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gax基因在缺氧性大鼠肺动脉平滑肌细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

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中华内科杂志 2008年第6期47卷 505-506页

作者：夏世金董竞成邰先桃王耀丽钱桂生复旦大学附属华山医院中西医结合研究所卫生部细胞分子生物学重点实验室上海200040 云南中医学院第一附属医院第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所

最近实验观察到低氧可导致大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖，同时发现PASMCs在转录和翻译水平上均有gax基因表达，低氧可下调其表达，表明低氧是影响PASMCsgax基因表达的一个因素，gax基因表达下调与PASMCs增殖有关。而外源性gax基... 详细信息

最近实验观察到低氧可导致大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖，同时发现PASMCs在转录和翻译水平上均有gax基因表达，低氧可下调其表达，表明低氧是影响PASMCsgax基因表达的一个因素，gax基因表达下调与PASMCs增殖有关。而外源性gax基因在低氧性PASMCs是否能够过表达，并抑制细胞增殖目前尚不清楚。本实验旨在观察Ad-gax转染后gax基因在缺氧性大鼠PASMCs的表达及其对细胞增殖的影响。

关键词：肺动脉平滑肌细胞抑制细胞增殖 gax基因缺氧性大鼠 PASMCs 实验观察基因表达

gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞增殖与ET-1、VEGF和eNOS蛋白表达的影响

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中国老年学杂志 2013年第24期33卷 6170-6172页

作者：夏世金吴俊珍万文斌孙涛彭正羽吴金峰胡明冬钱桂生复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所上海200040 复旦大学附属华东医院老年医学科复旦大学生物医学研究院复旦大学附属华山医院中西医结合科第三军医大学新桥医院呼吸科

目的观察gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞(PAEC)增殖及内皮素(ET-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达的影响。方法取大鼠肺动脉,用酶消化法获取PAEC并进行原代培养;分4组:未转染常氧对照组(常氧组)、未转染... 详细信息

目的观察gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞(PAEC)增殖及内皮素(ET-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达的影响。方法取大鼠肺动脉,用酶消化法获取PAEC并进行原代培养;分4组:未转染常氧对照组(常氧组)、未转染低氧处理组(低氧组)、Ad-βGal转染再行低氧处理对照组(Ad-βGal+低氧组)、Ad-gax转染再行低氧处理组(Ad-gax+低氧组)。分别在常氧(21%O2)和低氧(2.5%O2)6 h后,采用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测PAECs增殖和培养上清液中ET-1、VEGF和eNOS蛋白水平。结果与常氧组比较,低氧组和Ad-βGal+低氧组PAEC的3H-TdR掺入量均显著升高(Pgax+低氧组PAEC的3H-TdR掺入量均明显降低(Pgax+低氧组PAEC上清中VEGF和ET-1水平均明显降低(Pgax基因表达可抑制细胞异常增殖;低氧上调PAEC中VEGF和ET-1含量,下调eNOS含量,而增强gax表达可以逆转这种现象。

关键词： gax基因低氧肺动脉高压内皮细胞增殖血管内皮生长因子内皮素-1 内皮型一氧化氮合酶

人gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第1期27卷 29-32页

作者：郑辉薛松连锋汪永义上海交通大学医学院附属仁济医院心胸外科上海200127

目的:构建人gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-gax质粒中扩增出人gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序... 详细信息

目的:构建人gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-gax质粒中扩增出人gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人gax真核表达载体pEGFP-N1-gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人gaxmRNA表达。结论:成功构建人gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。

关键词： gax基因真核表达基因转染兔血管平滑肌细胞

gax基因过表达对自体移植静脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

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gax基因过表达对自体移植静脉平滑肌细胞增殖的抑制作用

作者：王为中国医科大学

学位级别：硕士

目的随着静脉移植在治疗冠心病和周围动脉缺血性疾病中的广泛应用，内膜增殖所引起的移植静脉狭窄成为影响术后远期效果的主要因素。据统计，静脉移植术后早期(移植后30天内)静脉阻塞率达5-26％;在晚期(移植后2年以上)，动脉重建后的5... 详细信息

目的随着静脉移植在治疗冠心病和周围动脉缺血性疾病中的广泛应用，内膜增殖所引起的移植静脉狭窄成为影响术后远期效果的主要因素。据统计，静脉移植术后早期(移植后30天内)静脉阻塞率达5-26％;在晚期(移植后2年以上)，动脉重建后的5年累积阻塞率高达40％。这主要是由于血管内膜增生(intimal Lyperplasin，IH)及粥样硬化导致的再狭窄所致，严重影响了远期疗效。内膜增生的发生机制尚不明确，但大量文献揭示，损伤、缺血、血小板衍生促生长因子、动脉血液动力学及移植静脉与动脉的顺应性差异等多种因素，均和内膜增生的发生、发展有关。目前认为：血管内皮细胞(VEC)结构与功能的完整性在维持血管正常结构与生物学功能及移植血管重塑过程中起着重要作用。静脉移植术中机械性损伤及慢性缺血、缺氧等因素均可导致VEC结构受损，引起术后移植静脉夏H及血管再狭窄。早期恢复VEC结构及其生物学功能，即再内皮化，已成为防治移植静脉IH的重要途径之一。如何抑制移植静脉内膜增生是血管外科亟待解决的重大课题之一。深入研究移植血管再内皮化相关基因，将为其在基因治疗方面提供重要的实验依据。 gax基因是近年来备受重视的与血管形成和生长有关的转录因子，本实验通过观察gax基因过表达对移植静脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)表型变化的影响，探索一种防治移植静脉再狭窄的治疗方法。方法采用28只wistar大鼠，雌雄不拘，体重(250±40)克/只，3个月龄。随机分为对照组与实验组，每组14只，均行自体颈内静脉-颈总动脉移植术。实验组移植的颈内静脉及吻合口以含有腺相关病毒介导gax凝胶涂布。对照组移植静脉仅以空白凝胶处理。术后14d切取移植静脉，采用反转录酶链式反应(RT-PCR)、蛋白印迹法(Western blotting)、免疫组织化学及电镜分析法观察gax基因及蛋白表达情况和平滑肌细胞表型的转变。结果实验组与对照组比较:实验组中mRNA表达、gax蛋白表达均较对照组明显增加(P均gax基因转染移植静脉后，14d时观察到了gax mRNA及其蛋白的表达水平均显著增高。采用免疫组化法观察到PCNA在静脉移植术后14d时表达明显减弱，表明处于增殖期的合成表型VSMC数量的减少。通过电子显微镜，在超微结构方面进一步证实到了处于合成分泌型的VSMC数减少，而收缩表型和中间型VSCM则有所增多。血管内膜过度增生(intimal场pe甲lasia，IH)与vsMe合成表型密切相关，在gax基因过表达状态下显著诱导增殖型vsMc凋亡，从而使收缩表型VSMC相对增多，在一定程度上抑制了增殖型VSMC向内的迁移并相对减少细胞外基质的合成。结论实验表明移植静脉重塑早期出现gax表达上调或过表达 PCNA又称周期蛋白，其量可客观反映VSMCS增殖数量及分布。VSMC是构成血管壁的主要细胞之一，是决定血管活性与构型的重要因素，细胞表型转化(phenotype switeh)是其重要的特征。血管内膜过度增生(intimalhyPerplasia，IH)是以VSMC过度增殖病理改变为基础，而vsMc的增殖又取决于其表型转化状态。即IH与vSMC合成表型密切相关，gax基因通过细胞凋亡途径发挥作用可诱导VSMc凋亡。在gax基因过表达状态下显著诱导增殖型VSMC凋亡，从而使收缩表型VSMC相对增多，在一定程度上抑制了增殖型VSMC向内的迁移并相对减少细胞外基质的合成。本实验证明，1.通过RT一PCR和蛋白印迹杂交检测到移植静脉中gaxmRNA和蛋白表达均升高1倍，提示以重组腺相关病毒为载体，介导gax基因转染移植静脉组织获得成功，并能表达。2.通过电镜及PCNA检测观察到实验组血管组织中合成表型状态的VSMC显著减少，而收缩表型的VSMC相对升高

关键词：移植静脉 gax基因血管内皮生长因子血管内皮细胞

腺病毒介导gax基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响

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第三军医大学学报 2005年第14期27卷 1443-1445页

作者：王耿何国祥冉擘力张萍景涛陈渝第三军医大学西南医院心血管内科重庆市介入心脏病学研究所重庆400038

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),探讨gax基因表达增强后VSMC迁移的变化。方法以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化,Boyden's... 详细信息

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),探讨gax基因表达增强后VSMC迁移的变化。方法以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化,Boyden's小室观察gax基因表达增强对VSMC迁移的影响。结果①AdCMV-gax转染前,PDGF-BB下调gax蛋白的表达,接近正常生理浓度的PDGF-BB(2ng/ml)即可使VSMC的gax蛋白表达率由36·42%显著降低至22·83%(Pgax基因表达下降程度更加显著;AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高。②AdCMV-gax转染使VSMC表达gax增强后,VSMC迁移数较未转染组显著减少。结论增强gax基因表达,可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC迁移。

关键词： gax基因血管平滑肌细胞细胞迁移腺病毒

腺病毒介导gax基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖

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第三军医大学学报 2003年第24期25卷 2177-2180页

作者：王耿何国祥徐晓辉冉擘力张萍陈渝第三军医大学附属西南医院心血管内科重庆400038 哈尔滨医科大学第一附属医院呼吸科哈尔滨150000

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,探讨gax基因表达增强后VSMC增殖的变化。方法　以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体 (AdCMV gax)常规转染VSMC后 ,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化 ... 详细信息

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,探讨gax基因表达增强后VSMC增殖的变化。方法　以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体 (AdCMV gax)常规转染VSMC后 ,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化 ;应用四唑盐 (MTT)比色试验、3H标记的胸腺嘧啶核苷 ( 3H TdR)掺入试验和流式细胞仪检测观察gax基因表达增强对VSMC增殖的影响。结果　①AdCMV gax转染前 ,PDGF BB下调gax蛋白的表达 ,接近正常生理浓度的PDGF BB( 2ng ml)即可使VSMC的gax蛋白表达率由 3 6.42 %显著降低至 2 2 .83 %(P gax基因表达下降程度更加显著 ;AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高。②AdCMV gax转染使VSMC表达gax增强后 ,VSMC的MTT吸光度值和3H TdR掺入量均较未转染组显著降低 ,G0 G1期的VSMC比例较未转染组显著增高 (P <0 .0 1) ,G2 M期和S期细胞比例显著降低 (P <0 .0 1)。

关键词： gax基因血管平滑肌细胞细胞增殖

同源异形盒gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

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军事医学科学院院刊 2006年第1期30卷 55-59页

作者：刘平张运冯进波季晓平王荣姜虹丁士芳张澄山东大学齐鲁医院心内科山东大学心血管研究中心卫生部心血管重构与功能研究重点实验室济南250012

目的:构建同源异形盒gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠gax基因,将gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdea... 详细信息

目的:构建同源异形盒gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠gax基因,将gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带gax基因的重组腺病毒载体pAd-gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带gax基因的重组腺病毒Ad-gax。利用GFP的表达鉴定Ad-gax。结果:构建了表达gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。

关键词： gax基因基因,同源盒腺病毒科缺陷病毒同源重组

低氧对大鼠肺动脉平滑肌细胞中gax基因表达及细胞增殖的影响

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第三军医大学学报 2006年第3期28卷 195-197页

作者：夏世金钱桂生胡明冬黄勇谭永红第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所全军呼吸病研究重点实验室重庆400037

目的探讨低氧对肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中生长终止特异性同源盒(growth arrest-spec ific homeobox,gax)基因表达及细胞增殖的影响。方法以RT-PCR法、免疫细胞化学法和W estern blot法测定经低氧处理后的大鼠PASMCs中gax mRNA和蛋白表达3。H-TdR掺入法观察低氧处理后PASMCs增殖情况。结果RT-PCR、免疫细胞化学和W estern blot检测证实低氧(2.5%O2)处理后的PASMCs中gax mRNA和蛋白的表达逐渐降低;与常氧组比较,低氧组gax mRNA和蛋白的表达显著下降3。H-TdR掺入法测定结果示PASMCs3H-TdR掺入量在低氧6 h开始增加,随着低氧时间延长,3H-TdR掺入量逐渐增加,至低氧24 h时3H-TdR掺入量最高。结论低氧可下调大鼠PASMCs中gax mRNA和蛋白的表达并诱导PASMCs增殖,提示gax基因在低氧性PASMCs增殖过程中可能起着重要作用。

关键词： gax基因低氧肺动脉平滑肌细胞增殖

gax基因双向调节低氧性肺动脉内皮细胞增殖及影响HIF-1α基因表达的研究

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中华肺部疾病杂志（电子版） 2013年第6期6卷 4-8页

作者：胡明冬夏世金吴俊珍孙涛吴金峰彭正羽钱桂生第三军医大学新桥医院呼吸内科重庆400037 复旦大学附属华东医院老年医学研究所上海200040 复旦大学附属华东医院老年医学科上海200040 复旦大学附属华山医院中西医结合科上海200032 复旦大学生物医学研究院

目的观察gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞(PAECs)增殖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因表达的影响,为进一步研究gax基因调节低氧性肺动脉高压(HPH)的作用与机制奠定基础。方法取大鼠肺动脉,用酶消化法获取PAECs并进行原代培养;PAECs分4组... 详细信息

目的观察gax基因对低氧性肺动脉内皮细胞(PAECs)增殖和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因表达的影响,为进一步研究gax基因调节低氧性肺动脉高压(HPH)的作用与机制奠定基础。方法取大鼠肺动脉,用酶消化法获取PAECs并进行原代培养;PAECs分4组:未转染常氧对照组(常氧组)、未转染低氧处理组(低氧组)、Ad-βGal转染再行低氧处理组(Ad-βGal+低氧组)、Ad-gax转染再行低氧处理组(Ad-gax+低氧组)。分别在常氧(21%O2)和低氧(2.5%O2)1 h、3 h、6 h和12 h各时相点,采用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法检测PAECs增殖;使用RT-PCR和Western blot方法分别检测PAECs中HIF-1αmRNA和蛋白表达水平。结果①PAECs的3H-TdR掺入量:与常氧组同时相点比较,低氧组和Ad-βGal+低氧组均显著升高(P均gax+低氧组与常氧组同时相点比较均显著升高(P均gax+低氧组HIF-1αmRNA和蛋白表达皆显著下调,差异有统计学意义(Pgax基因的表达可抑制细胞的异常增殖;随着低氧时间的不断延长,细胞增殖受到抑制,而此时增强内皮细胞中gax基因表达却又促进细胞增殖,以此来维持细胞的数量。结论 gax基因对维持内皮细胞数量的稳态具有双向调节作用。增强gax基因的表达能下调低氧诱导的HIF-1αmRNA和蛋白表达,这可能与gax基因抑制低氧性内皮细胞异常增殖的机制相关。

关键词： gax基因低氧肺动脉高压内皮细胞增殖低氧诱导因子-1α