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6种牛羊病毒性病原gexp多重pcr检测方法的建立

6种牛羊病毒性病原GeXP多重PCR检测方法的建立

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作者：叶自霞西南大学

学位级别：硕士

山羊痘病毒（Goat pox virus, GTPV）、绵羊痘病毒（Sheep pox virus, SPPV）、牛疙瘩皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus, LSDV）、传染性脓疱病毒（Contagious ecthyma virus, CPDV）、蓝舌病病毒（bluetongue virus, BTV）、小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus, PPRV）能引起反刍动物急性、热性传染病,发病率高,危害严重。6种病毒中除传染性脓疱病毒外,其余五种病毒均为OIE通报疫病病毒;我国农业部将山羊痘、绵羊痘、牛疙瘩皮肤病、蓝舌病、小反刍兽疫列为一类疫病,羊传染性脓疱为三类疫病。此外,山羊痘、绵羊痘、传染性脓疱亦是人畜共患传染病,在危害畜牧养殖业造成严重经济损失的同时,对人类健康也构成严重危害。目前,国内未见牛疙瘩皮肤病流行的报道。由于这6种疫病均以皮肤、黏膜产生疱疹、溃疡为相似临床症状,常呈混合感染,仅从临床症状上难以诊断与区分。传统的诊断方法如病毒分离鉴定、血清学方法有操作繁琐、耗时费力、灵敏度低、假阳性率高等不足,难以同时对多种病原进行检测。因此,应临床和口岸快速通关检测需要,急需建立一种快速、准确、灵敏、稳定性好,且能同时鉴别诊断上述6种疫病病原的检测方法。gexp-pcr （Gene eXpress Profiler-polymerase chain reaction）是将通用引物与特异性嵌合引物按比例混合进行pcr扩增,由gexp系统对经染色标记处理的扩增产物进行片段长度的测定的一种新技术,具有特异性强、灵敏度高、高通量等优点。近年来gexp系统常用于基因表达分析、病毒检测等领域的研究与运用。本研究以山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛疙瘩皮肤病毒、传染性脓疱病毒、蓝舌病病毒、小反刍兽疫病毒为对象,优化建立gexp多重pcr检测方法。该方法能同时对上述6种牛羊病毒性病原进行鉴别检测,为山羊痘等6种疫病的鉴别诊断、疫情监控、流行病学调查、出入境动物检疫等提供技术保障,对保障我国的畜牧业生产安全、人类健康具有十分重要的意义。主要研究内容与结果如下：（1）根据山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛疙瘩皮肤病毒、传染性脓疱病毒、蓝舌病病毒和小反刍兽疫病毒的保守序列设计了6对特异性引物,经pcr扩增、目的片段的克隆及测序,结果发现扩增产物与GenBank中各毒株的同源性都在97%以上,表明设计的6对特异性引物均能扩增出目标序列。（2）通过对特异性嵌合引物的引物浓度及退火温度进行优化,分别建立6种牛羊病毒性病原的gexp单重pcr体系,进行单重gexp-pcr的灵敏度试验,并与OIE推荐方法进行比较。结果表明,牛疙瘩皮肤病病毒、传染性脓疱病毒的灵敏度为103copies/μL;山羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒和蓝舌病病毒的灵敏度可达到102 copies/μL。可见,gexp单重pcr检测方法具有较高的灵敏度,比OIE推荐方法的灵敏度（106～107copies/μL）高10000～100000倍。（3）建立并优化6种牛羊病毒性病原gexp多重pcr检测体系,并进行特异性、灵敏度试验。特异性试验结果显示,牛疙瘩皮肤病病毒、传染性脓疱病毒、山羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒和蓝舌病病毒均产生了清晰且与预期目标片段大小相符的特异性扩增峰,呈阳性;其余的毒株均无非特异性扩增,呈阴性,说明本研究所建立的方法特异性良好。灵敏度检测结果显示,发现6种病原单管扩增均能同时检测到的灵敏度达104copies/μL。（4）用本研究建立的gexp多重pcr检测方法和OIE推荐的方法对模拟临床样本进行检测。在制备的54份模拟样品中,gexp多重pcr检测方法的阳性率为94.87%,假阳性率为6.67%,假阴性率为5.13%。在35份单独感染的模拟样本（除CPDV）及阴性样本中,gexp多重pcr检测方法的阳性率为95%,假阳性率为6.67%%,假阴性率为5%;OIE推荐方法检测的阳性率为70%,假阳性率为O%,假阴性为30%。结果表明,gexp多重pcr检测方法较大程度地提高了阳性率并减小了假阴性率,可采用本研究建立的方法对临床样本进行检测。总之,本研究建立的gexp多重pcr,能同时检测牛疙瘩皮肤病病毒、传染性脓疱病毒、山羊痘病毒、小反刍兽疫病毒、绵羊痘病毒和蓝舌病病毒,且特异性好、灵敏度高,为预防和监控上述6种牛羊病毒性病原提供了一种快速、准确、灵敏的诊断方法。

关键词： gexp多重pcr 山羊痘病毒属传染性脓疱病毒小反刍兽疫病毒蓝舌病病毒

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gexp-pcr技术多重检测食品转基因成分和HPV分型感染

GeXP-PCR技术多重检测食品转基因成分和HPV分型感染

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作者：杨梦婕暨南大学

学位级别：硕士

目的：建立基于gexp多重基因表达遗传分析系统的多重pcr方法,并评价其在食品转基因成分的检测和人乳头瘤病毒HPV分型检测中的初步应用。方法：以转基因大豆和转基因菜籽中的转基因成分为研究对象,利用gexp系统建立多重pcr方法,同时检测... 详细信息

目的：建立基于gexp多重基因表达遗传分析系统的多重pcr方法,并评价其在食品转基因成分的检测和人乳头瘤病毒HPV分型检测中的初步应用。方法：以转基因大豆和转基因菜籽中的转基因成分为研究对象,利用gexp系统建立多重pcr方法,同时检测六种外源转基因成分(PAT,NOS, CaMV35S, FMV35S,Bar,EPSPS),并与中华人民共和国出入境检验检疫行业标准《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光pcr定性检验方法》进行结果比较。以中国人常见的五种人乳头瘤病毒(HPV6,11,31,33和52)亚型为研究对象,建立基于gexp系统的五重pcr方法,并对其进行方法学评价(包括灵敏度、特异性等),并与商业化试剂盒检测结果进行比较。结果：在大豆和菜籽的转基因成分检测中,我们成功建立了可同时检测六种外源基因(PAT,NOS, CaMV35S, FMV35S,Bar,EPSPS)的多重pcr体系。在该体系中,我们采用100ng模板量(该量为行标中建议的模板最低量),检测结果与行标建议的荧光pcr检测结果完全一致。在人乳头瘤病毒HPV的分型研究中,我们成功建立了可同时检测中国人常见的五种HPV亚型(包括两种低危型HPV6,HPV11和三种高危型HPV31,HPV33,HPV52)的五重pcr体系。该方法特异性好,检测灵敏度可达103拷贝/μL。通过对30份临床标本验证,结果与商业化试剂盒检测结果完全一致。结论：成功建立了一种新的基于gexp的多重pcr技术平台,并用于食品中转基因成分检测和HPV分型检测,这为实现高通量、多靶基因的检测提供了新的思路和方法。

关键词： gexp多重pcr 转基因大豆转基因菜籽检测人乳头瘤病毒HPV 分型

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CSFV、HP-PRRSV、PEDV和ASFV等病原gexp多重检测方法的建立和试剂盒的初步组装

CSFV、HP-PRRSV、PEDV和ASFV等病原GeXP多重检测方法的建立和试剂...

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作者：罗忠永四川农业大学

学位级别：硕士

研究目的:建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原gexp多重检测方法,组装gexp多重检测试剂盒并通过与单病原检疫标准方法对比初步探究该试剂盒的应用价值;综合本研究成果及本实验室... 详细信息

研究目的:建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原gexp多重检测方法,组装gexp多重检测试剂盒并通过与单病原检疫标准方法对比初步探究该试剂盒的应用价值;综合本研究成果及本实验室其他类似课题研究成果,最终建立基于gexp技术的猪体重要疫病的高通量诊断技术。研究方法:1、选定核酸作为病原诊断的指示物,参考病原全基因组序列比对分析研究成果,遵循特异保守的原则,选定CSFV5UTR序列、HP-PRRSVNSP2基因、ASFV B646L基因、PEDV M基因作为核酸检测区段;从NCBI数据库下载各病原相应核酸序列,使用生物学软件比对分析根据毒株间保守区域设计引物;特别地,设计的HP-PRRSV诊断引物要能区分PRRSV毒株和HP-PRRSV毒株。2、根据实验设计的引物建立单病原pcr诊断方法,通过疫苗参考毒株及实验室分离鉴定毒株分析单病原单重pcr的特异性;利用体外转录合成的CSFV、HP-P RRSV、PEDVRNA标准品和构建的ASFV质粒分析单病原单重pcr的灵敏度;根据特异性和灵敏度实验结果分析引物设计是否符合设计预期。3、以鉴定符合设计预期的引物,参考gexp实验指导建立本研究的4种病原gexp多重检测方法,通过疫苗参考毒株及实验室分离鉴定毒株分析4种病原gexp多重检测方法的特异性;通过RNA标准品和质粒分析4种病原gexp多重检测方法的单病原和多病原灵敏度;根据特异性和灵敏度实验结果分析本实验建立的4种病原gexp多重检测方法的可行性。4、根据实验成果组装gexp多重检测试剂盒,使用单病原检疫标准方法和本实验组装的试剂盒同时检测本实验室从四川省各地区采集保存的64份临床病料;以单病原检疫标准方法作为参考,分析本实验组装的试剂盒的相对特异性、相对灵敏度、符合率;根据实验结果分析该试剂盒的临床应用价值。结果:1、单病原单重pcr实验结果显示本实验设计的引物能特异性地检出CSFV、H P-PRRSV、PEDV 参考株和 ASFV 质粒,而无法检出 PRRSV、JEV、FMDV、PP V、PCV、PRV、Mh、Er、Pm参考株;各病原单重pcr的灵敏度为102copies/μl;根据HP-PRRSV NSP2基因缺失区设计的引物能够特异性扩增HP-PRRSV参考株而无法扩增PRRSV参考株;本实验设计的引物符合实验预期,能够用于gexp多重检测方法的建立。2、根据gexp实验指导建立的4种病原gexp多重检测方法能够特异性地检出CSFV、HP-PRRSV、PEDV 参考株和 ASFV 质粒,而无法检出 PRRSV、JEV、FMD V、PPV、PCV、PRV、Mh、Er、Pm参考株;设计的HP-PRRSV引物能够特异性扩增HP-PRRSV参考株而无法扩增PRRSV参考株;gexp多重检测方法的单病原检测灵敏度在102copies/μl～103copies/μl之间,gexp多重检测方法的多病原检测灵敏度为103copies/μl;本实验建立的gexp多重检测方法具有很好的特异性和灵敏度,可以用于组装gexp多重检测试剂盒,探究临床应用价值。3、基于结果3组装gexp多重检测试剂盒;使用单病原检疫标准方法和本实验组装的试剂盒同时检测本实验室从四川省各地区采集保存的64份临床病料;本实验组装的gexp多重检测试剂盒的相对特异性和相对灵敏度均为100%,符合率为97%～100%。结论:本实验成功建立猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和非洲猪瘟病毒等病原gexp多重检测方法,组装了检测试剂盒;通过对临床病料的检测及与单病原检疫标准方法对比证实该试剂盒具有很好的临床应用价值。

关键词： CSFV HP-PRRSV ASFV PEDV gexp多重pcr

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