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利用外源DGAT基因和编辑gopgf基因创造棉花高油低酚种质

利用外源DGAT基因和编辑GoPGF基因创造棉花高油低酚种质

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作者：张军华中农业大学

学位级别：硕士

棉花是主要的纤维作物,也是重要的油料作物。在不占据额外的耕地面积和不降低纤维品质的前提下,通过基因工程技术提高种子含油量、降低棉酚含量,从而改善棉籽油品质增加我国植物油的供应。二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油合成最后... 详细信息

棉花是主要的纤维作物,也是重要的油料作物。在不占据额外的耕地面积和不降低纤维品质的前提下,通过基因工程技术提高种子含油量、降低棉酚含量,从而改善棉籽油品质增加我国植物油的供应。二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油合成最后一步反应酶,它的表达水平与油脂含量密切相关,前人的多项研究证明异源表达DGAT能显著的提高植物种子的含油量。本研究克隆了芝麻、蓖麻、油葵和花生4种油料作物的DGAT1基因,利用酿酒酵母表达体系验证功能后,转化至棉花以创造高油种质。另外,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除棉花色素腺体形成基因gopgf,创造无腺体的新种质,为解析腺体形成调控机理以及腺体与棉酚的关系提供了重要的研究材料。主要结果如下:(1)生物信息学分析表明克隆4种油料作物SiDGAT1、RcDGAT1、HaDGAT1、AhDGAT1基因均具有DGAT1特征,且酵母表达体系表明四种作物来源的DGAT1均有DGAT酶活性;(2)在棉花中过表达SiDGAT1、RcDGAT1、HaDGAT1、AhDGAT1,根据Southern杂交结果,分别筛选到4、8、11、10个单拷贝转化事件,并且在棉花中均可正常表达;(3)SiDGAT1转基因棉花T2代Si-94、Si-99两个转化株系与对照相比含油量分别提高6.37%、7.41%,百粒重提高11.16%、4.94%;(4)对SiDGAT1转基因棉花进行脂质组分析,共鉴定到8大类型、26个亚类、902种脂质分子,筛选到25个差异脂质分子,其中包括14种TAG,碳原子数在56个以上、分子质量900以上的甘油三酯呈增长趋势(R=0.6771、R=0.6987);(5)利用CRISPR/Cas9敲除棉花色素腺体形成基因GhPGF12、GhPGF12,阳性植株无腺体表型率100%,叶片棉酚含量下降98.8%,并且无腺体表型可遗传。

关键词：棉花二酰甘油酰基转移酶 DGAT 含油量 gopgf 腺体棉酚

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棉花腺体形成基因gopgf的分子作用机理初探

棉花腺体形成基因GoPGF的分子作用机理初探

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作者：王洪南京农业大学

学位级别：硕士

棉花是我国乃至世界范围内的一种重要经济作物,它主要的产品包括纤维、油脂以及蛋白。色素腺体和棉酚是棉花的重要性状,棉酚的存在是棉花抵抗病虫害的重要天然防御机制,但是由于其毒性导致棉籽中高含量的油脂及蛋白不能直接食用。棉花... 详细信息

棉花是我国乃至世界范围内的一种重要经济作物,它主要的产品包括纤维、油脂以及蛋白。色素腺体和棉酚是棉花的重要性状,棉酚的存在是棉花抵抗病虫害的重要天然防御机制,但是由于其毒性导致棉籽中高含量的油脂及蛋白不能直接食用。棉花腺体形成基因(Gossypium pigment gland formation,gopgf)基因位于棉花的第12号染色体上,是一个控制棉花种子和植株腺体有无的关键基因。病毒诱导的基因沉默实验证明抑制gopgf基因的表达导致腺体不能正常形成。但是该基因在腺体形成中的分子作用机制并不清楚。为了深入研究gopgf基因在腺体形成中的分子机制、揭示腺体形成与棉酚生物合成的内在分子联系,从而构建腺体形成与棉酚生物合成的调控网络,本研究中我们通过不同腺体性状材料中gopgf基因的序列分析、酵母双杂交以及CoIP鉴定互作蛋白、以及转基因等,以期探索该基因在控制棉花腺体形成及棉酚合成上的一些分子作用机理以及代谢途径所涉及到的生理生化反应过程等,为棉花低酚棉育种工作提供一些参考。通过本研究取得以下成果:1、通过对不同染色体组棉种的gopgf氨基酸序列对比以及亲缘关系对比分析发现:有色素腺体的四倍体棉种(AADD)在gopgf的第282氨基酸位点上A亚组多编码一个丝氨酸(S);种子有色素腺体但其棉酚含量很低的E染色体组棉种在gopgf的第380个氨基酸位点变为苏氨酸(T);种子无腺体但植株有腺体且子叶腺体延缓形成的G、C染色体组棉种在gopgf第376个氨基酸位点变为丝氨酸(S),这种从“种子无腺体无棉酚”到“种子有腺体无棉酚”再到“种子有腺体有棉酚”的过程我们认为是一个棉花腺体棉酚不断进化的进程,而这种差异,我们初步推断是由于gopgf基因编码序列中的某个氨基酸位点的差异所导致的。2、通过酵母双杂交和CoIP筛选到了 gopgf可能的互作蛋白,这些互作蛋白涵盖了光合作用、糖代谢及ATP合成、代谢及信号转导、催化及胁迫以及激素合成五个类别。3、通过将gopgf转入拟南芥突变体SALK40500和SALK83483(拟南芥的MYC2基因T-DNA插入突变体,其萜类合成的生物过程受阻,因此其萜类化合物含量比野生型明显下降),发现本实验所使用的两个材料,在转基因拟南芥中表现上调的基因有:光反应、光系统相关;细胞壁、细胞壁蛋白合成;次生代谢相关;激素代谢;转录调控相关等。我们着重分析其中光信号调节、以及乙烯、赤霉素、茉莉酸的响应和合成代谢,并推断gopgf的转入在转录水平上对于倍半萜合成缺陷拟南芥带来的影响,我们通过初步的分析后得知,gopgf的转入使得赤霉素、茉莉酸刺激响应及其生物合成相关的基因表现上调表达,一方面茉莉酸的生物合成能直接导致茉莉酸-乙烯信号途径所响应的防御基因的表达,另一方面,赤霉素和茉莉酸刺激响基因可能在相应的内源性激素的刺激下表达从而调控某些植物次生代谢物的合成等进程,这或许与倍半萜合成基因功能缺失的互补有关。

关键词： gopgf 互作蛋白 MYC2 转录组分析恢复验证

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