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grem1对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响机制研究

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四川大学学报（医学版） 2021年第3期52卷 409-415页

作者：朱行燕刁树杨东梅范志朋国家儿童医学中心首都医科大学附属北京儿童医院口腔科北京100045 首都医科大学附属北京口腔医院儿童口腔科北京100050 首都医科大学附属北京口腔医院研究所全牙再生及口腔组织功能重建北京市重点实验室北京100050

目的研究骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)拮抗剂gremlin1(grem1)对根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs)功能的影响,并探索其机制。方法体外分离培养SCAPs,免疫荧光染色实验检测grem1在SCAPs的亚细胞定位;利用grem1shRNA慢病毒转染,敲低grem1;分别对grem1敲低组和对照组SCAPs进行成骨诱导,实时荧光定量PCR(Real time-PCR)和Western blot检测转染后grem1的敲低效果。取两组细胞,成骨诱导7 d后进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,成骨/成牙本质诱导3周后进行茜素红染色,并用Real time-PCR检测成骨诱导0周、1周、2周、3周后成骨/成牙相关基因骨钙素(OCN)、骨桥素(OPN)、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白(DMP1)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)以及成骨/成牙关键转录因子Runt相关转录因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、同源盒基因2(DLX2)的表达。取两组细胞,CCK8和流式细胞术检测细胞增殖能力变化;Real time-PCR检测衰老相关基因p53、细胞周期调控因子1(Waf1)和干性相关基因krupple样因子4(KLF4)、性别决定区Y框蛋白2(SOX2)的表达,以及BMPs相关基因(BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP9)的表达。结果免疫荧光实验表明grem1在胞核内表达量比胞浆中更高;Real time-PCR和Western blot验证了grem1敲低组的敲低效果。grem1敲低组ALP活性高于对照组(Pgrem1敲低组增殖能力较对照组下降(Pgrem1敲低组BMP2、BMP6、BMP7表达升高,SOX2、KLF4表达升高(Pgrem1敲低后,能促进SCAPs成骨/成牙分化及干性,抑制SCAPs的增殖及衰老;grem1对SCAPs的功能作用可能是通过在mRNA水平调控BMP2、BMP6、BMP7的表达实现的。

关键词：根尖牙乳头干细胞 grem1 骨形态生成蛋白成骨/成牙分化

绝经后骨质疏松小鼠BMSCs免疫相关因子表达谱检测及GREM1对骨分化...

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作者：欧阳仁俊遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:通过免疫相关因子抗体芯片筛选绝经后骨质疏松小鼠的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中存在差异表达的蛋白,并根据芯片结果进行富集分析,验证并探讨免疫相关因子grem1对细胞骨分化的影响。方法:1、建... 详细信息

目的:通过免疫相关因子抗体芯片筛选绝经后骨质疏松小鼠的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中存在差异表达的蛋白,并根据芯片结果进行富集分析,验证并探讨免疫相关因子grem1对细胞骨分化的影响。方法:1、建立去卵巢组(Ovariectomy,OVX)和假手术组(Sham surgery,SHAM)的小鼠模型,采用ELISA检测、Micro-CT扫描、苏木精-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色鉴定骨质疏松小鼠模型是否建立成功。2、培养OVX组和SHAM组的BMSCs,采用流式细胞术鉴定细胞表面抗原表达情况;成骨诱导后行茜素红染色,成脂诱导后行油红O染色,鉴定细胞是否具有干细胞的多向分化潜能。3、使用Ray Bio L-Series Mouse Antibody Array 308 Glass Slide Kit免疫相关因子抗体芯片检测两组BMSCs细胞中存在差异表达的蛋白,对检测结果进行GO富集分析及PPI网络分析。4、RT-qPCR检测芯片结果中存在明显高表达的免疫相关因子grem1在SHAM组及OVX组中的表达情况,借助转染试剂将质粒和小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)序列分别转染入胚胎小鼠成骨细胞前体细胞(Embryonic mouse osteoblast precursor cells,MC3T3-E1)中,影响grem1的表达;经成骨诱导7d后,RT-qPCR检测成骨分化相关基因BMP2、RUNX2的表达。结果:1、ELISA检测结果显示相较于SHAM组,OVX组小鼠体内雌激素浓度下降;Micro-CT、HE染色及TRAP染色结果均显示OVX组小鼠存在骨质疏松样改观。2、两组BMSCs均呈贴壁生长,呈短梭形或多角形。流式细胞术结果显示BMSCs高表达间充质干细胞特异性表达抗原CD106(98.7%)、CD44(99.8%)、CD29(97.0%),低表达造血干细胞特异性表达抗原CD34(1.32%)、CD45(0.20%)。茜素红染色结果显示两组细胞经成骨诱导后均能形成矿化结节,油红O染色结果显示两组细胞经成脂诱导后均能形成脂滴,符合骨髓间充质干细胞特性。3、免疫相关因子抗体芯片检测结果显示:相较于SHAM组,OVX组存在68个差异表达的蛋白,上调的有gremlin(grem1)、生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)、受体酪氨酸激酶(Receptor protein tyrosine kinase AXL receptorfamily,Axl);下调的有血管内皮钙黏蛋白(Vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、巨噬细胞集落刺激因子(Macrophagecolony-stimulating factor,M-CSF)、催乳素(Prolactin,Prl)、白介素16(Interleukin16,IL-16)、CXC趋化因子配体5(Chemokines,Chemokine(C-X-C motif)ligand,CXCL5)等65个蛋白。GO富集分析显示以上68种差异蛋白主要与细胞表面受体信号、对刺激反应的调节、免疫系统过程有关。4、RT-qPCR检测结果显示:相较于SHAM组,OVX组中grem1呈现更高的表达,与芯片结果一致。将grem1 siRNA转染入MC3T3-E1细胞中,RT-qPCR检测结果显示grem1表达降低;成骨诱导7d后,RT-qPCR检测结果显示成骨相关基因BMP2及RUNX2表达升高。将grem1 Plasmid转染入MC3T3-E1细胞中,RT-qPCR检测结果显示grem1表达升高;成骨诱导7d后,RT-qPCR检测结果显示成骨相关基因BMP2及RUNX2表达降低。结论:1、骨质疏松状态下BMSCs中多种免疫相关因子的表达量发生了变化,主要与细胞表面受体信号、对刺激反应的调节、免疫系统过程有关。2、绝经后骨质疏松小鼠BMSCs中grem1表达上调。3、grem1影响MC3T3-E1中BMP2及RUNX2的表达,grem1对成骨分化有抑制作用。

关键词：骨质疏松症骨髓间充质干细胞免疫相关因子骨分化 grem1

人卵丘细胞grem1基因表达与卵母细胞发育潜能关系研究

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中国实用妇科与产科杂志 2015年第6期31卷 535-538页

作者：林素霞黄荣富吴端宗王育梅陈小莉吴培雅李金姑姚建凤福建医科大学泉州市儿童医院妇幼保健院生殖医学中心福建泉州362000 福建医科大学附属第二医院检验科福建泉州362000

目的探讨辅助生殖技术中人卵丘细胞grem1基因表达水平与卵母细胞发育潜能的关系。方法回顾性分析福建泉州市妇幼保健生殖医学中心2012年3月至2014年3月接受卵胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(ICSIET)治疗的男方因素不孕妇女42例的160个... 详细信息

目的探讨辅助生殖技术中人卵丘细胞grem1基因表达水平与卵母细胞发育潜能的关系。方法回顾性分析福建泉州市妇幼保健生殖医学中心2012年3月至2014年3月接受卵胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(ICSIET)治疗的男方因素不孕妇女42例的160个卵母细胞,以形态学评分标准将正常受精的胚胎分为优质胚胎30个和非优质胚胎70个,移植后剩余胚胎冷冻保存或囊胚培养。根据卵母细胞成熟与否、D3胚胎质量及D5/D6囊胚培养情况,实时荧光PT-PCR分别检测其卵丘细胞中grem1表达水平的差异。结果成熟卵母细胞的卵丘细胞grem1表达水平比不成熟卵母细胞高(1.9739±0.5114 vs.1.5105±0.2629,P1),同样在D3优质胚胎中,检测其卵丘细胞grem1表达水平比非优质胚胎中的高(2.2693±0.4193 vs.1.9263±0.4912,Pgrem1表达水平比失败组的明显升高(2.3874±0.2999 vs.1.5943±0.2078,P1)。结论卵丘细胞grem1表达水平与卵母细胞成熟及胚胎质量有关,成熟的卵母细胞与后期形成的胚胎质量密切相关,检测卵丘细胞grem1表达可预测胚胎发育潜能。

关键词：卵丘细胞 grem1 基因表达卵子成熟度胚胎发育潜能

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grem1在人胆管癌中的表达及临床意义

交通医学 2020年第6期34卷 573-577页

作者：吕秀芳周晓倩南通大学医学院病理学系江苏226001 贵阳市第一人民医院消化内科

目的:研究grem1在人胆管癌(CCA)中的表达,探讨其在临床诊疗中潜在的应用价值。方法:利用公共数据库分析grem1基因在人体组织器官中表达的差异,应用qRT-PCR和免疫组化染色法检测胆汁淤积性肝硬化大鼠肝组织中grem1基因和蛋白表达情况。检... 详细信息

目的:研究grem1在人胆管癌(CCA)中的表达,探讨其在临床诊疗中潜在的应用价值。方法:利用公共数据库分析grem1基因在人体组织器官中表达的差异,应用qRT-PCR和免疫组化染色法检测胆汁淤积性肝硬化大鼠肝组织中grem1基因和蛋白表达情况。检测84例胆管癌患者手术切除的癌组织及配对癌旁组织中grem1蛋白表达,并分析其表达水平与患者临床病理特征及预后的关系。结果:grem1基因在人体胆囊组织中高表达。与假手术组大鼠相比,胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝组织中grem1基因和蛋白表达水平显著增加,差异均具有统计学意义(P1)。与健康对照者相比,胆管癌组织中grem1基因表达显著增加,差异有统计学意义(P1)。与配对癌旁组织相比,胆管癌组织中grem1蛋白水平显著增加,差异有统计学意义(P1)。grem1高表达与胆管癌细胞分化、AJCC分级、淋巴结转移和TNM分期均密切相关(Pgrem1低表达组相比高表达组患者总体生存率和无病生存率显著缩短,差异均具有统计学意义(Pgrem1在人胆管癌中高表达,与患者预后不良相关,有望成为胆管癌防治的潜在靶点,也可以作为判断患者预后的指标。

关键词： grem1 胆管癌胆管结扎细胞外基质

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grem1对胃癌细胞增殖迁移的作用

临床检验杂志 2019年第6期37卷 418-422页

作者：林雅静李天捷王华邵世和江苏大学医学院

目的检测胃癌细胞中grem1基因的表达,探讨其对胃癌细胞生物学特性的影响并评估其在胃癌诊断和胃癌患者预后中的临床价值。方法运用数据库分析grem1基因在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异,评估grem1基因表达水平对胃癌患者预后的相关性。... 详细信息

目的检测胃癌细胞中grem1基因的表达,探讨其对胃癌细胞生物学特性的影响并评估其在胃癌诊断和胃癌患者预后中的临床价值。方法运用数据库分析grem1基因在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异,评估grem1基因表达水平对胃癌患者预后的相关性。Western blot检测胃癌细胞系中grem1蛋白质表达水平。AGS细胞中沉默grem1基因后,采用平板克隆、Transwell和western blot检测其对胃癌细胞增殖、迁移、上皮间质转化(EMT)发生及Wnt/β-catenint通路的影响。结果 Kaplan-Meier分析表明,grem1基因高表达患者总体生存率(OS)和无进展生存率(PFS)均降低。grem1蛋白在AGS细胞系中的表达水平(1.967±0.056)最高。平板克隆、Transwell及western blot实验显示,沉默grem1基因可导致胃癌细胞的增殖及迁移能力降低(t分别为22.00,29.60;P均1);E-cadherin表达上升(t=10.65,P1),ZEB1、MMP2表达均下降(t分别为10.74和13.67,P均1);Wnt/β-catenin通路中β-catenin、CyclinD1、c-myc、p-GSK3β和PCNA的表达水平均降低(t分别为12.65,16.21,8.74,7.75和8.42;P均1)。结论 grem1通过激活Wnt/β-catenin诱导EMT发生,促进肿瘤转移和生长。grem1可作为新的胃癌分子诊断和预后指标。

关键词： grem1 胃癌增殖迁移上皮间质转化

异质性肺成纤维细胞中PPP2R3A影响矽肺肺纤维化进程研究

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异质性肺成纤维细胞中PPP2R3A影响矽肺肺纤维化进程研究

作者：史晓妮东南大学

学位级别：硕士

背景:矽肺（Silicosis）是由于长期吸入大量游离的二氧化硅（SiO）颗粒所致,以肺部形成广泛的矽结节和肺间质纤维化为特征的全身性疾病,并伴随着肺部炎症和其他并发症,是世界范围内最严重的职业病之一。矽肺的发生发展是多细胞参与、多... 详细信息

背景:矽肺（Silicosis）是由于长期吸入大量游离的二氧化硅（SiO）颗粒所致,以肺部形成广泛的矽结节和肺间质纤维化为特征的全身性疾病,并伴随着肺部炎症和其他并发症,是世界范围内最严重的职业病之一。矽肺的发生发展是多细胞参与、多因子调控的复杂病理过程,其中肺成纤维细胞（PFBs）的活化和迁移是矽肺的主要病理特征。PFBs是肺间质细胞的主要成分,是参与机体损伤修复的重要效应细胞,具有在生理条件下保持静息态,在病理状态下快速增殖完成损伤修复,又恢复静息态的特点,通过增殖和迁移、合成并释放胶原等基质物质参与纤维化。成纤维细胞（FBs）的表型具有高度异质性和可塑性,PFBs的异质性表明这些细胞可能来自不同的细胞类型,代表不同的活化阶段,或可能受到周围环境的影响。具有异质性的FBs对内环境的不同响应,可能是肺纤维化发生的主要原因。在矽肺进程中PFBs是否具有特殊的异质性现象目前尚不清楚,因此本研究通过整合单细胞转录组测序（scRNA-seq）和空间转录组学,重构并可视化组织和邻近结构,进而探索生理、病理过程中肺组织中细胞间相互作用,谱系和种群演变等新的规律。目前异质性FBs这一概念已得到广泛认可,但对于异质性FBs中的关键分子及其在纤维发生过程中扮演的角色仍然不明确。grem1是异质性FBs中的关键分子和BMP的拮抗剂之一,是TGF-β超家族的成员,可以阻断BMP信号,可以促进细胞增殖和迁移,与肺、肝、眼和皮肤纤维化有关。grem1介导纤维化已经比较明确,但其机制尚不明确。基于本课题组前期环状RNA的测序发现,蛋白磷酸酶2A调节亚基B''α（PPP2R3A）在纤维化进程中发生了显著变化。PPP2R3A是PP2A调节亚基B的成员之一,主要通过靶向细胞周期调节因子和凋亡因子,调控细胞周期,因其参与肿瘤信号通路的调节及发育进程受到关注,但目前尚不清楚PPP2R3A在肺纤维化中发挥的作用。因此本研究进一步探究了矽肺进程中特异表达grem1的异质性PFBs及其关键分子PPP2R3A对肺纤维化进展的影响,为矽肺防治提供新策略。方法:采用气管滴注SiO（剂量为50 mg/mL）构建小鼠矽肺模型,送至北京博奥晶典生物技术公司进行scRNA-Seq和空间转录组测序;采用Loupe Browser 5.0软件分析测序结果;采用生物信息学方法分析异质性PFBs亚型的空间位置、转分化过程、基因分子功能与参与的细胞生物学过程、相关下游分子靶标;采用天狼星红染色验证模型是否构建成功;采用GEO数据库分析grem1在特发性肺纤维化（IPF）患者及健康人中的表达;采用成年人肺成纤维细胞系（HPF-a）构建体外TGF-β1（5 ng/mL）刺激的纤维化相关模型,蛋白免疫印记法（Western Blot,WB）、细胞和组织免疫荧光实验检测grem1、PPP2R3A、TP53、BBC3以及纤维化相关标志物的蛋白水平;采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）法检测Ppp2r3a mRNA表达;采用CCK-8实验和划痕实验检测细胞活力及迁移能力;采用siRNA特异性敲减grem1分析下游分子靶点;为了进一步探讨异质性PFBs中PPP2R3A的功能,采用siRNA特异性敲减Ppp2r3a,分析PFBs相关功能的变化以及对纤维化相关标志物蛋白水平的影响;采用siRNA特异性敲减Ppp2r3a,检测下游分子TP53与BBC3的蛋白水平变化;采用钙离子荧光探针Fluo-4 AM孵育HPF-a细胞,通过荧光酶标仪及活细胞工作站检测HPF-a细胞内钙离子(Ca)浓度变化,探究PPP2R3A促进纤维化发生的机制。结果:1)通过t-SNE图展示发现矽肺进程中PFBs存在异质性现象且PFBs可分为7个亚型,分别命名为静息态FBs（有两群）、炎症相关FBs、肌成纤维细胞（Myofibroblasts,MFBs）、脂质FBs、细胞外基质（ECM）相关FBs、grem1FBs,其中grem1 FBs亚型仅在SiO组出现;2)结合矽肺组小鼠肺组织切片HE染色及scRNA-Seq结果映射到空间位置上发现grem1 FBs高表达于炎症病灶区域;3)空间转录组结果显示grem1高表达于炎症病灶区域;4)拟时序分析发现grem1 FBs来源于静息态FBs,转分化为MFBs和ECM相关FBs;5)韦恩图交集分析发现grem1FBs中表达倍数变化排前50的基因既与炎症相关FBs有交集,又与ECM相关FBs和MFB有交集;6)生物信息学分析grem1FBs表达倍数变化排名前50的基因参与了生物进程、增殖、炎症、死亡和分化,因此将其定义为炎症-增殖相关FBs;7)grem1 mRNA在IPF患者中的表达显著高于健康对照组;8)TGF-β1刺激HPF-a细胞后:grem1、PPP2R3A、TP53、BBC3及纤维化相关标志物蛋白水平上升;Ppp2r3a mRNA表达上升;HPF-a细胞的活化、增殖及迁移能力增

关键词：矽肺肺纤维化异质性肺成纤维细胞 grem1 PPP2R3A

MicroRNA靶序列单核苷酸多态性与乳腺癌预后的关联研究

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MicroRNA靶序列单核苷酸多态性与乳腺癌预后的关联研究

作者：韩璐天津医科大学

学位级别：硕士

目的乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤,也是导致女性癌症相关死亡的最主要原因。研究证明乳腺癌预后受环境、行为方式及遗传差异等多因素影响。越来越的研究表明micro RNA靶序列单核苷酸多态性(SNP)在肿瘤发生发展中的重要... 详细信息

目的乳腺癌是世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤,也是导致女性癌症相关死亡的最主要原因。研究证明乳腺癌预后受环境、行为方式及遗传差异等多因素影响。越来越的研究表明micro RNA靶序列单核苷酸多态性(SNP)在肿瘤发生发展中的重要作用。micro RNA靶序列SNP能够调节micro RNA下游靶基因的表达,若下游靶基因存在调控细胞迁徙和侵袭等能力,则micro RNA靶序列单核苷酸多态性有可能影响癌症患者结局。本研究通过筛选全基因组micro RNA靶序列SNP并分析不同基因型患者预后的差异,探索micro RNA靶序列SNP与乳腺癌患者预后的关系,以期能为准确评估乳腺癌患者预后提供有利线索。方法1.全基因组micro RNA种子区结合序列SNP的筛选本次研究采用全基因组关联研究策略,从公认的micro RNA变异数据库“Patrocles”筛选出全基因组192个位于micro RNA种子区的高频SNP位点,遍布22条常染色体。2.病例来源纳入的乳腺癌患者为自2006年1月1日起在天津医科大学肿瘤医院确诊的乳腺癌新发病例,共有2647名乳腺癌患者最终纳入了本次研究。研究分为筛选阶段和验证阶段,筛选阶段纳入1297例乳腺癌病例,验证阶段纳入1350例病例。3.实验方法筛选阶段采用Illumina goldengate SNP分型技术对全基因组192个位点的基因型进行检测。验证阶段采用Taqman SNP分型技术对筛选阶段筛选出的位点进行检测。4.随访我们对纳入研究的2647名乳腺癌患者采用电话、邮件以及信件等方式进行随访以了解病人现阶段生存情况,随访每年进行一次,随访时间截止到2015年10月。计算患者的乳腺癌特异性生存、总生存和无病生存时间。5.统计分析利用Kaplan-Meier和多因素Cox回归模型分析SNP各基因型间乳腺癌患者的生存差异。利用多因素logistic回归模型分析各基因型与乳腺癌患者临床特征间的关联。采用双侧检验,P1.筛选阶段发现乳腺癌患者预后在8个SNP位点不同基因型间存在差异(Pgrem1基因上rs10318位点与乳腺癌预后相关(P10318位点呈现CC,携带TT基因型患者有较差的乳腺癌特性生存(HR=1.911;95%CI:1.204-3.031,P=0.006)和较差的总生存(HR=1.862;95%CI:1.208-2.871,P=0.005)。rs10318s位点位于grem1基因上,grem1极有可能通过CTATTAA序列接受mi RNA-633的调控。3.流行病学资料分层分析发现,母乳喂养、已绝经、无肿瘤家族史、不吸烟、无乳腺良性疾病史、活产次数>1次、怀孕次数>2次和A、O型血患者中rs10318位点为TT基因型相较于CC基因型生存较差;按临床资料分层分析发现,肿瘤最大径≤2.5cm、淋巴结活检阴性和浸润性导管癌患者中rs10318位点为TT基因型相较于CC基因型生存较差。4.在rs10318位点与临床特征的关联研究发现,rs10318位点基因型与ER状态(阴性=1,阳性=2)相关,相比CC基因型,携带有TT基因型的患者ER易呈阴性(OR=0.634;95%CI:0.472-0.852,P=0.007)。结论1.我们发现grem1基因上rs10318位点与乳腺癌的预后相关,与CC基因型相比,携带有TT基因型的患者预后较差,自此我们发现了一个新的SNP位点与乳腺癌的预后相关。2.rs10318位点与ER状态相关,携带有TT基因型(相较于CC基因型)的患者ER易呈阴性。

关键词：乳腺肿瘤 microRNA 种子区结合序列单核苷酸多态性 grem1 miRNA-633

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高糖对小鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制

高糖对小鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制

作者：龚海燕南华大学

学位级别：硕士

目的本文拟探讨miR-32在高糖介导的VSMCs钙化中的作用及机制,为阐明糖尿病血管钙化的发病机制提供实验依据。方法1.为检测高糖对血管平滑肌细胞钙化的影响,以正常浓度葡萄糖(NG,5 mM)或高浓度葡萄糖(HG,25 mM)处理小鼠血管平滑肌细胞(MV... 详细信息

目的本文拟探讨miR-32在高糖介导的VSMCs钙化中的作用及机制,为阐明糖尿病血管钙化的发病机制提供实验依据。方法1.为检测高糖对血管平滑肌细胞钙化的影响,以正常浓度葡萄糖(NG,5 mM)或高浓度葡萄糖(HG,25 mM)处理小鼠血管平滑肌细胞(MVSMCs),不加或者加钙化培养基诱导钙化,1天和3天后通过qRT-PCR和/或Western Blot检测平滑肌标志物(SMA、SM-22和SM-MHC)、成骨标志物(OCN、ALP和RUNX2)的表达水平,以及应用分光光度法检测ALP活性。30天后应用茜素红染色检测MVSMCs钙含量。2.为了检测miR-32是否参与MVSMCs钙化过程的调控,将pre-miR-32、anti-miR-32分别转染入MVSMCs中,通过qRT-PCR检测OCN、BMP-2、Runx2、OPN以及MGP的mRNA表达水平,应用分光光度法检测ALP活性,并测定钙含量。3.MVSMCs分别在含5mmol/l及25mmol/l糖浓度的培养基中培养,不加或者加钙化培养基诱导钙化,1天和3天后通过qRT-PCR和/或Western Blot检测miR-32、靶基因GATA6以及GATA6下游基因grem1的表达水平;同时,应用荧光素酶实验检测GATA6对OCN启动子活性的影响。结果1.高糖对平滑肌细胞钙化的影响:高糖诱导了MVSMCs钙含量的增多,显著增加了MVSMCs的成骨标志物(ALP、OCN和RUNX2)的表达。此外,高糖降低了平滑肌标志物(SMA、SM-22和SM-MHC)的表达水平。2.miR-32对平滑肌细胞钙化的影响:pre-miR-32转染入MVSMCs4天后,MVSMCs的BMP2、Runx2、OPN和MGP的mRNA水平明显增加;过表达miR-32导致MVSMCs的ALP活性显著增强,以及MVSMCs钙含量的明显增加。而将anti-miR-32转染入MVSMCs后,上述结果刚好相反。3.高糖诱导平滑肌细胞钙化的可能机制:高糖显著增加了MVSMCs的miR-32表达水平,相应地降低了miR-32的靶基因—GATA6的mRNA和蛋白水平;我们还发现了高糖可降低grem-1的表达;荧光素酶实验则显示GATA6可抑制OCN启动子活性。结论1.高糖可促进小鼠血管平滑肌细胞钙化。2.miR-32可在血管钙化过程中发挥调控作用,能促进平滑肌细胞的钙化。3.高糖可通过诱导miR-32上调降低GATA6的表达,并影响sm-MHC/OCN/grem1信号网络促进平滑肌细胞钙化的发生。

关键词：高糖 miR-32 糖尿病血管钙化 GATA6 sm-MHC OCN grem1