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转录因子grhl3促进皮肤鳞癌细胞迁移和侵袭

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安徽医科大学学报 2019年第2期54卷 236-241页

作者：邓庆梅周利利郭思佳陈津津郭立钰曾凡军周海胜安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室合肥230032 中国科学院合肥肿瘤医院检验科合肥230031 皮肤病学国家重点实验室培养基地合肥230032

目的研究转录因子果蝇头状因子3(grhl3)对皮肤鳞癌(SCC)细胞系A431细胞迁移和侵袭的影响。方法利用免疫组织化学检测皮肤癌组织grhl3表达,分析皮肤鳞状细胞癌中grhl3表达水平与临床病理分期的关系;利用脂质体介导grhl3过表达载体转染A43... 详细信息

目的研究转录因子果蝇头状因子3(grhl3)对皮肤鳞癌(SCC)细胞系A431细胞迁移和侵袭的影响。方法利用免疫组织化学检测皮肤癌组织grhl3表达,分析皮肤鳞状细胞癌中grhl3表达水平与临床病理分期的关系;利用脂质体介导grhl3过表达载体转染A431细胞,建立过量表达grhl3的A431细胞系;通过Transwell检测grhl3对A431细胞迁移和侵袭能力的影响;利用表达谱芯片技术分析过量表达grhl3对A431细胞迁移、侵袭等相关基因表达变化;采用染色质免疫共沉淀-测序(ChI P-seq)的方法分析grhl3调控的靶基因及grhl3的结合位点;比较基因表达谱芯片和染色质免疫共沉淀-测序的结果,以确定grhl3参与调控细胞迁移和侵袭相关的靶基因。结果免疫组化结果显示SCC组织及癌旁组织grhl3表达水平较正常皮肤组织明显增加,且与临床病理分期有关;Western blot结果证实grhl3在A431细胞过量表达,由此成功建立稳定过量表达grhl3的A431细胞株;Transwell侵袭和迁移试验显示grhl3过量表达增强了A431细胞迁移和侵袭能力;表达谱芯片结果显示有128个基因与细胞运动和黏附相关;ChI Pseq结果显示grhl3结合基因组DNA的主要位置是在基因间区(55. 65%),而只有2. 49%分布于结构基因的启动子区域;表达谱芯片显示差异表达的128个基因和ChI P-seq显示的grhl3调控149个候选基因,均与细胞迁移和侵袭有关,其中有26个基因具有一致性。提示grhl3通过调控26个候选基因促进皮肤鳞癌细胞的迁移和侵袭。结论 grhl3通过调控皮肤鳞癌细胞的与迁移和侵袭相关基因表达,促进细胞迁移和侵袭,有助于后续研究grhl3调控肿瘤细胞迁移和侵袭的分子机制。

关键词：皮肤鳞癌 grhl3 A431 迁移侵袭

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胃癌组织中grhl3的表达及其临床意义

临床与实验病理学杂志 2018年第10期34卷 1068-1071页

作者：许易诚郭立钰蔡文文涂珍珍周海胜熊茂明安徽医科大学第一附属医院普外科合肥230022 安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室合肥230032

目的探讨grhl3在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化En Vision两步法检测100例胃癌组织及40例癌旁组织中grhl3蛋白的表达,分析其与胃癌临床病理特征及预后的关系。结果 GHRL3在胃癌组织中的高表达率为64. 0%(64/100),在癌... 详细信息

目的探讨grhl3在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化En Vision两步法检测100例胃癌组织及40例癌旁组织中grhl3蛋白的表达,分析其与胃癌临床病理特征及预后的关系。结果 GHRL3在胃癌组织中的高表达率为64. 0%(64/100),在癌旁组织中高表达率为25. 0%(10/40); grhl3蛋白阳性与患者性别(χ~2=0. 794,P=0. 373)、年龄(χ~2=1. 500,P=0. 211)、肿瘤位置(χ~2=0. 568,P=0. 451)、肿瘤大小(χ~2=1. 145,P=0. 285)、分化程度(χ~2=1. 382,P=0. 240)均无关;与肿瘤临床TNM分期(χ~2=7. 545,P=0. 006)显著相关。grhl3表达水平与胃癌患者预后有相关性。结论 GHRL3在胃癌中的高表达率高于癌旁组织,grhl3的表达与临床分期有相关性,且grhl3高表达影响患者预后,检测胃癌组织中grhl3基因的表达水平有助于分辨肿瘤的恶性程度,并对患者术后治疗和预后分析有一定的指导意义。

关键词：胃肿瘤 grhl3 免疫组织化学预后

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grhl3在胃癌组织中的表达及临床意义

GRHL3在胃癌组织中的表达及临床意义

作者：许易诚安徽医科大学

学位级别：硕士

目的研究探讨果蝇头状因子3（grhl3）在胃癌组织中的异常表达,以及grhl3与胃癌患者的临床病理特征的关联以及与患者预后的联系。方法收集安徽医科大学第一附属医院胃肠外科近五年行胃癌根治术且经病理科证实为胃癌的组织蜡块,包括100例... 详细信息

目的研究探讨果蝇头状因子3（grhl3）在胃癌组织中的异常表达,以及grhl3与胃癌患者的临床病理特征的关联以及与患者预后的联系。方法收集安徽医科大学第一附属医院胃肠外科近五年行胃癌根治术且经病理科证实为胃癌的组织蜡块,包括100例胃癌组织及40例癌旁组织进行免疫组织化学实验,检测其中grhl3蛋白表达水平,并运用统计学方法分析其与胃癌患者临床病理特征以及预后之间的关系。结果:GHRL3在胃癌组织中的高表达率为64.0%（64/100）,在癌旁组织中高表达的比率为25.0%（10/40）;通过随访患者的临床资料发现,grhl3蛋白阳性表达与患者性别（X=0.794,P=0.373）、年龄（X=1.500,P=0.211）、肿瘤位置（X=0.568,P=0.451）,肿瘤大小（X=1.145,P=0.285）、分化程度（X=1.382,P=0.240）无关,而与肿瘤临床TNM分期（X=7.545,P=0.006）显著相关。grhl3的表达水平与胃癌患者预后有相关关系。结论:GHRL3在胃癌中的高表达比例高于癌旁组织,grhl3的表达与临床分期存在相关关系,并且grhl3的高表达影响患者预后,检测胃癌组织中的grhl3基因的表达水平有助于分辨肿瘤的恶性程度,并对患者术后治疗和预后分析有指导意义。

关键词：胃癌 grhl3 免疫组织化学

grhl3在食管癌组织中的表达及其对食管癌细胞恶性行为的影响

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GRHL3在食管癌组织中的表达及其对食管癌细胞恶性行为的影响

作者：韩晓楠河北医科大学

学位级别：硕士

第一部分grhl3和c-MYC在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义目的:研究食管鳞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)患者鳞癌组织及癌旁组织中转录因子grhl3(Grainyhead-like 3,grhl3)和c-MYC的表达情况,并在基因水平和蛋白水平分析GR... 详细信息

第一部分grhl3和c-MYC在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义目的:研究食管鳞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)患者鳞癌组织及癌旁组织中转录因子grhl3(Grainyhead-like 3,grhl3)和c-MYC的表达情况,并在基因水平和蛋白水平分析grhl3和c-MYC表达水平之间的关系,分析grhl3和c-MYC与ESCC患者临床病理特征的关系。方法:1收集2015年6月至2016年9月在河北医科大学第四医院胸外科行肿瘤切除并经病理证实的64例ESCC患者的ESCC组织和癌旁组织,将每例标本分为2份,按下述两种方法处理:(1)置于液氮中,然后置于-80℃超低温冰箱中贮存以备提取RNA;(2)以4%甲醛溶液固定以备制作组织蜡块,用于免疫组化染色。2采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantificational real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)方法检测ESCC组织、癌旁组织中grhl3和c-MYC m RNA的表达水平,在基因水平分析其相关性。3应用免疫组化方法检测ESCC组织、癌旁组织中grhl3和c-MYC蛋白表达水平,并在蛋白水平分析其相关性。4分析ESCC组织内grhl3和c-MYC蛋白表达水平与患者临床特征关系。结果:1 ESCC组织中grhl3 m RNA的表达水平显著高于癌旁组织[(2.85±2.83)vs.(2.06±2.02),P3±5.11 vs.2.03±2.00,Pgrhl3与c-MYC m RNA的表达水平呈显著正相关关系(Pgrhl3蛋白阳性表达水平均显著升高(81.30%vs.25.00%,P30%,Pgrhl3蛋白表达和c-MYC蛋白表达呈显著正相关关系(Pgrhl3和c-MYC表达在基因水平和蛋白水平上是一致的。3 ESCC组织中grhl3蛋白表达情况与肿瘤分化程度、侵犯深度、淋巴结转移、临床分期相关(P37;P=0.022;P=0.003),与患者性别、年龄无关(P=0.604;P=0.904);ESCC组织中c-MYC蛋白表达水平与肿瘤分化程度、侵犯深度、淋巴结转移、临床分期相关(P=0.019;P=0.023;P=0.005;P=0.001),与患者性别、年龄无关(P=0.403;P=0.747)。第二部分grhl3对食管癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制研究目的:研究grhl3对食管鳞癌细胞恶性生物学行为的影响,并探讨相关机制。方法:1应用q RT-PCR方法检测grhl3在TE13、TE1、KYSE30、Eca109和KYSE170五种食管鳞状细胞癌细胞株中的表达情况,筛选出grhl3高表达的食管鳞癌细胞KYSE30。应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)方法敲低grhl3 m RNA的表达,分为干扰组(si-grhl3组),阴性对照组(NC-grhl3组)及空白对照组(Con组),经q RT-PCR和Western blot方法分别检测3组细胞grhl3在基因和蛋白水平的表达情况。2应用MTS法、细胞克隆形成实验、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测敲低grhl3后KYSE30细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力的变化。3应用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测敲低grhl3后对KYSE30细胞细胞周期及凋亡的影响。4应用免疫印迹法(Western blot)检测敲低grhl3后对KYSE30细胞迁移相关蛋白表达水平的影响。结果:1检测TE13、TE1、KYSE30、Eca109和KYSE170五种人食管鳞癌细胞株grhl3 m RNA的表达水平,筛选出grhl3表达水平最高的KYSE30细胞,用于后续实验。与NC-grhl3组和Con组相比,si-grhl3组KYSE30细胞中grhl3基因和蛋白表达水平显著降低(Pgrhl3在KYSE30细胞中的表达。2细胞克隆形成实验、MTS法检测结果显示,敲低grhl3能够抑制食管癌KYSE30细胞的克隆形成能力[(59.28士3.64)vs.(87.33士1.90)vs.(88.87士0.36),P3)、(1.37士0.25)vs.(1.10士0.01)、(1.89士0.

关键词：食管鳞癌 grhl3 c-MYC 上皮-间质转化迁移侵袭

grhl3调控E-cadherin表达及其对上皮来源肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

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Grhl3调控E-cadherin表达及其对上皮来源肿瘤细胞迁移和侵袭能力...

作者：赵盼安徽医科大学

学位级别：硕士

背景和目的Grainyhead家族成员在伤口愈合、表皮形成及胚胎神经管闭合等过程中发挥重要作用。grhl3是一种转录因子,为Grainyhead家族成员之一,调控多种皮肤分化相关基因的表达,包括多种结构蛋白、酶和细胞间粘附分子等,从而在表皮分化... 详细信息

背景和目的Grainyhead家族成员在伤口愈合、表皮形成及胚胎神经管闭合等过程中发挥重要作用。grhl3是一种转录因子,为Grainyhead家族成员之一,调控多种皮肤分化相关基因的表达,包括多种结构蛋白、酶和细胞间粘附分子等,从而在表皮分化和屏障形成过程中发挥作用。最近有研究表明,Grh13可通过激活人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(Phosphatase and Tensin Homolog, PTEN)的表达从而抑制鳞状细胞癌的发生。在早期胚胎发育过程中,grhl3参与睑裂愈合、神经管闭合等上皮细胞迁移。哺乳动物眼脸的发育融合遵循一个经典的逐步进行的过程：原始眼脸根部形成、基底层角质形成细胞片迁移、前缘角质形成细胞向中间延伸,最后导致睑裂愈合,grhl3-/-小鼠在上皮片层迁移方面存在障碍,眼脸无法闭合;在胚胎神经管闭合过程中,grhl3参与神经褶区域外胚层的上皮细胞变化,grhl3-/-小鼠容易神经管畸形,例如严重的脊柱裂和露脑畸形。同时,grhl3可促进伤口愈合过程中的表皮迁移,并在成人皮肤伤口前缘角质形成层细胞中过量表达。过去的研究证实,上皮细胞的运动和迁移在很大程度上受到细胞接触的抑制。E-cadherin作为细胞间黏附分子,调控细胞间接触。E-cadherin也参与肿瘤的迁移和侵袭,影响肿瘤的转移能力。在肿瘤的早期侵袭过程中,E-cadherin表达水平的降低或缺失会使肿瘤细胞的接触抑制减弱甚至失去接触抑制,使细胞获得较强的迁移和侵袭能力,而且随着肿瘤恶性程度的增加,由E-cadherin所介导的肿瘤细胞的黏附能力逐渐下降。在胚胎发育过程中,上皮细胞-间质细胞转分化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是促进上皮细胞迁移和转移的重要分子机制之一,而发生EMT的最重要标志性变化则是上皮细胞标记分子E-cadherin的表达下降。鉴于伤口愈合过程中发生的上皮间质转分化(EMT),与皮肤癌和乳腺癌获得侵袭性过程中发生的上皮间质转分化具有高度的相似性,而在生理条件下Grainyhead家族成员对E-cadherin的表达具有双重调控作用,即grhl3可以促进或者是抑制靶基因的表达,所以我们猜想：在上皮来源的肿瘤细胞发生迁移和侵袭过程中,grhl3可能通过抑制E-cadheirn表达而参与其调控作用。在本研究中,我们首先通过Western blotting检测人上皮性细胞中grhl3与E-cadherin的表达,分析两者的关系,并通过对grhl3的体外异位表达研究其对E-cadherin表达以及癌细胞迁移和侵袭能力的影响,并对grhl3调控E-cadherin表达的分子机制进行初步研究,从而为肿瘤治疗寻找新的靶点。方法通过Western blotting在蛋白质水平检测高侵袭的乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞及低侵袭的皮肤鳞癌细胞系A431细胞、乳腺癌细胞系MCF7细胞和人永生化角质层细胞系HaCat细胞中grhl3与E-cadherin的表达水平,分析grhl3和E-cadherin表达的相关性。为了验证异位表达grhl3是否影响E-cadherin的表达,将人grhl3的cDNA克隆到带有FLAG标签的pCMV-Tag 2B表达载体中构建重组载体,将测序验证正确的重组载体(pCMV-2B-grhl3)转染到A431细胞和MCF7细胞中,用G418进行筛选从而构建稳定表达grhl3的细胞系(A431-grhl3、 MCF7-grhl3).通过Western blotting和免疫荧光实验检测细胞中grhl3和E-cadherin的表达水平。同时,根据grhl3 mRNA的序列设计了4个shRNA序列,并克隆到GV287载体中构建干涉载体,将测序验证正确的重组载体(GV287-grhl3-shRNA)瞬时转染到293T细胞中,经过Western blot验证grhl3表达水平以优化有效干涉序列。选择具有有效干涉序列的重组载体,转染到MDA-MB-231细胞中,用Puromycin进行筛选从而构建稳定干涉grhl3的MDA-MB-231细胞系(MDA-MB-231-grhl3-shRNA);同时,对稳定干涉的细胞株,设置补救实验：瞬时转染pCMV-2B-grhl3到细胞中,转染24h收集蛋白,Western blotting检测细胞中grhl3和E-cadherin的表达水平;为研究grhl3对肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的影响,利用划痕实验或Transwell迁移实验检测过量表达grhl3的A431细胞和MCF7细胞或稳定干涉grhl3的MDA-MB-231细胞迁移能力的变化;利用Transwell侵袭实验检测其侵袭能力的变化。为进一步探讨grhl3调控E-cadh

关键词： grhl3 迁移侵袭 E-cadherin 皮肤癌乳腺癌

grhl3调控SNX16表达及其对上皮来源肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

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GRHL3调控SNX16表达及其对上皮来源肿瘤细胞迁移和侵袭能力的影响

作者：周利利安徽医科大学

学位级别：硕士

背景和目的Grainyhead-like 3(grhl3)是Grainyhead-like(grhl)家族的成员之一,grhl基因家族有三个成员,与果蝇的grainy head基因家族同源。grhl基因家族在个体发育和表皮屏障形成中是不可缺少的。grhl3作为转录因子,表达在分化后的上基... 详细信息

背景和目的Grainyhead-like 3(grhl3)是Grainyhead-like(grhl)家族的成员之一,grhl基因家族有三个成员,与果蝇的grainy head基因家族同源。grhl基因家族在个体发育和表皮屏障形成中是不可缺少的。grhl3作为转录因子,表达在分化后的上基底层,能调控表皮分化过程中的多个基因,从而对表皮分化及屏障形成产生影响。有研究表明,grhl3通过激活同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)抑制鳞状细胞癌,同时grhl3在发育早期的表皮迁移过程中发挥重要作用。SNXs是一个大的蛋白家族,参与细胞内吞、细胞内的蛋白转运及细胞信号转导等过程。人的snx16野生型基因编码的SNX16蛋白由344个氨基酸残基组成,含有两个结构域,PX结构域(吞噬细胞氧化酶同源域)和colied-coil结构域。PX结构域能与磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI-3P)结合,使SNX16靶向的与胞内体结合。colied-coil结构域介导SNX16在溶酶体的定位,缺乏colied-coil结构域的SNX16不能定位到溶酶体。PI-3P主要存在于胞内体膜上。PI-3P的合成由PI-3P激酶催化。SNX16分布于粘着斑(细胞与胞外基质连接部位)附近的膜泡上,这些膜泡是Rab5阳性的。SNX16在粘着斑附近的分布依赖于活化的SNX23(驱动蛋白家族成员)、微管及PI-3P激酶。SNX16膜泡除了存在于胞质核周区以外,还存在于细胞质膜处。SNX16分布于多种肿瘤细胞,如MCF-7细胞、Hela细胞、Hep G2细胞、Bel7402细胞及NCI-H460细胞等。在小鼠的脑和肌肉细胞中也检测的SNX16的表达。在MCF-7细胞中使用si RNA敲低SNX23,破坏了SNX16在细胞膜的分布,同样使用秋水仙素处理MCF-7细胞也破坏了SNX16细胞质膜定位。使用细胞松弛素B对SNX16没有影响。在MCF7细胞中过量表达SNX16抑制细胞的迁移,反之,当敲低SNX16时,MCF7细胞的迁移能力增加;而过量表达或敲低SNX16,对细胞的增殖能力没有影响。SNX16转染的MCF7细胞注射裸鼠,肿瘤形成活性明显降低。由此可见,SNX16在细胞迁移及肿瘤形成过程中具有重要的作用。但其调控表达的分子机制尚不清楚。我们前期研究转录因子grhl3对肿瘤细胞生物学行为时发现:过量表达grhl3的肿瘤细胞迁移和侵袭能力明显增加;已证实这种生物学行为的改变与grhl3调控的靶基因E-cadherin表达减少有关。同时对稳定干涉grhl3的A431细胞进行基因表达谱分析发现,grhl3稳定干涉后SNX16表达水平明显增加(较对照组增加4.5倍)。本研究为探讨grhl3是否参与调控SNX16表达而改变肿瘤细胞的迁移和侵袭能力有关。方法将人grhl3的c DNA克隆到带有FLAG标签的p CMV-2B表达载体中构建重组载体,将测序验证正确的重组载体(p CMV-2B-FLAG-grhl3)转染到A431细胞和MCF7细胞中,用G418进行筛选从而构建稳定表达grhl3的细胞系(A431-grhl3、MCF7-grhl3)。利用抗Flag抗体进行Ch IP,以捕获grhl3特异性结合的DNA,并对这些DNA进行高通量测序。将Ch IP-seq所获得snx16基因所在染色体Chr8的数据输入UCSC数据库,观察到grhl3在snx16基因启动子区域的结合峰。为了探讨grhl3抑制SNX16表达的分子机制,利用生物信息学方法,分析了人的snx16基因启动子序列,发现snx16基因启动子区域存在2个潜在的grhl3特异性结合位点(site1-2);我们克隆snx16启动子进行双荧光素酶实验,grhl3降低了荧光强度,提示grhl3抑制snx16启动子的活性;分别突变SNX16启动子上的结合位点,结果发现同时突变近端启动子上site1和site2时,grhl3对其无明显抑制作用。Western blot结果显示:与低侵袭能力细胞系A431和MCF7相比,在高侵袭性的MDA-MB-231中grhl3表达明显增高,而而SNX16的表达水平明显降低。过量表达grhl3后,A431和MCF7中SNX16表达减少。因此,grhl3可能参与调控SNX16的表达,并具有明显的负调控作用。细胞迁移和侵袭实验结果证实:在低侵袭性的A431细胞和MCF7细胞中过表达grhl3后,细胞的迁移能力和侵袭能力明显提高。结果将人grhl3的c DNA克隆到带有FLAG标签的p CMV-2B表达载体中构建重组载体,将测序验证正确的重组载体(p CMV-2B-FLAG-grhl3)转染到A431细胞和MCF7细胞中,用G418进行筛选从而构建稳定表达grhl3的细胞系(A431-grhl3、MCF7-grhl3)。

关键词： grhl3 迁移侵袭 SNX16 皮肤癌乳腺癌

结直肠癌中grhl3、E-cadherin和Ki-67的表达及临床意义

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临床与实验病理学杂志 2021年第1期37卷 71-74页

作者：谭林陈维顺周红兵王骞艾琼嘉屈伟明中南大学湘雅医学院附属株洲医院消化内科株洲412007

目的探讨粒状头样3(Grainyhead-like 3,grhl3)与E-cadherin和Ki-67在结直肠癌中的表达及临床意义。方法采用免疫组化SP法检测100例结直肠癌组织及30例癌旁正常组织中grhl3、E-cadherin和Ki-67的表达,分析三者表达的相关性及与临床病理... 详细信息

目的探讨粒状头样3(Grainyhead-like 3,grhl3)与E-cadherin和Ki-67在结直肠癌中的表达及临床意义。方法采用免疫组化SP法检测100例结直肠癌组织及30例癌旁正常组织中grhl3、E-cadherin和Ki-67的表达,分析三者表达的相关性及与临床病理特征、预后的关系。结果结直肠癌组织中grhl3和Ki-67阳性率(64.0%和60.0%)高于癌旁正常组织(30.0%和6.7%),E-cadherin阳性率(55.0%)低于癌旁正常组织(99.7%),差异均有统计学意义(Pgrhl3和Ki-67的表达与肿瘤大小密切相关,grhl3和E-cadherin的表达与TNM分期、浸润深度及淋巴结转移密切相关,差异均有统计学意义(Pgrhl3与E-cadherin的表达呈负相关(χ^(2)=6.674,P=0.010,rs=-0.260),与Ki-67的表达呈正相关(χ^(2)=7.799,P=0.005,rs=0.281)。grhl3和Ki-67阳性患者5年生存率低于阴性患者(Pgrhl3阳性及E-cadherin阴性是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素(Pgrhl3在结直肠癌中高表达,且可能与E-cadherin和Ki-67之间存在一定相互作用,三者共同参与结直肠癌的发生发展和侵袭转移过程。

关键词：结直肠肿瘤 grhl3 E-cadherin Ki-67 免疫组织化学

转录因子grhl3在人喉癌的生物学行为及临床意义的研究

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转录因子GRHL3在人喉癌的生物学行为及临床意义的研究

作者：柳杨凡郑州大学

学位级别：硕士

目的喉鳞状细胞癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤,在咽喉头颈部肿瘤的诊疗中占据非常重要的地位,随着环境的污染加重和人们生活习惯的改变,近几年发病呈上升趋势。其以恶性程度高,发病症状不明显,早期易发生颈部淋巴结转移,复发率高,术后严... 详细信息

目的喉鳞状细胞癌是耳鼻喉科常见的恶性肿瘤,在咽喉头颈部肿瘤的诊疗中占据非常重要的地位,随着环境的污染加重和人们生活习惯的改变,近几年发病呈上升趋势。其以恶性程度高,发病症状不明显,早期易发生颈部淋巴结转移,复发率高,术后严重影响患者生活质量为特征一直是临床医生面临的挑战。在基因生物分子方面寻找喉癌的潜在诊疗靶点是近几年的研究热点,grhl3作为转录因子在多种癌症和正常人体组织发育中扮演重要角色,而且目前在喉癌领域研究并不多。本文旨在采取对喉癌术后组织蜡块采取免疫组化染色,人喉癌细胞系采用RT-qPCR,western blot,细胞转染技术以及功能实验探讨grhl3在喉癌中的表达及其生物学行为,以期为喉癌grhl3的研究提供一定的思路和基础。方法通过对喉癌患者术后病理蜡块及癌旁正常组织进行常规病理检查及免疫组化染色,人喉癌细胞系采用RT-qPCR,western blot,探讨grhl3在喉癌组织及喉癌细胞中的表达情况。同时采用细胞转染技术,transwell实验和CCK-8实验证实沉默grhl3的表达可降低喉癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力,以及可影响肿瘤细胞形成上皮-间质化转变EMT(epithelia-mesencheymal transition)相关基因的表达,并且探讨其是否与激活调控Wnt/β-catenin信号通路相关。结果1.40例喉鳞癌患者术后肿瘤组织及癌旁正常组织蜡块行免疫组化显示:喉鳞癌组织中grhl3表达明显高于癌旁正常组织,统计分析与临床分期,淋巴结转移,组织学分级密切相关(pgrhl3的表达,可以降低人喉癌细胞侵袭,迁移和增殖能力。3.沉默grhl3表达可以使人喉癌细胞形成EMT中重要标志物基因E-cadherin上调和Vimentin降低,另外下调Wnt/β-catenin信号通路中基因β-catenin和cyclinD1的表达。结论***3的表达与喉鳞癌患者临床和病理参数密切相关。2.沉默grhl3可降低人喉癌细胞的侵袭、迁移和增殖能力。3.喉癌的迁移侵袭发生肿瘤EMT与grhl3相关,可能受Wnt/β-catenin信号通路调控。

关键词： grhl3 喉鳞癌 siRNA转染迁移侵袭 EMT

转录因子grhl3调控GPR108基因表达及其作用机制

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转录因子GRHL3调控GPR108基因表达及其作用机制

作者：倪鸣岳安徽医科大学

学位级别：硕士

目的G蛋白偶联受体108(GPR108)作为G蛋白偶联受体家族成员之一,其功能和受调控机制尚未明确。该研究旨在寻找GPR108基因启动子,同时探讨其是否与果蝇头状因子3(grhl3)发生相互作用,进而研究转录因子grhl3调控GPR108基因表达的分子机制... 详细信息

目的G蛋白偶联受体108(GPR108)作为G蛋白偶联受体家族成员之一,其功能和受调控机制尚未明确。该研究旨在寻找GPR108基因启动子,同时探讨其是否与果蝇头状因子3(grhl3)发生相互作用,进而研究转录因子grhl3调控GPR108基因表达的分子机制。方法1.通过生物信息学分析公共数据库,获得各种癌症组织的肿瘤细胞中的grhl3和GPR108的表达水平以及相互关系。2.运用逆转录实时定量PCR(RT-q PCR)检测grhl3和GPR108基因在人皮肤鳞癌细胞系(A-431)、人肝癌细胞系(Hep G2)以及人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)的表达。3.利用分子克隆技术构建含有GPR108基因启动子的荧光素酶报告基因表达载体p GL3-GPR108-Promoter,通过PCR、限制性核酸内切酶等方法验证该重组载体;并利用PCR方法将表达载体中与grhl3相结合的潜在位点5’-AACCGGTG-3’进行删除突变,DNA测序方法验证突变结果。4.通过双荧光素酶报告基因检测系统(Luciferase),观察grhl3对GPR108基因启动子的调控作用;5.通过染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验分析grhl3和GPR108启动子结合位点之间的关系。结果1.生物信息学分析在各种癌症组织的肿瘤细胞中,grhl3的表达较低,而GPR108的表达较高。2.利用分子克隆技术成功构建了GPR108基因启动子和突变型GPR108基因启动子荧光素酶报告基因表达载体;***结果表明,grhl3对荧光素酶报告基因GPR108的启动子具有明显的抑制作用。将GPR108启动子上的结合位点删除突变后,grhl3对GPR108基因启动子的负调控作用减弱;*** IP结果显示grhl3能与GPR108启动子结合位点结合。结论1.在人体肿瘤细胞系中,grhl3的表达水平低于GPR108;2.转录因子grhl3通过与GPR108基因启动子中的保守序列结合,负调控GPR108基因的表达;***108基因近端启动子调控区域的特定基序5’-AACCGGTG-3’,是转录因子grhl3的DNA结合位点,并且还有其他负调控结合位点。

关键词： grhl3 GPR108 启动子