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丹波黑大豆gm4cl2基因的克隆及功能鉴定

丹波黑大豆Gm4CL2基因的克隆及功能鉴定

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作者：张立娇西南大学

学位级别：硕士

目前,全球可耕地土壤面积约50%为酸性土壤,在酸性土壤中,铝(Aluminum,Al)主要以土壤中游离出来的有毒Al的形式毒害土壤中植物的根。Al主要损害根尖,可通过破坏细胞壁和细胞骨架结构来诱导根细胞死亡,抑制植物细胞吸收养分,从而引起作物... 详细信息

目前,全球可耕地土壤面积约50%为酸性土壤,在酸性土壤中,铝(Aluminum,Al)主要以土壤中游离出来的有毒Al的形式毒害土壤中植物的根。Al主要损害根尖,可通过破坏细胞壁和细胞骨架结构来诱导根细胞死亡,抑制植物细胞吸收养分,从而引起作物产量下降。在铝胁迫下,植物将激活抗氧化防御系统以减轻铝中毒引起的氧化损伤,抗氧化防御系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等。植物可以利用这个复杂的酶系统去除铝胁迫产生的活性氧,而提高植物的抗氧化能力可以提高植物对铝毒的抗性。香豆酸辅酶A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase,4cl)属于植物苯基丙烷衍生物生物合成所需要的的酶,其在抵御非生物胁迫(如耐盐、耐干旱等)中起着重要的作用。因此,研究4cl基因的耐铝性对培育耐铝作物具有重要参考意义。4cl基因与黄酮类化合物和木质素的合成有关,是生物合成途径中的关键酶。目前为止,4cl基因在植物耐盐、耐旱等抗逆境方面的作用已经得到大量研究证实,但在耐铝方面的研究还很少。本研究以耐铝植物丹波黑大豆(Glycine max ***)为材料,前期研究发现丹波黑大豆响应铝胁迫,通过反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)克隆了铝胁迫下上调表达的gm4cl2基因并对该基因进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR技术研究其在不同胁迫和不同时间下的表达量,确定最佳处理浓度和时间;随后通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥并筛选阳性植株;然后测定转基因拟南芥在铝胁迫下的根系生长,SOD、POD、MDA、木质素等的变化,确定其耐铝机制。主要结果如下:(1)本研究以耐铝植物丹波黑大豆转录组数据为基础,克隆得到了一个丹波黑大豆4cl2基因,经过比对后命名为gm4cl2。生物信息学分析表明:该基因的CDS长度为1668 bp,编码555个氨基酸,等电点为5.63。(2)在铝胁迫(pH 4.5,0.5 mmol/L Cacl,50μmol/L Al cl)下,gm4cl2表达量显著高于其他金属离子胁迫(p2 cm处显著高于其他区段(p21-gm4cl2-e GFP,用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的浸花法转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,选取3个株系gm4cl2-3、gm4cl2-5、gm4cl2-11进行耐铝分析。结果表明,50μmol/L Al cl(pH 4.5,0.5 mmol/L Cacl)处理条件下,gm4cl2显著提高了拟南芥根系伸长率;转gm4cl2基因的拟南芥中SOD、POD活性显著上调(pgm4cl2基因是耐铝基因。

关键词：耐铝性 gm4cl2 功能鉴定转基因拟南芥

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