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猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1和TNF-α SYBR greenⅰ real-time PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2009年第10期39卷 910-916页

作者：施开创莫胜兰许瑞胜陆文俊刘棋广西动物疫病预防控制中心广西南宁530001 广西大学动物科学技术学院广西南宁530005

分别针对猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1、TNF-α基因以及看家基因β-actin的序列设计了1对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测Fas、FasL、TNFR1、TNF-α及β-actin的SYBR greenⅰreal-ti me PC... 详细信息

分别针对猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1、TNF-α基因以及看家基因β-actin的序列设计了1对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测Fas、FasL、TNFR1、TNF-α及β-actin的SYBR greenⅰreal-ti me PCR方法。该方法线性关系好(r2≥0.995),敏感性高,初始模板的检出下限除TNFR1为1×102copies/μL外,其他均为1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对猪生殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中Fas、FasL、TNFR1和TNF-αmRNA的表达水平进行了检测。结果表明,建立的real-ti me PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好。

关键词：猪凋亡细胞因子荧光定量PCR SYBR greenⅰ

禽白念珠菌基于SYBR green Ⅰ染色的LC-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2016年第6期46卷 799-804页

作者：刘建钗马邯生柳焕章刘娜闫金坤刘彦威刘月贾苗苗赵成睿中国农业大学动物医学院北京100094 河北工程大学农学院河北邯郸056021 河北省禽病工程技术研究中心河北邯郸056021

为建立禽白念珠菌便捷、特异和灵敏的检测方法,根据Gen Bank已发表的白念珠菌r DNA间转录间隔区核苷酸序列设计一对目的扩增子长度为273 bp的特异引物,采用Light Cycler实时PCR(LC-PCR)检测方法,以SYBR greenⅰ为扩增产物荧光染色剂,对... 详细信息

为建立禽白念珠菌便捷、特异和灵敏的检测方法,根据Gen Bank已发表的白念珠菌r DNA间转录间隔区核苷酸序列设计一对目的扩增子长度为273 bp的特异引物,采用Light Cycler实时PCR(LC-PCR)检测方法,以SYBR greenⅰ为扩增产物荧光染色剂,对禽白念珠菌疑似病例血液样本进行检测,并用临床常见的5种病原真菌对该方法的特异性进行检验。结果显示,该方法灵敏度高,白念珠菌最低检出浓度为1×101CFU/m L;特异性强,与光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、烟曲霉等病原真菌无交叉反应;耗时短,只需2 h即可完成整个试验过程。总之,该方法可应用于禽白念珠菌早期侵染的方便、准确检测,为禽白念珠菌病的及时正确防治提供可靠的依据。

关键词：禽白念珠菌 LC-PCR SYBR greenⅰ

鸭坦布苏病毒SYBR greenⅰ实时荧光定量检测方法的建立

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中国兽医学报 2013年第7期33卷 973-978页

作者：万春和朱海侠施少华黄瑜程龙飞傅光华陈红梅福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DFV)NS5基因序列特征设计引物,建立基于SYBR greenⅰ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR,RRT-PCR),该方法检测DFV NS5基因2.74×103～2.74×107拷贝/μL反应范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(86.23±0.18)℃,对禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽1型副黏病毒、鸭减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.52%～1.48%,组间变异系数0.71%～2.21%。检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4h。

关键词：鸭坦布苏病毒 SYBR greenⅰ 实时荧光定量RT-PCR

牛IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA实时SYBR greenⅰ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2010年第10期32卷 762-767页

作者：韩猛立杨井泉姚守秀黄新薄新文钟发刚新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室新疆石河子832000 石河子大学动物科技学院新疆石河子832003

为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3... 详细信息

为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR greenⅰ实时荧光定量PCR检测方法。将BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γcDNA分别克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α内,经PCR及测序鉴定,将得到的阳性重组质粒制备成标准品,建立SYBR green荧光定量PCR标准曲线并分析溶解曲线,进行灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明:BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL～1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。本研究建立的检测牛IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA的实时荧光定量PCR方法,为牛IFN mRNA水平上的定量分析奠定了基础。

关键词： SYBR greenⅰ 实时荧光定量PCR 牛 α-干扰素 β-干扰素 γ-干扰素

利用无标记的分子信标及核酸染料SYBR green Ⅰ检测乙肝病毒

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中国科学：化学 2014年第12期44卷 1996-2003页

作者：向东山史伯安翟琨王联芝生物资源保护与利用湖北省重点实验室湖北民族学院化学与环境工程学院恩施445000

本文以野生型的乙型肝炎病毒（HBV）核酸片段为研究对象,利用无标记的分子信标及核酸染料SYBR green I,建立了一种高灵敏、高选择性的特定序列核酸检测方法.在优化条件下,目标DNA浓度为4×10^-11-400×10^-11 mol/L之间时,SYBR green I... 详细信息

本文以野生型的乙型肝炎病毒（HBV）核酸片段为研究对象,利用无标记的分子信标及核酸染料SYBR green I,建立了一种高灵敏、高选择性的特定序列核酸检测方法.在优化条件下,目标DNA浓度为4×10^-11-400×10^-11 mol/L之间时,SYBR green I的荧光强度（ΔI）与目标DNA的浓度（C）具有良好的线性关系,其拟合的回归方程为ΔI=1.9556 C＋31.4659（R^2=0.9956）,方法检测限（3ζ）为2×10^-11 mol/L.该方法操作简单、检测速度快、灵敏度高、重现性好、检出限低.利用该方法,结合不对称PCR技术,实现了对HBV的定量检测.

关键词：无标记分子信标 SYBR greenⅰ 乙肝病毒荧光

猪轮状病毒SYBR greenⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2010年第2期40卷 174-179页

作者：陈小金陈建飞时洪艳张志榜冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)代表株OSU毒株序列,针对VP7基因设计了1对特异性引物,将150bp目的片段与pMD18-T载体连接构建标准品,建立了检测A群PoRV的SYBR greenⅰreal-timePCR方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行... 详细信息

根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)代表株OSU毒株序列,针对VP7基因设计了1对特异性引物,将150bp目的片段与pMD18-T载体连接构建标准品,建立了检测A群PoRV的SYBR greenⅰreal-timePCR方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评价。结果显示,该方法在1.3×108copies/μL～1.3×102copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限为1.3×101copies/μL;用该方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪病毒性腹泻病毒均为阴性;批内及批间变异系数均低于2%。表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。用该方法抽检58份疑似病例的腹泻病料,结果检出53份阳性,同时用普通RT-PCR和快速检测试剂盒对这些病料进行检测,结果分别检出42份和32份阳性。用这3种方法对11例已知阳性的临床粪便样品进行检测,结果建立的检测方法与其他两种方法的符合率为100%。用该方法检测PoRV细胞培养物中的病毒载量为1.0×105copies/μL。结果表明,建立的检测方法为PoRV的早期诊断、分子流行病学调查以及疫苗质量的监测等提供了新的快速检测技术。

关键词：猪轮状病毒 SYBR greenⅰ 实时荧光定量PCR

猪博卡病毒5型SYBR greenⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2015年第2期45卷 150-155页

作者：陈鹏强胡崇伟陈秋勇林群群修金生福建农林大学动物科学学院福建福州350002

根据猪博卡病毒5型NS1基因序列设计引物,建立了基于SYBR greenⅰ的用以检测猪博卡病毒5型的实时荧光定量PCR。用该方法检测猪博卡病毒5型NS1基因,在3.64×102~3.64×107 copies/μL范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线仅出现单... 详细信息

根据猪博卡病毒5型NS1基因序列设计引物,建立了基于SYBR greenⅰ的用以检测猪博卡病毒5型的实时荧光定量PCR。用该方法检测猪博卡病毒5型NS1基因,在3.64×102~3.64×107 copies/μL范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为(83.12±0.12)℃,对猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪输血传播病毒(TTV1和TTV2)的核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.35%~1.24%,组间变异系数为0.43%~1.46%。此方法的建立为定量分析猪博卡病毒5型感染猪的感染程度和靶器官提供了精确检测手段。

关键词：猪博卡病毒5型 NS1基因 SYBR greenⅰ 实时荧光定量PCR

新型鸭呼肠孤病毒SYBR green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2013年第9期35卷 738-741页

作者：袁远华吴志新王俊峰黄兴国贺东生黄淑坚华南农业大学兽医学院广东广州510642 佛山科学技术学院生命科学学院广东佛山528231 三水区乐平镇动物防疫检疫站广东佛山528137 韶关市动物卫生监督所广东韶关512026

为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR greenⅰ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较。结... 详细信息

为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR greenⅰ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.9996,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。对番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒均未检测到荧光信号。对NDRV的最小检出量为29拷贝/μL,比普通PCR敏感性高100倍。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。

关键词：新型鸭呼肠孤病毒 SYBR greenⅰ 实时荧光定量RT-PCR

猪细小病毒与猪伪狂犬病毒二重SYBR greenⅰ实时荧光PCR方法的建立与检测

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中国兽医学报 2014年第5期34卷 690-694页

作者：郑兰兰金钺李明凤郭显坡陈红英崔保安魏战勇河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 河南省动物性食品安全重点实验室河南郑州450002

本研究旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的基于SYBR greenⅰ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增PRV gH基因与PPV NS1基因的部分片段。将测序正确的PRV gH... 详细信息

本研究旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的基于SYBR greenⅰ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增PRV gH基因与PPV NS1基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PPV NS1基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR greenⅰ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.9℃和86.5℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达248拷贝/μL和160拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本次建立的猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PPV混合感染的临床病料进行快速诊断。

关键词：猪细小病毒猪伪狂犬病毒 SYBR greenⅰ