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刚地弓形虫gra17、gra23核酸疫苗及gra17缺失株弱毒活疫苗的免疫保护性研究

刚地弓形虫GRA17、GRA23核酸疫苗及GRA17缺失株弱毒活疫苗的免疫...

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作者：朱伟宁山东农业大学

学位级别：硕士

弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种由弓形虫感染引起的重要的人兽共患的寄生虫病。弓形虫可以感染几乎所有的温血动物(包括人),人类弓形虫的感染率达到了三分之一左右,弓形虫病传染性很强,并且流行也非常广泛。目前尚无稳定、安全、有效的... 详细信息

弓形虫病(Toxoplasmosis)是一种由弓形虫感染引起的重要的人兽共患的寄生虫病。弓形虫可以感染几乎所有的温血动物(包括人),人类弓形虫的感染率达到了三分之一左右,弓形虫病传染性很强,并且流行也非常广泛。目前尚无稳定、安全、有效的弓形虫疫苗可用,因而研发高效的新型疫苗成为防控弓形虫病的首要任务。随着现代生物技术不断的创新和提高,弓形虫的基因疫苗作为可能用于预防弓形虫病的重要方式之一,其相关研究也越来越引起人们的重视。基因疫苗具有免疫保护力强、免疫持久、稳定性好、制备简单、生产成本低等诸多优点。弓形虫的致密颗粒蛋白是由颗粒细胞器分泌的一类免疫活性蛋白,它们在弓形虫的细胞内生长发育过程中起着至关重要的作用,是重要的疫苗候选分子。有关研究表明,弓形虫gra17基因的缺失能够使虫体丧失毒力,这为我们对gra17和gra23基因的核酸疫苗及gra17基因缺失株弱毒苗的研究奠定了基础。本研究旨在构建弓形虫gra17基因的DNA疫苗及gra17基因缺失株弱毒苗,评价其抗弓形虫的免疫保护力。利用RT-PCR技术从RH株弓形虫速殖子总RNA中扩增得到弓形虫Tggra17和Tggra23基因,构建了真核表达质粒pVAX-gra17和pVAX-gra23;然后将质粒瞬时转染到HEK 293-T细胞中,并对基因在细胞中的表达情况进行鉴定分析。利用重组质粒pVAX-gra17、pVAX-gra23及pVAX-gra17+pVAX-gra23的混合疫苗组对BABL/c小鼠先后进行三次免疫,以空质粒pVAX1作为对照;在第3次免疫之后2w和每次免疫之前收集小鼠血清,利用ELISA方法对小鼠血清中的Ig G抗体水平进行检测。在第三次免疫2 w后,每组取3只小鼠,将小鼠安乐死之后取脾脏,制备脾淋巴细胞悬液;利用CCK-8法对脾淋巴细胞增殖能力进行检测,用流式细胞术检测CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞百分比。利用弓形虫速殖子抗原(STAg)刺激小鼠脾细胞,通过ELISA检测试剂盒对脾细胞因子进行检测。三次免疫之后,对小鼠进行攻虫实验,评价基因疫苗对小鼠的免疫保护力。利用CRISPR/Cas9技术在Ⅰ型RH虫株中敲除了gra17基因,成功构建RHΔgra17虫株,并利用RHΔgra17虫株感染昆明小鼠,分别在免疫28 d和70 d之后收集小鼠血清,利用ELISA方法对小鼠血清中的Ig G抗体水平进行检测。并在免疫70 d之后每组取三只小鼠安乐死之后取脾脏,制备脾淋巴细胞悬液,利用弓形虫速殖子抗原刺激小鼠脾细胞,通过ELISA检测试剂盒对脾细胞因子进行检测。在免疫70 d后对小鼠进行攻虫实验,评价RHΔgra17虫株对小鼠的免疫保护力。gra17和gra23基因疫苗实验结果显示,疫苗免疫组IgG抗体水平随着时间延长而逐渐升高,且混合基因疫苗组的抗体水平高于单基因疫苗组。脾淋巴细胞增殖实验与流式细胞术检测结果显示,pVAX-gra17、pVAX-gra23和pVAX-gra17+pVAX-gra23混合疫苗免疫组的SI值分别为1.24±0.13,1.54±0.11,1.57±0.085;CD4+T细胞百分比分别为21.49±1.68,21.23±3.89,20.34±1.88;CD8+T细胞百分比分别为6.66±1.02,7.63±1.24,8.20±0.97。与对照组相比以上数据都有一定程度的升高。经致死性RH株弓形虫感染后,pVAX-gra17、pVAX-gra23及pVAX-gra17+pVAX-gra23的混合疫苗组小鼠存活时间分为9.1±0.32 d、10.8±0.79 d和12.6±2.55 d,与对照组相比均有明显增长。说明pVAX-gra17、pVAX-gra23和pVAX-gra17+pVAX-gra23能够诱导小鼠产生一定水平的体液免疫和细胞免疫反应,并对弓形虫感染产生了一定程度的免疫保护力,且混合疫苗与单基因疫苗相比具有更好的免疫保护效果。RHΔgra17虫株弱毒苗研究结果显示,RHΔgra17弱毒虫株能够诱导机体产生相应的细胞免疫应答和体液免疫应答。弓形虫急性感染试验中,空白对照组小鼠感染弓形虫RH、PYS和TgC7虫株后,小鼠再感染10 d之内全部死亡;而经RHΔgra17虫株免疫的小鼠能感染弓形虫RH、PYS和TgC7株速殖子后,35 d之内均无死亡现象。弓形虫慢性感染试验中,空白对照组感染弓形虫PRU株包囊后,小鼠在感染35 d后仅有40%的小鼠存活,且存活小鼠的脑包囊鼠为4296±687个/只;而经RHΔgra17弱毒苗免疫的小鼠分别感染弓形虫PRU株包囊后,小鼠在感染35 d之内均无死亡现象,且存活小鼠的脑包囊鼠为53±15个/只。以上结果表明,RHΔgra17虫株具有良好的免疫原性,并且能够诱导小鼠在对抗弓形虫对小鼠的急

关键词：弓形虫 gra17 gra23 基因疫苗基因缺失株免疫保护力

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gra17和gra23基因缺失对Ⅱ型弓形虫生长、毒力和免疫原性的影响

Gra17和Gra23基因缺失对Ⅱ型弓形虫生长、毒力和免疫原性的影响

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第九届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：李婷婷王金磊梁勤立孙黎秀张海生张芝玮朱兴全 Hany M.Elsheikha

引言/目的刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种非常成功的专性细胞内寄生的机会性致病原虫。弓形虫从致密的颗粒细胞器中分泌出许多致密的颗粒蛋白(gras)来操纵宿主细胞。这些效应蛋白中的两个蛋白(gra17和gra23)参与了在弓形虫液泡和... 详细信息

引言/目的刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种非常成功的专性细胞内寄生的机会性致病原虫。弓形虫从致密的颗粒细胞器中分泌出许多致密的颗粒蛋白(gras)来操纵宿主细胞。这些效应蛋白中的两个蛋白(gra17和gra23)参与了在弓形虫液泡和宿主细胞质之间的分子运输。然而,它们在建立慢性感染中的作用仍然还不清晰。在这项研究中,使用CRISPR-Cas9敲除弓形虫Pru株(Ⅱ型)中的gra17和gra23基因,并在昆明小鼠中探究其突变株的生长,毒力,建立慢性感染的能力以及免疫原性。

关键词：弓形虫 gra17 gra23 基因缺失免疫原性

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弓形虫RHΔgra17Δnpt1缺失株对小鼠急性、慢性和先天性弓形虫病的免疫保护性

弓形虫RHΔgra17Δnpt1缺失株对小鼠急性、慢性和先天性弓形虫病...

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第九届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：梁勤立孙黎秀 Hany M.Elsheikha 曹雪珍聂兰碧李婷婷李涛善朱兴全王金磊

引言/目的弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种寄生性细胞内原虫,可感染包括人类在内的所有温血动物,世界上约有三分之一的人感染,通常在免疫能力正常的个体中感染是无症状的。疫苗是预防疾病的最有效手段,可以最大程度地减少对化学疗法的... 详细信息

引言/目的弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种寄生性细胞内原虫,可感染包括人类在内的所有温血动物,世界上约有三分之一的人感染,通常在免疫能力正常的个体中感染是无症状的。疫苗是预防疾病的最有效手段,可以最大程度地减少对化学疗法的依赖和副作用。目前,只有一种弓形虫商品化疫苗,且只可以用于绵羊中并存在许多缺陷。据报道,致密颗粒蛋白17 (gra17)和新型转运蛋白(NPT1)都是弓形虫中重要的毒力因子。鉴于gra17和NPT1在弓形虫的毒力和生长中的重要作用,本研究旨在通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建gra17和NPT1基因的双缺失株,弓形虫的遗传减毒可能会产生更安全和免疫原性的弱毒候选疫苗。

关键词：弓形虫保护力缺失株 gra17 免疫保护性先天性弓形虫病

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