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NaHS通过降低NLRP3/Caspase-1/gsdmd治疗脑卒中的机制研究

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NaHS通过降低NLRP3/Caspase-1/GSDMD治疗脑卒中的机制研究

作者：鲁明新乡医学院

学位级别：硕士

背景缺血性脑卒中死亡率高、致残率高,溶栓治疗之后再灌注损伤持续进展以及缺血部位损伤修复困难,严重影响脑卒中患者的生存质量,探索卒中后神经细胞炎症及细胞死亡的发生发展机制,仍然是研究治疗脑卒中新药的主要方向。脑缺血后损伤区... 详细信息

背景缺血性脑卒中死亡率高、致残率高,溶栓治疗之后再灌注损伤持续进展以及缺血部位损伤修复困难,严重影响脑卒中患者的生存质量,探索卒中后神经细胞炎症及细胞死亡的发生发展机制,仍然是研究治疗脑卒中新药的主要方向。脑缺血后损伤区域释放的炎性介质助推了细胞的炎症、水肿、凋亡、焦亡和坏死。其中焦亡是一种依赖炎症性Caspase1、4、11活化完成Gasdermin D(gsdmd)的N末端剪切形成孔隙最后释放促炎因子IL-1β、IL-18的细胞死亡方式。其中gsdmd蛋白的发现,将人们对焦亡的认识引领到一个新的高度,依赖Gasdermin蛋白也作为焦亡过程中必需的分子特征。缺血再灌注后神经细胞焦亡与神经系统炎症密切相关,攻克卒中后神经细胞炎症与焦亡发生的机制以及找到能够干预此过程的药物将成为脑卒中研究新方向。硫化氢(HS)的高脂溶性、快速透过细胞膜特性使它能在数秒内产生神经调节作用。HS在各种动物疾病模型的作用得到越来越多研究者的探索,其常用的供体化合物硫氢化钠(NaHS)对于神经系统疾病引起的炎症和神经细胞损伤有重要保护作用,相关领域研究人员也不断认识到NaHS的生理学和病理学作用。NaHS的在神经系统疾病中的研发近几年不断有新突破,在脑卒中疾病中,NaHS能够明显改善脑缺血再灌注大鼠病理进程,使脑梗死体积明显缩小,改善卒中后动物的预后状态,缓解脑水肿。能减少大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤血清脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、降低乳酸脱氢酶(LDH)的活性。大鼠脑缺血后暴露于HS气体(19.5%O中80 ppm HS)2天,梗死面积减小50%。但是NaHS保护脑卒中的机制尚不清楚,本实验旨在探索硫氢化钠降低卒中后脑梗阻面积的机制。目的1.探索大鼠脑缺血再灌注以后损伤侧皮质区小胶质细胞活化情况以及神经元的存活率,硫氢化钠(NaHS)是否能够通过抑制小胶质细胞活化增加神经元的存活率改善脑卒中。2.探索大鼠脑缺血再灌注以后损伤侧皮质区是否发生炎症和细胞焦亡,焦亡主要发生在哪一类神经细胞,硫氢化钠(NaHS)是否能够抑制脑缺血再灌注以后损伤侧皮质细胞的焦亡从而发挥脑保护作用。方法1.取280～350g SD雄性大鼠,建立SD大鼠大脑中动脉栓塞模型(线栓法),实验分四组,第一组分离大脑右侧中动脉进行假手术,不插线栓,15 min内腹腔注射氯化钠(Na Cl);第二组进行大脑右侧中动脉栓塞,插入线栓后15 min内腹腔注射Na Cl,缺血2 h再灌注24 h;第三组进行大脑右侧中动脉栓塞,插入线栓后15min内腹腔注射硫氢化钠(NaHS),缺血2 h再灌注24 h;第四组分离大脑右侧中动脉进行假手术,不插线栓,15 min内腹腔注射NaHS。2.各组动物造模后立即取脑进行TTC染色,检测各组大鼠脑梗死面积。3.各组动物造模后取损伤侧大脑皮质,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)分别检测皮质细胞内促炎因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)的含量,并采用免疫印迹分析法分别检测NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor 3,NLRP3)、胱冬肽酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase1,Caspase-1)、gsdmd蛋白(Gasdermin D,gsdmd)的表达量。4.各组动物造模后取脑做冰冻切片,采用免疫荧光法检测小胶质细胞的活化并定位损伤侧神经细胞焦亡的位置。结果1.与对照组相比,NaHS降低缺血再灌注大鼠损伤侧脑梗死面积。***降低皮层炎症因子IL-1β、IL-18的含量,同时降低皮层细胞NLRP3、Caspase-1、gsdmd相关焦亡蛋白表达量。3.大鼠缺血再灌注后皮层细胞焦亡主要发生在缺血区,且神经元焦亡数量高于小胶质细胞焦亡,小胶质细胞焦亡主要发生在缺血交界区。结论***能降低小胶质细胞活化提高神经元的存活率。***能降低NLRP3、Caspase-1、gsdmd的表达,减少神经细胞焦亡改善缺血再灌注损伤。

关键词：硫氢化钠焦亡 NOD样受体蛋白3 胱冬肽酶-1 gsdmd蛋白

gsdmd通过激活Caspase-9-Caspase-3信号通路参与脓毒症相关获得性衰弱的机制研究

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GSDMD通过激活Caspase-9-Caspase-3信号通路参与脓毒症相关获得性...

作者：王德琼西南交通大学

学位级别：硕士

背景：　　重症监护室获得性衰弱（ICU-acquired weakness, ICU-AW）是危重症患者（如严重脓毒症、严重烧伤、严重休克及多器官功能衰竭等）在疾病进程中出现的神经肌肉疾病，主要表现为肌萎缩和肌无力，常累及四肢肌和呼吸肌，患者可... 详细信息

背景：　　重症监护室获得性衰弱（ICU-acquired weakness, ICU-AW）是危重症患者（如严重脓毒症、严重烧伤、严重休克及多器官功能衰竭等）在疾病进程中出现的神经肌肉疾病，主要表现为肌萎缩和肌无力，常累及四肢肌和呼吸肌，患者可出现呼吸困难甚至呼吸衰竭而危及生命。脓毒症是人体在抵抗外界感染时免疫系统过度反应导致机体发生全身炎症反应的一种危及生命的状态。根据文献显示，每年有许多脓毒症病患，这种病患极有可能发生获得性肌萎缩及获得性肌无力，一旦发生获得性肌萎缩及获得性肌无力，患者的医疗成本将显著升高，生活质量将显著降低，死亡率将显著升高。尽管已经进行了很多研究，但我们仍未完全了解脓毒症引起的获得性衰弱的确切发病机制，因此，探究脓毒症相关获得性衰弱的发病机理可能具有深远的临床价值。　　目的：　　本研究针对当前脓毒症相关获得性衰弱发病率高而发病机制不明确的问题，通过构建实验动物模型，在体水平观察细胞焦亡和细胞凋亡在脓毒症相关获得性衰弱中的作用;通过脂多糖（ Lipopolysaccharides, LPS ）和腺嘌呤核苷三磷酸（ Adenosine triphosphate, ATP）刺激肌管建立脓毒症相关获得性衰弱体外模型，细胞水平研究细胞焦亡和细胞凋亡在脓毒症相关获得性衰弱中的分子机制，以期为脓毒症相关获得性衰弱的预防和治疗提供有意义的理论基础。　　方法：　　为了研究细胞焦亡和细胞凋亡在脓毒症相关获得性衰弱中的作用，我们构建了脓毒症相关获得性衰弱实验动物，并用免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）和Western blotting检测小鼠骨骼肌组织中肌萎缩蛋白肌肉萎缩盒F蛋白（muscle atrophy F-box, MAFbx, Atrogin-1)和肌肉环状指蛋白1（Muscle RING-finger protein, MuRF1）的表达，以检验脓毒症相关获得性衰弱的模型建立是否成功。Western blotting 检测小鼠骨骼肌组织中 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1/3/9（cysteinyl aspartate specific proteinase-1/3/9, Caspase-1/3/9）、GasderminD（gsdmd）的表达情况，以观察细胞焦亡和细胞凋亡在脓毒症相关获得性衰弱中的作用。　　为了探究细胞焦亡和细胞凋亡在脓毒症相关获得性衰弱中的分子机制及相互作用关系，我们在体外将成肌细胞诱导分化为肌管，通过光镜观察成肌细胞和肌管形态学表现，Western blotting检测肌管形成标志蛋白肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MHC）和成肌蛋白（myogenin）的表达，以鉴定肌管诱导是否成功。随后利用LPS和ATP刺激肌管建立脓毒症相关获得性衰弱体外模型，腺病毒转染敲减肌管中gsdmd的表达;碘化丙啶（Propidium iodide, PI）染色检测肌管损伤情况;TUNEL实验检测肌管凋亡情况;JC-1实验检测肌管线粒体损害情况;Western blotting检测各组肌管的肌萎缩蛋白Atrogin-1、MuRF-1 ，焦亡相关蛋白 Caspase-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-11 （cysteinyl aspartate specific proteinase-11, Caspase-11）、gsdmd，凋亡相关蛋白Caspase-9、Caspase-9裂解片段（Cleaved- Caspase-9）、Caspase-3 、Caspase-3裂解片段（Cleaved-Caspase-3）的表达水平;以观察细胞焦亡和细胞凋亡在脓毒症相关获得性衰弱中的分子机制及他们在脓毒症相关获得性衰弱中的相互作用关系。　　结果：　　1. 动物实验结果显示，与Control组比较，注射LPS 后小鼠生存状态显著变差;与Control组比较，注射LPS后小鼠骨骼肌组织中肌萎缩蛋白Atrogin-1、MuRF-1的表达显著升高，焦亡调控蛋白gsdmd、NLRP3、Caspase-1及凋亡调控蛋白Caspase-9、Caspase-3的表达显著升高。　　2. 细胞实验结果显示，成肌细胞诱导分化 5-7 天后，光镜下即可观察到细胞由多角形分化为管形肌管，同时肌管生成标志蛋白MHC、Myogenin表达显著升高。LPS和ATP刺激肌管后，肌管中肌萎缩蛋白Atrogin-1和MuRF-1的表达显著上调;PI摄取率显著升高;细胞焦亡相关蛋白Caspase-1、Caspase-11、gsdmd的表达显著上

关键词：脓毒症重症监护室获得性衰弱 gsdmd蛋白细胞焦亡细胞凋亡

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缺血再灌注损伤与细胞焦亡的相关性研究进展

昆明医科大学学报 2020年第12期41卷 142-147页

作者：王小莹刘作金申丽娟重庆医科大学附属第三医院麻醉科重庆401120 重庆医科大学附属第二医院肝胆外科重庆400010 昆明医科大学基础医学院病理学教研室云南昆明650500

缺血再灌注损伤是由病理因素或治疗方式所致的组织暂时缺血,恢复血流后引起组织损伤,能导致相关器官功能障碍。这种损伤与各器官中相关细胞中发生的炎性损伤密切相关。细胞焦亡是研究发现的形态学上与凋亡相似,伴随炎症反应发生的细胞... 详细信息

缺血再灌注损伤是由病理因素或治疗方式所致的组织暂时缺血,恢复血流后引起组织损伤,能导致相关器官功能障碍。这种损伤与各器官中相关细胞中发生的炎性损伤密切相关。细胞焦亡是研究发现的形态学上与凋亡相似,伴随炎症反应发生的细胞程序性死亡。近年来多项研究证明缺血再灌注损伤的发病机制可能与细胞焦亡相关。细胞焦亡过程中各种炎症因子活化在此环节中起关键作用。结合文献就细胞焦亡与心、脑、肝脏、肾脏这几个重要脏器的缺血再灌注损伤间的关系作一综述。

关键词：细胞焦亡缺血再灌注损伤半胱天冬酶-1 半胱天冬酶-11 gsdmd蛋白白介素-1β 白介素-18

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细胞焦亡发生机制及其相关疾病的研究进展

山东医药 2018年第9期58卷 109-112页

作者：石明霞谢美玉郭顺利周素芳广西医科大学基础医学院南宁530021

细胞焦亡是一种由Gasdermin介导的程序性细胞坏死,表现为细胞肿胀、破裂,内容物释出并伴随强烈的炎症反应。病原体入侵时,机体通过一定途径促使炎症小体形成,进而激活依赖胱天蛋白酶1(Caspase-1)的经典细胞焦亡通路和/或依赖Caspase-4/5... 详细信息

细胞焦亡是一种由Gasdermin介导的程序性细胞坏死,表现为细胞肿胀、破裂,内容物释出并伴随强烈的炎症反应。病原体入侵时,机体通过一定途径促使炎症小体形成,进而激活依赖胱天蛋白酶1(Caspase-1)的经典细胞焦亡通路和/或依赖Caspase-4/5/11的非经典细胞焦亡通路。活化的Caspase-1/4/5/11将底物蛋白gsdmd切割为有成孔活性的N末端和有自抑作用的C末端,gsdmd-N通过成孔活性介导细胞焦亡。GSDME在Caspase-3的切割作用下能将TNF-α诱导的细胞凋亡转换为细胞焦亡,且能增加化疗药物的活性,但亦与不良反应密切相关。诸多疾病伴随有细胞焦亡现象的发生,如感染性疾病、痛风、免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病等。

关键词：细胞焦亡炎症小体 gsdmd蛋白 GSDME蛋白

Gasdermin D蛋白在稽留流产患者绒毛组织中的表达及其意义

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广西医科大学学报 2020年第3期37卷 459-463页

作者：秦志平李慕军曾雅畅广西医科大学第一附属医院生殖医学中心南宁530021

目的:研究Gasdermin D(gsdmd)蛋白、NOD样受体家族蛋白3(NOD-like receptor protein 3、NLRP3)炎症小体、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、白介素-1β(IL-1β)在稽留流产患者及正常早孕妇女绒毛组织中的定位、表达差异及临床意义。方法:选... 详细信息

目的:研究Gasdermin D(gsdmd)蛋白、NOD样受体家族蛋白3(NOD-like receptor protein 3、NLRP3)炎症小体、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、白介素-1β(IL-1β)在稽留流产患者及正常早孕妇女绒毛组织中的定位、表达差异及临床意义。方法:选取2019年4-9月在广西壮族自治区平果县人民医院和平果县妇幼保健院住院诊断为稽留流产患者25例为研究组,以同期正常早孕要求终止妊娠的妇女25例为对照组,采用苏木精-伊红(HE)染色观察绒毛组织形态结构;采用免疫组织化学法比较两组绒毛组织标本中gsdmd、NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达并用ImagePro Plus 6.0软件对其阳性表达量进行分析;分析gsdmd与NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达的相关性。结果:对照组绒毛形态规则,大小一致,滋养细胞结构完整;研究组绒毛形态改变,滋养层细胞结构破坏。两组绒毛滋养细胞的细胞质中均有gsdmd、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达,其在研究组中的表达均明显高于对照组(Pgsdmd与NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达呈正相关关系(r=0.875,r=0.603,r=0.635,Pgsdmd在稽留流产患者绒毛中的表达升高,可能与稽留流产的发病相关。

关键词： gsdmd蛋白稽留流产绒毛