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猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白特异性纳米抗体的原核表达及鉴定

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中国动物检疫 2023年第10期40卷 106-111页

作者：王鑫张洪亮秦志华郑乾坤黄娟董绍明杨瑞梅曲光刚单虎山东省预防兽医学重点实验室青岛农业大学动物医学院山东青岛266109 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 得利斯集团有限公司山东潍坊262216

为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)gp5蛋白的特异性纳米抗体,并鉴定其抗原结合活性,以本实验室前期获得的PRRSV gp5蛋白特异性纳米抗体VHHgp5基因片段为模板,使用PCR对目... 详细信息

为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)gp5蛋白的特异性纳米抗体,并鉴定其抗原结合活性,以本实验室前期获得的PRRSV gp5蛋白特异性纳米抗体VHHgp5基因片段为模板,使用PCR对目的片段进行扩增,将扩增的片段经双酶切处理后连接到pColdSUMO-FLAG载体上,随后转化至*** TOP 10感受态细胞。经菌液PCR鉴定,将构建成功的重组质粒转化至*** BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG作为诱导剂对目的蛋白进行诱导表达,表达产物通过Ni-NTA亲和层析柱纯化。通过SDA-PAGE凝胶电泳分析表达及纯化后的蛋白,同时使用ELISA方法检测纯化后的纳米抗体效价,并使用Western blot鉴定纯化后的蛋白。SDS-PAGE结果显示,成功获得了大小约36 kDa的重组蛋白,利用原核表达系统制备的PRRSV gp5特异性纳米抗体重组蛋白以可溶性形式表达;ELISA结果显示,该纳米抗体结合抗原的效价为1:50000;Western blot结果显示,该纳米抗体具有较好的反应性和特异性。本试验为PRRSV检测用及治疗用新型抗体开发奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 gp5蛋白大肠杆菌表达系统纳米抗体

gp5蛋白诱导表达及其多克隆抗体制备与PRRS和TGE共感染检测

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GP5蛋白诱导表达及其多克隆抗体制备与PRRS和TGE共感染检测

作者：袁传奇西北农林科技大学

学位级别：硕士

利用本课题组前期构建的pET-28a-gp5-BL21,诱导表达并纯化PRRSV gp5蛋白,用获得的纯化的PRRSV gp5免疫小鼠,制备针对gp5的多克隆抗体,为gp5蛋白的检测提供材料。同时以基于纯化的gp5建立的gp5抗体检测的ELISA方法和商品化猪传染性胃肠... 详细信息

利用本课题组前期构建的pET-28a-gp5-BL21,诱导表达并纯化PRRSV gp5蛋白,用获得的纯化的PRRSV gp5免疫小鼠,制备针对gp5的多克隆抗体,为gp5蛋白的检测提供材料。同时以基于纯化的gp5建立的gp5抗体检测的ELISA方法和商品化猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)抗体ELISA检测试剂盒对采集自陕西省部分地市的猪血清进行检测,为陕西省猪群的PRRS和TGE进行血清学调查,以期为陕西省猪场猪繁殖与呼吸综合征和猪传染性胃肠炎的综合防控提供科学依据。*** gp5的诱导表达、纯化与鉴定将pET-28a-gp5-BL21接种于卡那抗性的液体培养基中,培养10-12h,过夜活化。然后按1:20接菌,37℃、220r/min,震荡培养至OD600nm约为0.6左右,取1mL菌液作为未诱导前的对照,其余加入终浓度为lmmol/L的IPTG诱导培养4h,取1mL菌液为样品。将样品处理后进行SDS-PAGE,确定目的蛋白是否表达。诱导后剩余菌液样品离心弃去上清液留沉淀,PBS重悬沉淀后超声波碎仪破碎,然后4℃、12000r/min离心分别收集上清和沉淀。用8mol/L的尿素重悬沉淀,样品处理后做SDS-PAGE确定蛋白的表达形式。之后进行大量表达,亲和层析法进行纯化,SDS-PAGE鉴定纯化的效果。Western blot鉴定的反应原性。结果诱导表达的gp5蛋白分子质量约为15ku,与预期的大小相符,表达的蛋白主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE结果表明获得了纯化的目的蛋白;以PRRSV阳性猪血清进行Western blot检测,结果在约15ku处有印迹条带,表明表达的蛋白具有良好的反应原性。*** gp5的多克隆抗体的制备取纯化的gp5蛋白免疫6-8周龄昆明系小鼠,每只腹腔注射重组蛋白50μg,共免疫4次,每次间隔2周。其中第一次免疫使用弗氏完全佐剂,其他3次使用弗氏不完全佐剂。每次免疫当天割尾采血后进行免疫,最后一次免疫后第十天摘眼球采血,按常规方法分离血清-20℃备用。利用ELISA方法检测小鼠血清中的抗gp5蛋白的抗体效价。结果ELISA检测,制备的血清抗体效价均在1:10000以上,最高可达1:1024000以上。3.陕西省部分地市猪血清检测利用商品化的TGEV抗体ELISA检测试剂盒和实验室基于纯化的gp5建立的gp5抗体间接ELISA检测方法,对采集自陕西省6个地市的409份猪血清进行检测。结果采集的409份血清中gp5抗体阳性的有8份,TGEV抗体阳性的有65份,两者共阳性的有2份。本研究成功获得了诱导表达并纯化的PRRSV gp5蛋白,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在,反应原性良好;通过免疫小鼠制备了抗gp5蛋白的多克隆抗体,血清抗体效价均在1:10000以上,最高达1:1024000以上;采集的409份血清中gp5抗体阳性的8份,TGEV抗体阳性的65份,两者共阳性的有2份,表明陕西省部分地市猪群中存在PRRSV与TGEV共感染现象。

关键词： PRRSV gp5蛋白诱导表达多克隆抗体制备 TGEV ELISA

猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

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中国兽医科学 2012年第5期42卷 511-516页

作者：张辉王光利徐大勇李峰徐争辉淮北师范大学生命科学学院安徽淮北235000

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增gp5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码gp5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pV... 详细信息

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增gp5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码gp5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒gp5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达gp5蛋白。同时,中和试验结果初步表明gp5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示gp5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆 gp5蛋白糖基化

猪生殖与呼吸综合征病毒CH-1a株gp5蛋白基因的表达及其单克隆抗体的制备

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中国兽医科技 2005年第11期35卷 859-864页

作者：周艳君安同庆薛强仇华吉童光志刘金霞田志军王云峰彭金美中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株gp5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1载体上,并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现,融合表达的rtgp5蛋白约42 ku,将融合蛋白rtgp5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分... 详细信息

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1a株gp5蛋白基因信号肽部分删除后克隆于pGEX-6p-1载体上,并在大肠埃希氏菌中进行表达。经SDS-PAGE电泳分析发现,融合表达的rtgp5蛋白约42 ku,将融合蛋白rtgp5用PRRSV阳性血清进行Western-blotting分析,证实所表达的融合蛋白能被其特异性识别。收获融合表达产物rtgp5,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化,经腹腔免疫BALB/c小鼠3次后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,分别以融合蛋白rtgp5和GST蛋白为抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞的上清液进行检测,筛选阳性克隆,结果得到了15株能稳定分泌抗rtgp5蛋白抗体的阳性细胞克隆株。经间接免疫荧光检测发现,获得的15株单克隆抗体都能与PRRSV感染细胞产生特异性荧光。15株单克隆抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型,且轻链均为κ链。

关键词：猪生殖与呼吸综合征病毒 gp5蛋白单克隆抗体

猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白-重组犬1型腺病毒构建及在猪体内免疫特性

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中国兽医学报 2009年第10期29卷 1242-1246,1250页

作者：蒋万春赵德明中国农业大学动物医学院北京100094 河北工程大学农学院河北邯郸056002

本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因组gp5蛋白的免疫原性，将PRRSV河北分离株gp5基因的表达盒克隆到犬1型腺病毒的感染性基因组的复制非必需区内，转染MDCK细胞，获得了重组病毒，免疫新生仔猪，分别在免疫后O～12周采集血... 详细信息

本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因组gp5蛋白的免疫原性，将PRRSV河北分离株gp5基因的表达盒克隆到犬1型腺病毒的感染性基因组的复制非必需区内，转染MDCK细胞，获得了重组病毒，免疫新生仔猪，分别在免疫后O～12周采集血清，通过ELISA检测证明，猪体同时产生了针对犬1型腺病毒和PRRSV gp5的抗体。说明gp5-重组犬1型腺病毒具有作为蓝耳病疫苗的潜力。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 gp5蛋白重组犬1型腺病毒免疫

PRRSV N与gp5蛋白抗原表位的串联表达及其间接ELISA检测方法的建立

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2017年第10期45卷 15-20,29页

作者：陈如敬周伦江吴学敏车勇良王晨燕王隆柏黄晓凤严山刘玉涛魏宏福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建福州350013

【目的】建立基于N与gp5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和gp5蛋... 详细信息

【目的】建立基于N与gp5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和gp5蛋白抗原表位串联优化后进行原核表达,以表达的目的蛋白为抗原,通过优化反应条件建立检测PRRSV抗体的ELISA方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的间接ELISA方法和商品化IDEXX试剂盒同时对临床送检的45份猪血清样品进行检测,计算其符合率。【结果】SDS-PAGE和Western Blot分析表明,表达的目的蛋白分子质量约为24.7ku,具有良好的生物学活性,且为可溶性表达。目的蛋白经纯化后作为抗原包被ELISA平板,建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,优化后的ELISA条件为:抗原(纯化后的目的蛋白)包被量为5μg/mL、一抗(猪血清)1∶80稀释、酶标二抗1∶5 000稀释,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃孵育60min,抗体(一抗和酶标二抗)于37℃孵育90min,TMB避光显色8min;间接ELISA的判定标准为:OD450≥0.345 2为阳性,OD4505 2为阴性。所建立的间接ELISA方法特异性强,对猪常见病原,如猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒高免血清检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为1.02%~3.94%和1.38%~4.83%。用所建立的间接ELISA方法对临床送检45份猪血清样品的检测阳性率为84.44%(38/45),商品化IDEXX试剂盒检测的阳性率为80%(36/45),2种方法的符合率为94.73%(36/38)。【结论】成功建立了基于N与gp5蛋白抗原表位串联的PRRSV抗体ELISA检测方法。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白 gp5蛋白抗原表位串联表达间接ELISA

猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2018年第1期40卷 24-28页

作者：李志杰提金凤李舫王志远刁玉荣山东畜牧兽医职业学院山东潍坊261061

为建立检测感染猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)或PRRSV弱毒疫苗免疫后猪群体内抗体水平的方法,本研究以PRRSV gp5基因的原核表达蛋白为包被抗原,建立了间接ELISA抗体检测方法。利用RT-PCR扩增PRRSV gp5基因,将其克隆于p GEX-6p-1中... 详细信息

为建立检测感染猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)或PRRSV弱毒疫苗免疫后猪群体内抗体水平的方法,本研究以PRRSV gp5基因的原核表达蛋白为包被抗原,建立了间接ELISA抗体检测方法。利用RT-PCR扩增PRRSV gp5基因,将其克隆于p GEX-6p-1中构建原核重组表达载体p GEX-6P-gp5,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,以梯度尿素法对表达蛋白纯化后,以其为包被抗原,利用方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了gp5蛋白的最佳包被浓度是150 ng/孔,被检血清的最佳稀释倍数为80倍。试验结果显示,该检测方法的特异性、敏感性、重复性很强。从山东各地采集203份猪血清样品进行检测,结果显示该检测方法与商品化PRRSV抗体检测试剂盒(法国LSI)检测结果的符合率为96.5%。本研究建立的间接ELISA方法,为猪群体内PRRSV抗体水平的检测提供了重要的检测手段,在疫苗免疫效果的评价方面有着广泛的应用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒 gp5蛋白原核表达间接ELISA

猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白在酿酒酵母中的定位研究

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中国预防兽医学报 2012年第8期34卷 670-672页

作者：李能章邱荣蓉黄园媛邹灵秀彭远义西南大学动物科技学院重庆400716 重庆理工大学药学与生物工程学院重庆400054

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp5基因在酿酒酵母中表达后蛋白的定位位置,以此揭示PRRSV在感染细胞中获取囊膜的位置信息,本研究首先将gp5基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35的gfp基因上游,构建重组质粒pUG-gp5-gfp,电击导入酿酒酵... 详细信息

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp5基因在酿酒酵母中表达后蛋白的定位位置,以此揭示PRRSV在感染细胞中获取囊膜的位置信息,本研究首先将gp5基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35的gfp基因上游,构建重组质粒pUG-gp5-gfp,电击导入酿酒酵母***2中,经尿嘧啶缺陷型营养筛选,获得重组酵母pUG-gp5-gfp/***2,在甲硫氨酸营养缺陷培养基诱导表达后,荧光显微镜观察显示,gp5-gfp融合基因在酿酒酵母中获得表达,所表达的融合荧光蛋白主要聚积位置与内质网和质膜的定位模式一致,表明gp5蛋白信号肽在酵母中起到了导向作用,揭示了PRRSV在宿主细胞中获得囊膜的可能位置。该研究为其他病毒在宿主细胞中的组装位置研究提供新的思路。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 gp5蛋白酿酒酵母膜定位

猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5蛋白中和性单克隆抗体的制备与免疫学特性测定

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南京农业大学学报 2008年第1期31卷 72-76页

作者：马苏戴建君李玉峰段舒怡姜平南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室江苏南京210095

利用重组真核质粒pcDNA3-gp5免疫BALB／c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0融合，经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆，得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）gp5蛋白的单克隆抗体（McAb）杂交瘤细胞株，分别命名为4C9、... 详细信息

利用重组真核质粒pcDNA3-gp5免疫BALB／c小鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0融合，经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆，得到3株能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）gp5蛋白的单克隆抗体（McAb）杂交瘤细胞株，分别命名为4C9、5D10、5F12，其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价为1：64～1：1024，腹水的效价为1：3200～1：10240，IFA和IPMA的检测结果均为阳性。Western-blot检测证明，这3株McAb均针对PRRSV的gp5蛋白。中和试验表明，5D10和5F12具有病毒中和活性，中和效价分别为1：40和1：80。5D10相对亲和力大于5F12，3株细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体，表明抗gp5蛋白中和性McAb制备成功。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) gp5蛋白单克隆抗体中和抗体