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gcnf在宫颈癌细胞中的表达及其作用初探

GCNF在宫颈癌细胞中的表达及其作用初探

作者：陈芳石河子大学

学位级别：硕士

目的:观察gcnf基因在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌组织以及体外培养宫颈癌细胞系（HeLa细胞）中的表达。构建人pcDNA3.1-gcnf真核表达载体,研究gcnf基因重组质粒表达产物对体外培养宫颈癌细胞增殖、凋亡、黏附和侵袭力的影响。 ... 详细信息

目的:观察gcnf基因在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌组织以及体外培养宫颈癌细胞系（HeLa细胞）中的表达。构建人pcDNA3.1-gcnf真核表达载体,研究gcnf基因重组质粒表达产物对体外培养宫颈癌细胞增殖、凋亡、黏附和侵袭力的影响。方法: （1）收集我校一附院病理科正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌（鳞癌）组织蜡块,并体外培养HeLa细胞,用免疫组织化学SP法观察gcnf基因在上述组织、细胞中的表达。（2）采用PCR的方法从pMD18-T-gcnf载体中扩增全长gcnf cDNA,酶切扩增产物及pcDNA3.1（-）载体质粒,酶切产物电泳回收后进行定向连接,构建pcDNA3.1-gcnf重组质粒,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,进行菌落PCR鉴定。扩增后提取重组质粒DNA进行PCR鉴定并制成甘油菌送往公司测序;（3）脂质体介导法瞬时转染重组质粒至宫颈癌HeLa细胞,RT-PCR以及间接免疫荧光鉴定转染结果;（4）倒置显微镜观察转染前后细胞形态的变化;MTT法检测转染前后细胞增殖的变化;Annexin V-PI双染流式细胞术分析转染前后细胞凋亡情况;基质黏附实验观察转染前后细胞黏附情况;Transwell侵袭实验检测转染前后细胞的侵袭能力。结果: 1.正常宫颈gcnf呈强阳性表达;CINⅠ中gcnf呈阳性表达;CINⅡ中只有个别细胞表达gcnf;CINⅢ中gcnf不表达;宫颈癌组织中gcnf不表达;HeLa细胞中gcnf不表达;***凝胶电泳在1450bp附近得到目的条带,经双酶切后与载体质粒连接得到pcDNA3.1-gcnf重组质粒,转化到大肠杆菌并经菌落PCR筛选得到单克隆菌株,抽提质粒DNA并经质粒PCR鉴定后测序,与基因库中登录的gcnf序列比较,符合率99.99%;3.阳性重组质粒脂质体法转染HeLa细胞,RT-PCR凝胶电泳显示转染目的基因后在200bp附近可见一条明亮的目的条带,其灰度比值（98.82±0.79）%明显高于未转染组和转染空质粒组（9.67±0.29,10.29±0.59）%,差异有统计学意义（P＜0.05）;间接免疫荧光结果显示,转染目的基因后,大部分HeLa细胞的gcnf呈阳性表达,转染空质粒和未转染组HeLa细胞无gcnf表达;4.转染后细胞形态无明显变化;MTT结果显示,转染目的基因后HeLa细胞光吸收值最大（0.239±0.011）,高于未转染组和转染空质粒组（0.203±0.009,0.196±0.016）（P＜0.05）;流式细胞仪检测凋亡细胞,显示转染目的基因后细胞凋亡率最低为11.46%（P＜0.05）,空质粒和未转染组的凋亡率分别为16.5%和15.34%;同样的干预条件用基质黏附实验检测细胞迁移率,和Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力,发现各小组之间没有明显差异。结论:（1）gcnf基因在正常宫颈组织中高表达可能与上皮细胞的正常分化有关;（2）首次观察到gcnf基因在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中表达由强变弱至宫颈浸润癌表达完全消失,提示gcnf基因可能未参与宫颈上皮细胞的异常分化或恶性分化;（3）gcnf基因在宫颈浸润癌以及体外培养HeLa细胞中不表达提示gcnf基因可能作为宫颈癌的一个早期诊断指标;（4）成功构建了pcDNA3.1-gcnf真核表达载体,并瞬时转染入宫颈癌HeLa细胞;（5）gcnf过表达可促进了体外培养的HeLa细胞的增殖,同时也可抑制其凋亡,而对HeLa细胞的黏附和侵袭没有影响。（6）本研究结果对宫颈癌早期诊断以及宫颈癌发病机制等提供参考。

关键词： gcnf 宫颈癌转染增殖凋亡 Transwell侵袭实验

过表达gcnf对HeLa细胞生物学行为的影响

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中国妇幼保健 2013年第17期28卷 2777-2781页

作者：王菊陈芳王苗周宗瑶石河子大学医学院组织胚胎学教研室新疆石河子832002

目的:将成功构建的人pcDNA3.1-gcnf真核表达载体瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,观察gcnf基因对HeLa细胞生物学功能的影响。方法:将重组质粒pcDNA3.1-gcnf转染HeLa细胞,通过MTT比色法、基质胶黏附实验和Transwell侵袭试验对转染后HeLa细胞增殖... 详细信息

目的:将成功构建的人pcDNA3.1-gcnf真核表达载体瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,观察gcnf基因对HeLa细胞生物学功能的影响。方法:将重组质粒pcDNA3.1-gcnf转染HeLa细胞,通过MTT比色法、基质胶黏附实验和Transwell侵袭试验对转染后HeLa细胞增殖、黏附和侵袭力进行分析。结果:成功获得瞬时转染的pcDNA3.1-gcnf HeLa细胞,转染目的基因组(0.239±0.014)与转染空质粒组(0.198±0.020)及未转染组(0.204±0.012)相比,细胞增殖最快(Pgcnf基因促进了体外培养的宫颈癌HeLa细胞增殖,但对HeLa细胞粘附、侵袭力没有明显的影响。

关键词： gcnf 宫颈癌转染粘附增殖侵袭

厚朴酚通过孤儿核受体gcnf调节心肌脂质代谢的研究

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厚朴酚通过孤儿核受体GCNF调节心肌脂质代谢的研究

作者：郝怿隆上海中医药大学

学位级别：硕士

背景:异常的心脏脂质代谢引发心脏脂毒性,临床最终表现为代谢紊乱为特征的非缺血性心力衰竭。血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)是血管生成素样蛋白之一,介导了对脂蛋白脂肪酶(LPL)活性的抑制作用。ANGPTL4表达或功能受损,造成心肌细胞内过度... 详细信息

背景:异常的心脏脂质代谢引发心脏脂毒性,临床最终表现为代谢紊乱为特征的非缺血性心力衰竭。血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)是血管生成素样蛋白之一,介导了对脂蛋白脂肪酶(LPL)活性的抑制作用。ANGPTL4表达或功能受损,造成心肌细胞内过度脂肪酸供应,从而引起心脏脂毒性病变。传统中医理论认为心脏脂毒性属于“痰”或“浊毒”的范畴,以化痰解毒为治疗原则。厚朴酚(Magnolol)提取自中药厚朴,是一种天然的双酚类化合物,具有保护心脏免受缺血/再灌注损伤、减少动脉粥样硬化变化、保护内皮细胞免于凋亡、抑制中性粒细胞-内皮粘附等多种心血管保护作用。其对心肌ANGPTL4的调节以及机制尚不清楚。本课题组前期在平滑肌细胞的基因芯片结果显示ANGPTL4可能是生殖细胞核因子(gcnf)的靶基因,而gcnf具有较为重要的血管生物学功能。本课题拟探究厚朴酚是否通过gcnf调节ANGPTL4基因进而调节心脏脂质代谢。目的:(1)厚朴酚是否调节心肌细胞系H9C2细胞中ANGPTL4的表达;(2)H9C2细胞中ANGPTL4是否是gcnf的靶基因;(3)中药厚朴酚是否通过gcnf调节ANGPTL4,这一作用是否依赖PPARδ。方法:采用MTT方法检测厚朴酚对H9C2细胞的毒性作用;采用RT-PCR技术,检测大鼠心脏、大鼠原代心肌细胞、H9C2细胞中ANGPTL4家族的表达;采用细胞免疫荧光染色技术,观察H9C2细胞中gcnf的亚细胞定位;分别采用RTqPCR、Western Blot技术,检测厚朴酚对H9C2细胞中gcnf mRNA和蛋白表达的影响;运用siRNA介导的沉默技术敲低H9C2细胞中gcnf,用RT-qPCR技术和Western Blot技术检测ANGPTL4的表达;分别采用siRNA介导的沉默技术敲低H9C2细胞中gcnf和腺病毒介导的gcnf过表达,观察gcnf是否参与厚朴酚对ANGPTL4的调节;采用萤光素酶报告基因检测技术,分析厚朴酚对ANGPTL4和gcnf基因启动子活性的影响;并检测gcnf敲低或者过表达对ANGPTL4基因启动子活性的影响;采用RT-qPCR技术检测饥饿大鼠和自发糖尿病小鼠心脏组织中gcnf的表达;采用细胞刮擦-愈合模型,检测过表达gcnf的H9C2细胞培养上清对内皮细胞(HUVEC)迁移的影响。结果:(1)大鼠心脏组织、原代心肌细胞和H9C2细胞系均表达ANGPTL 4;(2)厚朴酚上调H9C2细胞中ANGPTL4(Pgcnf(Pgcnf基因沉默可以降低H9C2细胞中ANGPTL4的mRNA表达水平(Pgcnf通过调控ANGPTL4启动子-500到-250 bp DNA来发挥对ANGPTL4的转录调节作用;(5)gcnf和PPARδ基因沉默均可以部分逆转厚朴酚诱导的ANGPTL4表达(Pgcnf和ANGPTL4表达增加(Pgcnf-ANGPTL4信号轴和PPARδ-ANGPTL4信号轴来上调心肌细胞中ANGPTL4的表达,而且是一种有效激动PPARδ的天然激动剂。厚朴酚通过激活PPARδ快速调节ANGPTL4表达,而通过上调gcnf维持ANGPTL4表达,有望作为一种治疗心脏脂毒性的潜在药物。

关键词：心脏脂毒性厚朴酚 PPARδ gcnf ANGPTL4

青鳉（Oryzias latipes）生殖细胞核因子gcnf的克隆与表达分析

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青鳉（Oryzias latipes）生殖细胞核因子gcnf的克隆与表达分析

作者：谢紫楠上海海洋大学

学位级别：硕士

生殖细胞核因子（Germ Cell Nuclear Factor,gcnf）是核受体超家族（Nuclear receptor superfamily,NRs）的转录因子,含有NRs基因结构特征的DNA结合域（DNA binding domain,DBD）和高度保守的配体结合域（Ligand binding domain,LBD）。gcnf对脊椎动物的生长发育、繁殖发育以及胚胎干细胞发育（Embryonic Stem Cells,ESCs）的分化和分裂具有关键作用。研究表明,在胚胎发育过程中,通过调控多潜能性相关基因,gcnf能够直接或间接影响胚胎发育的多能性、细胞分裂与分化、神经发育和疾病发生等多个方面;而在性腺发育过程中,gcnf无论对生殖细胞发育、性腺成熟,还是体内激素分泌都具有重要的调控作用。虽然gcnf在多个物种中被克隆和研究,但是gcnf在鱼类的研究却鲜有报道,而它的表达模式在脊索动物中不尽相同。青鳉（Oryzias latipes）是研究性别决定、脊椎动物发育和胚胎干细胞的良好模式物种。个体小、繁殖速度快、易存活、基因组小且具备完整的基因序列等优点是青鳉能够成为良好模式生物的关键,它为许多学者研究细胞生物学和发育生物学提供了广阔的研究平台。我们实验室目前已经获得许多生殖细胞特异标记的转基因鱼,这为研究脊椎动物生殖发育和相关生殖基因的功能影响奠定了研究基础,我们实验室对青鳉性腺基因的种系发育和性别调控进行了长期探索和验证,如boule和igf1等相关性腺基因。青鳉boule影响精巢发育,igf1影响青鳉卵巢分泌雌性激素。此外,青鳉piwi或vasa基因影响原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,PGCs）迁移;同时,dazl或dnd基因的功能缺失导致了PGCs缺失。因此,青鳉是一种研究性腺发育和生殖基因的良好模式生物。目前,青鳉中有关gcnf的研究尚未报道,但是gcnf在哺乳动物小鼠中被广泛研究。研究表明,小鼠gcnf RNA定位在精子发生阶段生殖细胞核周围的拟染色体（The Chromatoid Body,CB）中。CB属于生殖质（Germ Plasm）类似物,它具有核周状细胞质云状构型,是充当RNA存储和加工的生殖细胞特异性中心场所。此外,有研究发现多个生殖基因均存在CB中,成为CB的成分之一,如piwi和vasa等。其中,已被证明vasa是具有性腺发育调控作用的生殖标记基因,影响青鳉性腺发育。因此,本研究通过对青鳉gcnf的克隆和表达分析,预测并验证其与CB的定位,进一步分析和探究gcnf在青鳉性腺发育的潜在作用。本研究首次获得了青鳉gcnf的两个基因亚型gcnfa和gcnfb基因全长编码片段,它们分别编码了484个氨基酸和451个氨基酸,并从基因水平和转录水平分析其表达情况。gcnf在进化上具有高度保守性,含有典型的DNA结合区域和配体结合区域,且与其他物种的同源性达到60%以上。通过分子克隆技术发现青鳉gcnf的两个基因亚型gcnfa和gcnfb均是青鳉组织和胚胎发育的重要参与者。在组织发育中,gcnfa RNA仅存在性腺中,而gcnfb RNA除了在性腺中表达外,在眼睛、脑、肾脏也有信号出现,且在肾脏的信号较弱。在胚胎发育中,gcnfa RNA在整个青鳉胚胎发育时期持续存在,而gcnfb RNA主要在胚胎发育时期的神经胚期才开始表达。原位杂交结果显示在卵巢中,gcnf RNA存在早期卵母细胞中,在成熟卵母细胞、卵原细胞以及卵巢体细胞中不表达;在精巢中,gcnf RNA在精子发生后期阶段的圆形精细胞和延长的精子中表达,在精母细胞和精原细胞中不表达。此外,表达信号前期出现在圆形精细胞核周围,中期动态分布在细胞的头部和尾部,最后逐渐集中在成熟精子顶体部位和鞭毛微管周围。与生殖细胞标记基因的vasa共定位分析发现,gcnf RNA在精子发生阶段的CB中积累,是CB的组成成分。此外,CB在精子发生阶段呈现动态变化。圆形精细胞的CB分散在细胞质周围,经过细胞变形,CB浓缩形成致密颗粒,成为延长精子发育所必需成分之一。因此,本研究预示了gcnf在青鳉性腺及生殖发育的作用,为以后研究gcnf在青鳉性腺和生殖发育潜在功能机制提供科学依据。

关键词：青鳉 gcnf 性腺 CB 胚胎

pcDNA3.1-gcnf真核表达载体构建及其对HeLa细胞凋亡的影响

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石河子大学学报（自然科学版） 2011年第2期29卷 193-197页

作者：陈芳王菊宋勇周宗瑶石河子大学医学院石河子832002

构建人pcDNA3.1-gcnf真核表达载体,并瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,观察gcnf基因对HeLa细胞凋亡的影响。采用PCR的方法从pMD18-T-gcnf载体中扩增全长gcnf cDNA,将扩增产物克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),测序鉴定后,重组质粒pcDNA3.1-gcnf转... 详细信息

构建人pcDNA3.1-gcnf真核表达载体,并瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,观察gcnf基因对HeLa细胞凋亡的影响。采用PCR的方法从pMD18-T-gcnf载体中扩增全长gcnf cDNA,将扩增产物克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),测序鉴定后,重组质粒pcDNA3.1-gcnf转染HeLa细胞,RT-PCR以及间接免疫荧光鉴定转染结果,并用Annexin V-PI双染流式细胞术分析细胞凋亡情况。结果显示,克隆的重组真核表达载体经序列测定分析后,证实pcDNA3.1-gcnf重组真核表达质粒构建成功,并获得瞬时转染pcDNA3.1-gcnf的HeLa细胞。流式细胞术检测:转染重组质粒组的细胞凋亡率(6.72%)低于转染空质粒组(9.78%)以及未转染组(9.34%),Pgcnf重组质粒瞬时转染子宫颈癌HeLa细胞后,gcnf基因可以抑制HeLa细胞凋亡。

关键词： gcnf 真核表达载体 HeLa细胞转染

生殖细胞核因子在不同成长期大鼠附睾中的表达

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中华医学杂志 2004年第13期84卷 1126-1129页

作者：张秋养邱曙东杨洁王志勇西安交通大学医学院组胚教研室

目的　探讨生殖细胞核因子 (gcnf)在大鼠附睾中的时空表达与分布。方法　应用免疫组化和蛋白质免疫印迹技术 ,检测gcnf蛋白在出生后 7、14、2 8、4 5、6 0、90天龄和 18月龄大鼠附睾内的表达、定位和发育变化 ,并通过凝胶成像及图像分... 详细信息

目的　探讨生殖细胞核因子 (gcnf)在大鼠附睾中的时空表达与分布。方法　应用免疫组化和蛋白质免疫印迹技术 ,检测gcnf蛋白在出生后 7、14、2 8、4 5、6 0、90天龄和 18月龄大鼠附睾内的表达、定位和发育变化 ,并通过凝胶成像及图像分析系统对实验结果进行统计学分析。结果　gcnf表达于出生后 14天龄至 18月龄大鼠附睾上皮的细胞核内 ,其表达呈明为的年龄相关性和附睾区段以及细胞特异性。 14天龄附睾上皮内出现散在阳性细胞核 ,2 8天龄时阳性细胞数和阳性强度明显增强 ,4 5天龄时达到高峰。成年后阳性细胞数维持不变而阳性染色强度开始逐渐减弱 ,18月龄时减弱非常明显。附睾管上皮内的各种细胞如主细胞、基细胞、顶细胞、狭窄细胞和亮细胞等均呈gcnf阳性染色 ,从附睾起始段到尾段到尾段均有阳性染色 ,其中以近端头部最强 ;远端尾部主细胞核阳性减弱非常明显甚至呈阴性 ,而亮细胞核则阳性较强。 14d后各年龄组附睾抽提物中均可见 5 50 0 0处有gcnf特异性条带 ,其年龄变化与免疫组化结果一致。结论　gcnf在大鼠附睾上皮内的表达与附睾上皮分化和发育过程明显相关 ,且其分布表现出明显的附睾区段和细胞特异性。

关键词：生殖细胞核因子大鼠成长期附睾基因表达 gcnf 免疫组织化学蛋白质免疫印迹

小鼠精原干细胞体外分化及相关基因表达的研究

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小鼠精原干细胞体外分化及相关基因表达的研究

作者：王宝峰石河子大学

学位级别：硕士

目的：体外培养小鼠精原干细胞（mouse spermatogonial stem cells,mSSCs）,并通过全反式视黄酸（ATRA, all-trans retinoic acid）进行诱导分化,观察小鼠精原干细胞在诱导中的变化情况,检测Stra8、mina53、Oct-4、gcnf在mSSCs体外分化... 详细信息

目的：体外培养小鼠精原干细胞（mouse spermatogonial stem cells,mSSCs）,并通过全反式视黄酸（ATRA, all-trans retinoic acid）进行诱导分化,观察小鼠精原干细胞在诱导中的变化情况,检测Stra8、mina53、Oct-4、gcnf在mSSCs体外分化中的表达,有助于研究精原干细胞体外分化的最佳条件和分子生物学特性,从精原干细胞体外分化的角度理解和认识此过程基因表达调控机制方法：本研究体外分离培养6-8天BABL/C小鼠睾丸的SSCs,进行形态学鉴定,并通过含10% FBS、ATRA浓度为1.0×10-5mol/L的L-DMEM培养基对精原干细胞进行体外诱导分化,观察mSSCs加入诱导剂后的形态学变化,用间接免疫荧光技术从c-kit、Oct-4、gcnf三个标志物表达情况观察诱导分化情况,通过RT-PCR检测mSSCs诱导分化前后（0h,2h,12h,3d,5d） Stra8、mina53、Oct-4、gcnf的mRNA的水平,初步了解Stra8、mina53、Oct-4、gcnf的表达状况,以及与mSSCs体外分化的相关情况。结果：1、形态学变化显示ATRA使mSSCs向精母细胞方向发生了分化,并通过间接免疫荧光反应进行鉴定;2、Stra8在mSSCs诱导分化2 h、12 h、3 d、5 d的水平高于成年小鼠和未诱导分化的水平,其中12h的表达水平最高,3d、5d时水平低于2 h,各对照组间差异具有统计学显著性;mina53的表达在诱导后增加,其中诱导2 h、12h时水平高于3d、5d及成年小鼠和未诱导mSSCs的水平,但诱导3d、5d组与成年小鼠组差异不具统计学显著性。3、Oct-4在1nSSCs诱导前呈表达水平最高,诱导2h、12h后下降,3d组和5d组均为阴性。4、gcnf的表达在诱导2h后表达开始增强,3d时表达水平最高,而5d时表达为阴性,在诱导组与成年小鼠睾丸之间表达差异具有显著统计学意义。结论：（1）ATRA在体外诱导mSSCs分化成功。（2）Stra8基因在ATRA诱导mSSCs体外分化中可能发挥了启动减数分裂的作用,但Stra8、mina53基因在SSCs分化中的表达是否具有相关性是不能确定的。（3）在ATRA诱导mSSCs体外分化过程中,gcnf和Oct-4的表达呈负相关。

关键词：精原干细胞 Stra8 mina53 gcnf Oct-4 全反式维甲酸分化增殖

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生殖细胞核因子在恶性生殖细胞肿瘤中的表达

生殖细胞核因子在恶性生殖细胞肿瘤中的表达

作者：高启云石河子大学

学位级别：硕士

目的：观察gcnf及其相关因子Oct-4在恶性生殖细胞肿瘤中的表达,同时观察2种基因在P19细胞体外诱导分化前后的表达,为进一步研究恶性生殖细胞肿瘤的发病机制,诊断及治疗提供新思路。方法：1.收集我校一附院病理科30余年来（1975.1-20... 详细信息

目的：观察gcnf及其相关因子Oct-4在恶性生殖细胞肿瘤中的表达,同时观察2种基因在P19细胞体外诱导分化前后的表达,为进一步研究恶性生殖细胞肿瘤的发病机制,诊断及治疗提供新思路。方法：1.收集我校一附院病理科30余年来（1975.1-2007.12）存档的所有恶性生殖细胞肿瘤蜡块,3μm厚连续切片;运用RT-PCR技术,免疫组织化学,免疫组织化学半定量,间接免疫荧光双标记等技术检测gcnf和Oct-4在恶性生殖细胞肿瘤。2.体外培养P19细胞,用全反式维甲酸诱导肿瘤细胞分化,在不同时间段用上述方法检测gcnf和Oct-4的表达。结果：首次观察到gcnf在所有的恶性生殖细胞肿瘤及无瘤变的睾丸组织中均有表达;Oct4表达于大部分未成熟畸胎瘤（8/10）,全部的无性细胞瘤及精原细胞瘤,而在其他恶性生殖细胞肿瘤及无瘤变的睾丸及卵巢组织未见表达。gcnf和Oct-4均定位于肿瘤细胞的胞核。免疫组织化学半定量结果显示,gcnf与Oct-4在不同类型肿瘤组织中的表达量的差异有统计学意义,二者表达呈负相关。对于不同类型的恶性生殖细胞肿瘤来说,向原始生殖细胞方向分化越远,Oct-4表达程度越低,甚至不表达,而gcnf表达程度就越强烈。间接免疫荧光双标记显示,在同一肿瘤细胞中gcnf和Oct-4蛋白不同时强阳性表达;用ATRA诱导P19细胞3天时,gcnf的表达量增加,同时Oct-4的表达下调,gcnf和Oct-4的表达呈负相关。结论：（1）gcnf在恶性生殖细胞肿瘤中的定位提示gcnf可能与肿瘤的恶性程度相关;（2）gcnf在恶性生殖细胞肿瘤及体外诱导分化中表达量的变化,提示gcnf和Oct-4的表达程度可能与肿瘤的分化程度或分化方向有关;（3）gcnf和Oct-4在恶性生殖细胞肿瘤中呈负相关,提示gcnf在恶性生殖细胞肿瘤中的作用可能是通过抑制Oct-4基因的表达而实现的;（4）gcnf和Oct-4在P19细胞诱导分化前后表达量的变化,提示gcnf可能通过下调Oct4基因的表达参与恶性生殖细胞肿瘤的分化。

关键词：恶性生殖细胞肿瘤 gcnf Oct-4 RT-PCR

生殖细胞核因子和OCT-4在宫颈癌中的表达研究

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生殖细胞核因子和OCT-4在宫颈癌中的表达研究

作者：王苗石河子大学

学位级别：硕士

目的：明确gcnf及OCT-4基因在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织（CIN）及宫颈鳞癌组织中是否表达以及其表达关系，以期为临床宫颈癌的诊断和治疗提供新的靶点或参考。方法：（1）收集石河子大学一附院病理科20例正常宫颈组织、70例宫... 详细信息

目的：明确gcnf及OCT-4基因在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变组织（CIN）及宫颈鳞癌组织中是否表达以及其表达关系，以期为临床宫颈癌的诊断和治疗提供新的靶点或参考。方法：（1）收集石河子大学一附院病理科20例正常宫颈组织、70例宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelial neoplasia,CIN）组织及29例宫颈鳞癌组织，运用免疫组化SP法观察gcnf及OCT-4蛋白的表达;（2）运用RT-PCR的方法分别检测9例正常宫颈组织、10例CINⅠ、9例CINⅡ、10例CINⅢ和9例宫颈鳞癌组织中gcnf及OCT-4mRNA的表达水平，所得数据在Excel中建立数据库，利用spss13.0软件进行统计学处理。结果:（1）gcnf蛋白在阳性对照成人睾丸组织中强阳性表达，主要定位于圆形精子细胞或粗线期精母细胞胞核中，呈棕褐色;在正常宫颈组织呈中等阳性表达，阳性着色为棕黄色定位于细胞核，表达率为90.0%（18/20）;在宫颈上皮内瘤变(CIN)组织中呈中等阳性或弱阳性表达，表达率在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中分别为78.3%（18/23）、45.0%（9/20）和33.3%（9/27）;在宫颈鳞癌组织中大部分呈阴性表达，个别组织呈弱阳性表达，表达率为13.8%（4/29）。（2）gcnf RT-PCR凝胶电泳结果显示，gcnf目的条带为200bp，在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和和宫颈鳞癌组织中均可观察到，但其亮度从正常宫颈组织到宫颈鳞癌组织逐渐变暗。各组织电泳条带经凝胶系统扫描分析后，gcnf/GAPDH灰度比值在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌组织分别为0.827±0.013、0.687±0.016、0.621±0.038、0.606±0.023和0.464±0.036，每一例组织均重复三次取其平均值作为最后的灰度比值。经统计学分析正常宫颈组织与CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌组织相比差异均具有统计学意义，但CINⅡ与CINⅢ相比差异无统计学意义。（3）OCT-4蛋白在阳性对照精原细胞瘤中呈强阳性表达，阳性染色主要定位于细胞核，呈片状或块状棕黄色颗粒。但其在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ以及宫颈鳞癌组织中均不表达。（4）OCT-4RT-PCR凝胶电泳结果显示，OCT-4目的条带为218bp，仅在阳性对照精原细胞瘤组织中观察到，在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌组织中均未观察到。结论：（1）gcnf基因在正常宫颈组织中主要表达于基底层和棘层细胞中，表明该基因可能与上皮细胞的正常分化有关;（2）gcnf基因在宫颈鳞癌组织中表达下调或表达缺失，表明该基因可能与肿瘤细胞的异常分化有关;（3）gcnf和OCT-4的表达在宫颈鳞癌中没有关系。

关键词：宫颈癌 gcnf OCT-4 免疫组化 RT-PCR