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gtl2基因在体细胞核移植牛中的印记状态分析

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生物化学与生物物理进展 2008年第10期35卷 1183-1187页

作者：王建春李冬杰杜卫华樊宝良李宁李世杰河北农业大学生命科学学院保定071001 河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018 中国农科院北京畜牧兽医研究所北京100094 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京100094

体细胞核移植技术(SCNT)在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素.印记基因在哺乳动物胚胎发育和出生后的正常生长中都具有十分重要的作用,gtl2基因是在人和鼠中已被鉴定的印... 详细信息

体细胞核移植技术(SCNT)在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素.印记基因在哺乳动物胚胎发育和出生后的正常生长中都具有十分重要的作用,gtl2基因是在人和鼠中已被鉴定的印记基因,它作为一种RNA调解分子调控目的mRNA的转录.为了研究gtl2基因在自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的印记状态,首先应用PCR-SSCP方法对gtl2基因多态性进行检测,鉴定自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的杂合子,进而利用RT-PCR-SSCP技术对gtl2基因在杂合子牛的心、肝、脾、肺、肾、大脑中的表达状态进行分析.研究结果表明:gtl2基因在自然繁殖牛的被检测的6个组织中均表现为单等位基因表达,在体细胞核移植牛的心和肝中表现为单等位基因表达,而在大脑、脾、肺、肾中为双等位基因表达,gtl2基因在体细胞核移植牛的部分组织中表达紊乱有可能是造成体细胞核移植牛器官发育异常和核移植效率低下的原因之一.

关键词：牛 gtl2 基因组印记体细胞核移植

Peg3,Cdkn1c和gtl2基因在克隆绵羊和自然分娩绵羊中的DNA甲基化水平检测（英文）

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生物化学与生物物理进展 2016年第7期43卷 706-715页

作者：王峰潘静赵丽霞刘羿羿张立王申元李璐周欢敏张东内蒙古农业大学生命科学学院呼和浩特010018 内蒙古自治区生物制造重点实验室呼和浩特010018 南开大学生命科学学院天津300071

尽管研究证明很多克隆动物存在DNA甲基化异常的情况,却很少有研究比较克隆绵羊与自然分娩绵羊之间的甲基化情况,可能是由于克隆绵羊的获得、绵羊基因组、绵羊基因组印记等因素的限制.本研究中,为了证明克隆绵羊重编程的状况,克隆了Peg3... 详细信息

尽管研究证明很多克隆动物存在DNA甲基化异常的情况,却很少有研究比较克隆绵羊与自然分娩绵羊之间的甲基化情况,可能是由于克隆绵羊的获得、绵羊基因组、绵羊基因组印记等因素的限制.本研究中,为了证明克隆绵羊重编程的状况,克隆了Peg3基因的差异甲基化区域(differential methylated region,DMR),并且分析了Peg3、Cdkn1c、gtl2在克隆绵羊和自然分娩绵羊不同组织中的甲基化水平.研究发现,在克隆绵羊和自然分娩绵羊中Peg3呈现为超甲基化水平,在克隆绵羊的肾脏和肺脏中DNA甲基化水平为95.45%、81.18%,相对于正常分娩的绵羊组织中的98.18%、87.27%无显著性差异,而Cdkn1c在两组实验动物中的肾脏和肺脏中表现为非甲基化水平,分别为0%、0.53%、0.53%和0.53%,gtl2则是低甲基化水平,并且克隆绵羊与正常分娩绵羊之间的DNA甲基化水平无显著性差异(r^2=0.77).这些结果表明,Peg3、Cdkn1c、gtl2三个印记基因在克隆绵羊和自然分娩绵羊组织中呈现类似甲基化水平,无显著性差异.

关键词： DNA甲基化 Peg3 Cdkn1c gtl2 克隆绵羊

gtl2基因在体细胞核移植牛中的印记状态研究

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Gtl2基因在体细胞核移植牛中的印记状态研究

作者：王建春河北农业大学

学位级别：硕士

体细胞核移植技术(SCNT)在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素。目前认为:供体核的不完全重编程导致在发育过程中有重要作用的基因没有表达或异常表达是体细胞核移植效率低... 详细信息

体细胞核移植技术(SCNT)在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素。目前认为:供体核的不完全重编程导致在发育过程中有重要作用的基因没有表达或异常表达是体细胞核移植效率低的主要原因。大多数印记基因在调控胚胎生长和出生后的发育中起重要作用,体细胞核移植动物表现出的发育异常很可能与印记基因表达紊乱有关,但是在体细胞核移植牛中,由于缺少牛印记基因序列以及多态性信息,对印记基因表达的研究较少。gtl2基因是在人和鼠中已被鉴定的印记基因,它作为一种RNA调解分子调控目的mRNA的转录,在胚胎发育过程中起着重要作用。为了探讨造成体细胞核移植动物新生死亡以及器官发育异常的可能分子机理,我们分析了gtl2基因在自然繁殖牛和新生死亡的体细胞核移植牛心、肝、脾、肺、肾、大脑6个组织中的表达情况。印记基因表达状态的分析是基于印记基因为单等位基因表达,所以必须首先在亲本等位基因上找到单核苷酸多态性(SNP),即基因组中单个核苷酸突变引起的DNA序列多态性,包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。单链构象多态性(SSCP)技术以其可重复性好、快速、简单的特点成为寻找SNP最常用的方法之一,本研究应用PCR-SSCP方法对牛gtl2基因的多态性进行分析。首先,根据已发表的羊gtl2基因(AY017220,AY017221,AY017222)与牛的基因序列(XM872590)进行同源性分析,设计3对扩增产物在100 bp～300 bp范围的PCR引物以获得最佳的SSCP结果。进而,应用PCR-SSCP技术分析牛gtl2基因多态性,并通过测序鉴定自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的杂合子。最后,利用RT-PCR-SSCP技术对gtl2基因在杂合子牛的6个组织中的表达状态进行分析,并通过测序对表达结果进行验证。研究结果表明:gtl2基因在自然繁殖牛被检测的6个组织中均表现为单等位基因表达,在体细胞核移植牛的心和肝中也表现为单等位基因表达,而在体细胞核移植牛的大脑、脾、肺、肾4个组织中表现出双等位基因表达。由此可以得出:gtl2基因表达紊乱有可能是造成体细胞核移植牛器官发育异常和新生死亡的原因之一。

关键词：牛 gtl2 基因组印记体细胞核移植

长非编码RNA gtl2在小鼠早期胚胎中调控转录因子Oct4的分子机制

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长非编码RNA Gtl2在小鼠早期胚胎中调控转录因子Oct4的分子机制

作者：张喜美佳哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

gtl2基因位于小鼠12号染色体末端的Dlk1-Dio3印记区间,其转录的长非编码RNA gtl2对胚胎发育和肿瘤发生都具有重要功能。本实验室前期对小鼠早期胚胎的研究发现,gtl2于桑葚胚期开始表达,并最终特异性定位于囊胚内细胞团(ICM)。功能研究表... 详细信息

gtl2基因位于小鼠12号染色体末端的Dlk1-Dio3印记区间,其转录的长非编码RNA gtl2对胚胎发育和肿瘤发生都具有重要功能。本实验室前期对小鼠早期胚胎的研究发现,gtl2于桑葚胚期开始表达,并最终特异性定位于囊胚内细胞团(ICM)。功能研究表明,干扰gtl2的表达虽然不影响囊胚发育率,但会影响囊胚的孵化(hatching)、体外生长(outgrowth)和内细胞团(ICM)的形成。进一步研究发现,gtl2的表达下调导致囊胚ICM特异性转录因子Oct4的表达下降,提示gtl2很可能通过影响Oct4而发挥作用。前期实验已经证实,gtl2可能作为ceRNA(competing endogenous RNA)通过miRNA途径调控Oct4的表达,从而在早期胚胎中发挥作用。因此,本课题旨在筛选可能与gtl2结合并调控Oct4的候选miRNA,并揭示gtl2在小鼠早期胚胎中调控Oct4可能的分子机制。首先,利用生物信息学网站工具并结合已发表的论文,我们筛选出既能与gtl2有潜在结合能力又被实验证实可以下调Oct4的候选miRNAs:let-7c(2个结合位点)、miR-24、miR-29a、miR-31和miR-135b。进而通过双荧光素酶报告系统证实,let-7c的两个结合位点都与gtl2具有显著的结合能力,而miR-24、miR-29a和miR-135b也能与gtl2发生结合,只有miR-31未检测到与gtl2的结合。因此,我们将let-7c、miR-24、miR-29a、和miR-135b作为候选miRNA进行下一步研究。在细胞水平,我们利用gtl2高表达的MLTC-1细胞(小鼠睾丸间质细胞瘤细胞)验证候选miRNAs与内源gtl2的相互作用,结果表明只有let-7c与内源gtl2存在明显的结合。我们又利用另一种表达gtl2的N2a细胞(小鼠神经母细胞瘤细胞),进一步证实let-7c与内源性gtl2存在相互作用。因此,我们将let-7c作为最终候选miRNA,在胚胎水平进行进一步验证。在胚胎水平,我们通过挽救实验(rescue)证实,gtl2能够挽救let-7c过表达所导致的囊胚体外生长过程中的ICM缺失,提高Oct4的表达水平,从而恢复胚胎的发育能力。说明gtl2可以在早期胚胎内与let-7c发生相互作用,通过let-7c影响Oct4的表达,进而在早期胚胎中调控ICM的形成。综上所述,本课题筛选得到了与gtl2结合并调控Oct4表达的候选miRNAs,并在细胞水平证实let-7c与内源gtl2具有结合能力,进而在胚胎水平初步阐明了let-7c介导gtl2调控Oct4的分子机制。此论文的研究成果,为深入理解gtl2对早期胚胎发育及ICM的形成和分化机制奠定基础,为胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)等相关研究提供理论依据和参考。

关键词：长非编码RNA gtl2 早期胚胎发育 let-7c

长非编码RNA gtl2在小鼠胚胎发育早期的表达调控及功能研究

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长非编码RNA Gtl2在小鼠胚胎发育早期的表达调控及功能研究

作者：余长威哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

长非编码RNA（lncRNA）是一类不编码蛋白的RNA分子，广泛参与多种重要的生物学过程。最近的研究表明，Dlk1-Dio3印记基因簇内非编码RNA（ncRNAs）的活化程度与诱导多能干细胞（iPSCs）的发育潜能呈正相关。实验室前期研究显示此区间lncR... 详细信息

长非编码RNA（lncRNA）是一类不编码蛋白的RNA分子，广泛参与多种重要的生物学过程。最近的研究表明，Dlk1-Dio3印记基因簇内非编码RNA（ncRNAs）的活化程度与诱导多能干细胞（iPSCs）的发育潜能呈正相关。实验室前期研究显示此区间lncRNA gtl2的表达起始于8细胞时期，同时该区间内重要差异甲基化区IG-DMR和gtl2-DMR的甲基化模式在早期胚胎各阶段并未发生变化，推测DNA甲基化不是gtl2表达调控的主要因素。本研究以小鼠Dlk1-Dio3印记区间内最重要的lncRNA gtl2为研究对象，进一步揭示其在早期胚胎中的表达模式和调控机制，进而对其在早期胚胎中的功能展开研究。本课题首先明确gtl2在早期胚胎中的动态表达变化及亚细胞定位。通过RNA FISH对其在桑椹胚、早期囊胚和囊胚中的定位研究显示，gtl2在桑椹胚期均匀分布，随着向囊胚的发育，其表达逐渐向内细胞团（ICM）细胞聚集;而到囊胚时期，其表达几乎完全集中于ICM细胞，滋养层细胞（TE）细胞中几乎检测不到表达信号。在这一发育过程中gtl2始终主要在细胞质中表达。印记分析显示，gtl2在初始表达的桑椹胚时期即为父本印记母本表达。由于Dlk1-Dio3印记簇印记控制区的DNA甲基化模式无法解释gtl2的表达调控，本研究检测了gtl2表达前后重要位点组蛋白修饰的情况。利用微量样品染色质免疫共沉淀(μChIP)方法，对IG-DMR区和gtl2启动子区的组蛋白修饰检测发现，在gtl2不表达的8-细胞期，这两个区域都存在明显的抑制性组蛋白修饰H3K9me3，而激活性组蛋白修饰H3K4me3较弱;随着胚胎逐步发育到桑椹胚和囊胚期，这两区域的激活性组蛋白修饰H3K4me3显著增强，而抑制性组蛋白修饰H3K9me3显著减弱。结果提示gtl2在早期胚胎中表达的启动可能受到激活性组蛋白修饰H3K4me3和抑制性组蛋白修饰H3K9me3的协同调控。本研究进一步构建了靶向Oct4、Sox2和Nanog慢病毒RNA干扰载体，通过透明带下注射法在早期胚胎发育过程中分别干扰了Oct4、Sox2和Nanog的表达，结果发现Oct4、Sox2和Nanog干扰后gtl2的表达也相应发生了下调，表明干细胞多能性因子Oct4、Sox2和Nanog对gtl2表达的调控具有调控作用。鉴于gtl2在胚胎早期发育过程中独特的时空表达模式，本研究对其在早期胚胎中的功能进行了初步探索。通过构建gtl2的慢病毒RNA干扰载体结合透明带下注射法在早期胚胎中干扰gtl2的表达，结果发现gtl2干扰后虽然不影响囊胚的发育率，但却显著影响囊胚后期的发育能力。定量RT-PCR检测发现，gtl2干扰后同簇基因、干细胞多能性因子和分化标志蛋白的表达都出现了不同程度的下调，提示gtl2在早期胚胎发育过程中参与了广泛的基因表达调控。综上所述，lncRNA gtl2在早期胚胎发育过程中具有独特的动态表达模式和亚细胞定位，其表达受到组蛋白修饰的调控和干细胞多能性因子的调控。同时其在早期胚胎中的表达对于胚胎的发育具有潜在的重要作用，这些结果为进一步研究Dlk1-Dio3印记基因簇内lncRNAs在早期胚胎发育中的调控机制和功能奠定了基础。

关键词：长非编码RNA 着床前胚胎发育 gtl2 μChIP 透明带下注射

DLK1/gtl2印记基因甲基化状态及DLK1蛋白的表达与肿瘤

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现代泌尿外科杂志 2013年第4期18卷 412-413页

作者：李健叶定伟复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科复旦大学上海医学院肿瘤学系上海200032

DLK1/gtl2是一对重要的连锁印记基因,位于14q32。gtl2基因是一个母源性印记基因,其转录产物为非编码RNA。DLK1基因属父源性印迹基因。编码蛋白质DLK1,其表达程度的变化与某些肿瘤有关。作者从DLK1/gtl2甲基化状态的变化和DLK1蛋白的表... 详细信息

DLK1/gtl2是一对重要的连锁印记基因,位于14q32。gtl2基因是一个母源性印记基因,其转录产物为非编码RNA。DLK1基因属父源性印迹基因。编码蛋白质DLK1,其表达程度的变化与某些肿瘤有关。作者从DLK1/gtl2甲基化状态的变化和DLK1蛋白的表达两个方面与肿瘤的关系做一综述。

关键词： DLK1 gtl2 甲基化DLK1蛋白肿瘤