制可能与促进Nrf2/hO-1信号通路的激活有关。

关键词：沙棘花青素提取物 h1299细胞氧化应激 Nrf2/hO-1通路活性氧

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h1299细胞热损伤后DNA双链断裂延迟性形成及其机制初探

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H1299细胞热损伤后DNA双链断裂延迟性形成及其机制初探

作者：孙婷南方医科大学

学位级别：硕士

1、背景和目的肿瘤热疗是指采取各种加热方式提高全身和(或)肿瘤组织(局部)的温度,利用热作用及其继发效应来治疗恶性肿瘤的方法。热疗应用于肿瘤治疗已有上百年历史,建立在现代科学基础上的肿瘤热疗学始于20世纪60年代初,之后取得了许... 详细信息

1、背景和目的肿瘤热疗是指采取各种加热方式提高全身和(或)肿瘤组织(局部)的温度,利用热作用及其继发效应来治疗恶性肿瘤的方法。热疗应用于肿瘤治疗已有上百年历史,建立在现代科学基础上的肿瘤热疗学始于20世纪60年代初,之后取得了许多突破性的进展。大量的体外实验和临床资料显示,肿瘤热疗虽然不能取代手术、化疗或放疗作为一种独立的肿瘤治疗手段,但它对化疗、放疗和手术等肿瘤治疗手段具有明显的增效和补充作用。正因为如此,肿瘤热疗近年来发展迅速,成为继手术、放疗、化疗和生物治疗之后又一重要的肿瘤治疗手段。1996年德国学者Gordon等提出磁流体热疗(magnetic fluid hyperthermia,MFh)新技术后,热疗再次成为肿瘤治疗领域的研究热点。随着对热疗治疗肿瘤机制研究的不断深入,人们逐渐能从细胞水平和分子生物学水平认识到热作用对癌细胞结构、功能和生长代谢所造成的影响,从而对热效应治疗肿瘤的现象作出科学的解释。肿瘤热疗分为温热疗法(40-42℃)、高热疗法(43-47℃)、热消融疗法(>47℃)。温热疗法所需热作用时间较长,患者不易耐受长时间的热处理,故临床应用较少;热消融治疗对肿瘤病灶的体积及位置要求较高,并且热消融对肿瘤组织及其周围正常组织可造成无差异的凝固性坏死,其临床应用亦受到限制;故目前临床应用及实验研究较多的为高热疗法,由于肿瘤与正常组织微循环的差异,此热处理可在不伤害正常细胞的情况下“特异性”杀伤肿瘤细胞;其作用机制主要有以下几点;1、直接杀伤作用,其理论依据是实验发现热处理后肿瘤细胞的各种生物膜以及细胞骨架受到了破坏进而影响其流动性及渗透性;热处理还可破坏细胞内的多种蛋白进而影响DNA的复制、转录、表达等活动,最终导致细胞死亡。2、诱导凋亡作用,研究发现热损伤后细胞内caspase-3等促进细胞凋亡相关基因表达增强,survivin等凋亡抑制基因的表达降低;最后通过线粒体途径或死亡受体途径促进肿瘤细胞凋亡。3、抑制侵袭、转移作用,肿瘤组织加热后降解细胞外基质的蛋白水解酶显著减少,而E-钙粘素等细胞间粘附分子明显增多,此两者可降低肿瘤细胞的侵袭、迁移能力。4、提高机体免疫作用,肿瘤的发生、发展与机体免疫状态密切相关,文献报道热疗后IL-6、CD4、CD57等体液免疫因子在肿瘤病灶大量分布,产生此类细胞因子的单核巨噬细胞及T、B细胞也聚集于此,从而印证了热疗可提高机体体液及细胞免疫功能达到抗肿瘤目的。由于缺乏有效的热传递及热探测技术,临床上热疗常与放疗联用。其联用机制之一是放、热疗具有周期互补作用：放疗抵抗的S期细胞对热疗敏感;热疗增敏放疗疗效的另一机制是热疗可抑制放疗后DNA双链断裂(DNA double strands break,DSB)的修复。有研究者猜想热疗是否亦可导致DSB,目前的研究结果显示热疗可以在非S期细胞内形成DSB,S期细胞不能或仅形成少量的DSB。众所周知,DSB是最严重的DNA损伤,研究报道细胞内存在一个DSB未修复即可导致细胞死亡。故热损伤后S期细胞内无DSB形成与S期细胞热敏感是相矛盾的。由于肿瘤细胞的增殖能力远远大于正常细胞,即肿瘤组织内处于复制状态的细胞比例远远高于正常组织,所以明确S期细胞热敏感的机制对于肿瘤的治疗具有重大的意义。本研究重点探讨S期细胞热损伤后是否形成DSB,并结合DNA复制、复制后修复(Post Replication Repair,PRR)途径中的跨损伤合成(translesion synthesis)通路等分析热损伤后DSB形成的可能机制;旨在为热疗的临床应用提供更多的理论基础,使热疗在肿瘤临床治疗中的单独应用得到推广。2、方法(1)h1299细胞45℃孵箱加热所需时间及S期同步条件的探索本研究加热温度选择进行高热治疗的中间温度45℃,加热时间采用平板克隆形成实验确定：取对数生长期的h1299细胞重新铺板并培养24h待细胞贴壁牢固后用45℃预热的孵箱按实验分组分别热处理Oh、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h,之后恢复正常温度继续培养14天,最后染色、计数、分析实验结果。因克隆形成率太高说明热损伤可能未形成,克隆形成率太低不能保证后续实验的顺利进行,所以取克隆形成率接近50%的加热时间为本研究最终采用的热处理时间。为探讨S期细胞热损伤敏感的原因,研究采用血清饥饿法将h1299细胞同步至S期,饥饿时间参考文献报道的28h,然后采用流式细胞术确定h1299细胞无血清培养后还需继续正常培养多少时间达到S期同步效果最大化。(2)S期h1299细胞热损伤后DNA双链断裂形成及其对细胞存活能力的影响按照上述实验获得的S期同步条件及热损伤条件获得同步至S期的h1299细胞进行热处理,再根据实验分组收集细胞应用中性单细胞凝胶电泳(single cell gel el

关键词： h1299细胞热疗 DNA双链断裂

荜茇酰胺衍生物C12对人非小细胞肺癌h1299细胞的抗肿瘤作用及其机制研究

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药学学报 2024年第10期59卷 2773-2781页

作者：龙海洮雷雪陈佳宜孟娇邵利辉李洙锐陈丹萍王贞超周玥李成朋贵州大学药学院贵州贵阳550025 贵州大学贵州省合成药物工程实验室贵州贵阳550025 绿色农药国家重点实验室绿色农药与农业生物工程教育部重点实验室贵州大学精细化学品研发中心贵州贵阳550025

(E)-1-(4-(3-(5-氯-6-氧代-3,6-二氢吡啶-1(2h)-基)-3-氧代丙基-1-烯-1-基)苯基)-3-(4-氟苯基)脲(以下简称C12)是课题组前期合成的一个新型荜茇酰胺衍生物。本研究以人非小细胞肺癌h1299细胞为研究对象,探讨C12对人非小细胞肺癌的体外... 详细信息

(E)-1-(4-(3-(5-氯-6-氧代-3,6-二氢吡啶-1(2h)-基)-3-氧代丙基-1-烯-1-基)苯基)-3-(4-氟苯基)脲(以下简称C12)是课题组前期合成的一个新型荜茇酰胺衍生物。本研究以人非小细胞肺癌h1299细胞为研究对象,探讨C12对人非小细胞肺癌的体外抗肿瘤作用及其作用机制。采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium、MTT)法、划痕实验、平板克隆实验和Transwell细胞侵袭实验检测C12对h1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响;通过流式细胞术检测C12对h1299细胞周期、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和细胞凋亡的影响;通过蛋白印迹实验检测p21、Cyclin B1、CDK1、Bax、Bcl-2、JNK、p-JNK、Erk1/2、p-Erk1/2、p38和p-p38的表达,探讨C12的抗肿瘤作用机制。结果显示,C12呈时间和浓度依赖性地抑制h1299的增殖、迁移和侵袭;流式细胞结果显示,C12能阻滞h1299细胞周期于G2/M期,升高ROS水平,降低MMP并诱导细胞凋亡;蛋白印迹结果显示,C12通过下调Cyclin B1和CDK1蛋白表达将h1299细胞阻滞于G2/M期,上调Bax/Bcl-2水平诱导细胞凋亡,上调MAPK通路中p-JNK、p-Erk1/2和p-p38的表达。综上所述,C12能够显著抑制h1299的增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡,其机制可能与激活MAPK信号通路有关。

关键词：荜茇酰胺衍生物 h1299细胞增殖凋亡 MAPK信号通路

PM2.5暴露对肺组织和h1299细胞Twist1、Zeb1表达影响

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中国公共卫生 2020年第7期36卷 1010-1013页

作者：张瑜肖纯凌杨丹石威沈阳医学院辽宁省环境污染与健康重点实验室辽宁中医药大学附属第二医院省中医药研究院辽宁沈阳110034

目的探讨细颗粒物(PM2.5)暴露对大鼠肺组织及h1299细胞中Zeb1、Twist1的表达和细胞增殖影响。方法体内实验:40只大鼠分别给予PM2.5混悬液和生理盐水,于暴露后2和4周收集肺组织;体外实验:分别用0、50、100、200μg/mL PM2.5混悬液培养h1... 详细信息

目的探讨细颗粒物(PM2.5)暴露对大鼠肺组织及h1299细胞中Zeb1、Twist1的表达和细胞增殖影响。方法体内实验:40只大鼠分别给予PM2.5混悬液和生理盐水,于暴露后2和4周收集肺组织;体外实验:分别用0、50、100、200μg/mL PM2.5混悬液培养h1299细胞48 h,收集细胞;采用免疫印迹法法检测小鼠肺组织和h1299细胞中Zeb1、Twist1蛋白表达,采用噻唑蓝(MTT)法检测h1299细胞增殖率。结果体内实验:与对照组[(0.68±0.19)、(0.99±0.11)]比较,PM2.5暴露大鼠4周后肺组织中Zeb1、Twist1蛋白表达量[分别为(0.27±0.18)(0.44±0.15)]明显下调(Ph1299细胞中Zeb1、Twist1蛋白表达量[分别为(0.17±0.08)、(0.20±0.05)]明显下调(Ph1299细胞72 h,h1299细胞生存率为(25.26±1.84)%,明显低于对照组(P细胞h1299中Zeb1、Twist1表达明显降低,并且肺癌细胞(h1299)呈现增殖抑制现象。

关键词：细颗粒物(PM2.5) h1299细胞 Zeb1 Twist1

S期h1299细胞热损伤后的延迟性DNA双链断裂

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南方医科大学学报 2016年第4期36卷 472-476页

作者：孙婷丁为民李凌张彦南方医科大学珠江医院肿瘤中心广东广州510282 南方医科大学公共卫生与热带医学学院三级生物安全实验室广东广州510515

目的研究S期细胞热损伤后DNA双链断裂形成规律,以阐明S期细胞热敏感原因,并分析DNA双链断裂延迟性形成的可能机制。方法流式细胞术分析热损伤后细胞周期阻滞;Ed U掺入实验检测DNA复制能力;血清饥饿法同步h1299细胞周期;中性彗星实验动... 详细信息

目的研究S期细胞热损伤后DNA双链断裂形成规律,以阐明S期细胞热敏感原因,并分析DNA双链断裂延迟性形成的可能机制。方法流式细胞术分析热损伤后细胞周期阻滞;Ed U掺入实验检测DNA复制能力;血清饥饿法同步h1299细胞周期;中性彗星实验动态观察热损伤后DNA双链断裂形成;台盼蓝拒染实验研究热损伤后细胞存活率;蛋白免疫印记实验检测ATM磷酸化及DNA结合RAD18情况。结果流式结果显示h1299细胞经45℃热损伤1 h后S期细胞较未加热组明显增多(P细胞热损伤后需经37℃正常孵育一定时间方可观察到"彗星拖尾"现象,且随着正常孵育时间延长,反映DNA双链断裂的尾力矩值越大;台盼蓝拒染实验显示S期细胞受热后7.5 h内死亡率保持较低水平,之后细胞死亡加速;热损伤后ATM磷酸化先增多后减少,热损伤导致DNA结合RAD18明显减少。结论细胞热损伤后可发生S期阻滞,阻滞期间因复制继续、DNA损伤修复抑制而延迟形成的致死性DNA双链断裂是S期细胞热敏感的可能原因。

关键词： h1299细胞热损伤细胞周期阻滞 DNA双链断裂

EGCG抑制Nicotine诱导肺腺癌h1299细胞JAK2/STAT3 mRNA的表达研究

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茶叶科学 2015年第2期35卷 171-178页

作者：高静禹利君李晓焕高鹏周清明湖南农业大学园艺园林学院茶学系茶学教育部重点实验室湖南长沙410128 湖南农业大学农学院烟草系湖南长沙410128

为探索EGCG对Nicotine诱导肺癌细胞增殖的抑制作用,本研究通过MTT实验筛选出EGCG、Nicotine对肺腺癌细胞h1299的最佳作用浓度,利用实时荧光定量PCR技术检测EGCG、Nicotine对h1299细胞中Bax、Bcl-2、Jak2和Stat3基因mRNA相对表达量的变... 详细信息

为探索EGCG对Nicotine诱导肺癌细胞增殖的抑制作用,本研究通过MTT实验筛选出EGCG、Nicotine对肺腺癌细胞h1299的最佳作用浓度,利用实时荧光定量PCR技术检测EGCG、Nicotine对h1299细胞中Bax、Bcl-2、Jak2和Stat3基因mRNA相对表达量的变化。实验结果表明,EGCG对h1299细胞的半抑制浓度IC50值约为32μmol·L-1(24 h)、15μmol·L-1(48 h);1μmol·L-1的Nicotine对h1299细胞促增殖作用明显;以15μmol·L-1的EGCG预处理h1299细胞24 h可显著下调1μmol·L-1 Nicotine的促增殖作用(Ph1299细胞可明显降低JAK2/STAT3信号通路中Bax基因mRNA的表达,增加Bcl-2、Jak2、Stat3基因的mRNA表达;15μmol·L-1 EGCG预处理h1299细胞可反向调控Nicotine诱导所致JAK2/STAT3信号通路中Jak2、Stat3和Bax、Bcl-2基因表达量的变化,结果具有显著性差异(Ph1299细胞增殖及JAK2/STAT3信号通路中促增殖基因mRNA的表达起抑制作用。

关键词： EGCG Nicotine h1299细胞 JAK2/STAT3 mRNA表达

莲子心新碱对转化生长因子β1诱导的h1299细胞侵袭和迁移的抑制作用及其机制

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中药新药与临床药理 2021年第10期32卷 1459-1467页

作者：张婉婷王歆竹米玉辉杨光明潘扬南京中医药大学药学院江苏南京210023 江苏省中药炮制重点实验室国家中医药管理局中药炮制标准重点研究室江苏南京210023 南京中医药大学药用菌与中药生物技术研究所江苏南京210023

目的构建转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)h1299细胞上皮-间充质转化(EMT)模型,并探讨莲子心新碱(Neoliensine,NeoL)对其侵袭和迁移能力的抑制作用及潜在机制。方法用5、10、15 ng·mL^... 详细信息

目的构建转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)h1299细胞上皮-间充质转化(EMT)模型,并探讨莲子心新碱(Neoliensine,NeoL)对其侵袭和迁移能力的抑制作用及潜在机制。方法用5、10、15 ng·mL^(-1)的TGF-β1诱导h1299细胞构建EMT模型;以15 ng·mL^(-1)的TGF-β1诱导h1299细胞作为EMT模型组,以法舒地尔(Fas)为阳性药,设置1、2、3μmol·L^(-1)的莲子心新碱实验组。采用倒置荧光显微镜观察诱导后的细胞形态;用CCK-8法检测莲子心新碱对h1299细胞的抑制率;Western Blot法检测细胞黏附因子E-钙黏蛋白(E-cadherin)以及间充质标记物N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)以及ROCK 1与P-Smad 2/3蛋白的表达;Transwell法检测莲子心新碱对TGF-β1诱导的h1299细胞侵袭、迁移的抑制作用;免疫荧光法检测h1299细胞内ROCK 1蛋白的表达及分布。结果TGF-β1诱导后h1299细胞形态呈现间充质特性。与对照组比较,随着TGF-β1浓度的升高,E-cadherin表达明显降低(Pherin与Vimentin表达明显升高(Ph1299细胞的活力,IC50为5.04μmol·L^(-1);同时与模型组比较,莲子心新碱抑制了TGF-β1促进的h1299细胞EMT过程及侵袭迁移作用(Pherin蛋白的表达(Pherin和Vimentin蛋白的表达(Ph1299细胞内因TGF-β1诱导而升高的ROCK 1(Ph1299细胞胞质中ROCK 1蛋白的表达及分布。结论TGF-β1可以诱导h1299细胞发生EMT,莲子心新碱可以有效抑制这一过程,其机制可能是抑制了TGF-β1/Smad/RhoA/ROCK通路。

关键词：莲子心新碱(NeoL) h1299细胞 TGF-β1 ROCK 1 侵袭迁移

ΔNp63γ和ΔNp63a及其C端在h1299细胞凋亡中的作用

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四川大学学报（自然科学版） 2013年第3期50卷 605-610页

作者：陈静易勇贺寒冰李成华四川大学生命科学学院生长代谢与衰老研究中心成都610064

为了研究ΔNp63γ、ΔNp63a及其C端(p63aCT)在细胞凋亡中的作用,本研究扩增出人ΔNp63γ、ΔNp63a和p63aCT编码序列,并克隆至慢病毒表达载体pLVX-hA-Flag.通过将构建的pLVX-ΔNp63a、pLVX-ΔNp63γ、pLVX-p63aCT包装至慢病毒颗粒,感染... 详细信息

为了研究ΔNp63γ、ΔNp63a及其C端(p63aCT)在细胞凋亡中的作用,本研究扩增出人ΔNp63γ、ΔNp63a和p63aCT编码序列,并克隆至慢病毒表达载体pLVX-hA-Flag.通过将构建的pLVX-ΔNp63a、pLVX-ΔNp63γ、pLVX-p63aCT包装至慢病毒颗粒,感染人肺癌细胞株h1299后,用Western blot检测到ΔNp63γ、ΔNp63a及其C端能在h1299细胞中有效地过表达;通过PI染色以及流式细胞术检测发现ΔNp63a能有效挽救DNA损伤药物Cisplatin(CDDP)诱导的细胞凋亡,而ΔNp63γ和ΔNp63aCT则没有明显的挽救效果.本研究表明,在h1299细胞中,ΔNp63a具有抑制细胞凋亡的作用,其C端可能与其它功能域一起参与此过程.

关键词： ΔNp63a ΔNp63γ h1299细胞细胞凋亡

外源表达miR-34a对h1299细胞辐射敏感性的影响

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中华放射医学与防护杂志 2013年第2期33卷 128-130页

作者：陈雪高刚阮健磊刘建香中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所辐射防护与核应急中国疾病预防控制中心重点实验室北京100088

目的研究miR-34a对h1299细胞辐射敏感性的影响.方法采用pre-miR-34a瞬时转染h1299细胞,接受不同剂量（0、2、4、6和8 Gy）γ射线照射后,利用CCK-8试剂盒检测细胞活性.流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,real-time PCR检测miR-34a靶基... 详细信息

目的研究miR-34a对h1299细胞辐射敏感性的影响.方法采用pre-miR-34a瞬时转染h1299细胞,接受不同剂量（0、2、4、6和8 Gy）γ射线照射后,利用CCK-8试剂盒检测细胞活性.流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,real-time PCR检测miR-34a靶基因bcl-2、bax、CDK4、CDK6及cyclinD1的表达水平.结果不同剂量（0、2、4、6和8 Gy）γ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组各剂量点细胞活力明显降低（t=-2.39、-3.12、-4.98、-4.03、-3.06,P＜0.05）,并与阴性对照转染组的差值呈剂量依赖性的增加.6 Gyγ射线照射后,与阴性对照转染组相比,pre-miR-34a转染组细胞凋亡率明显增加（t=7.06,P＜0.05）,细胞G0/G1期阻滞（t =3.94,P＜0.05）,S期细胞减少（t=6.23,P＜0.05）,bcl-2、CDK4及CDK6明显下调（t=3.39、12.88、6.21,P＜0.05）,cyclinD1有下降趋势,但差异无统计学意义,而bax明显上调（t=-4.35,P＜0.05）,是阴性对照转染组的1.94倍,bcl-2/bax比值下降.结论 miR-34促进h1299细胞凋亡,诱导细胞G0/G1期阻滞,抑制细胞活性,进而提高h1299细胞的辐射敏感性.

关键词： miR-34a h1299细胞辐射敏感性细胞凋亡细胞周期