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Gα亚单位与girk通道相互结合特性的研究

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Gα亚单位与GIRK通道相互结合特性的研究

作者：耿仙河北医科大学

学位级别：硕士

G蛋白门控的内向整流钾离子通道(G protein gated inwardly rectifying K channels, girk)是内向整流钾通道家族中的一员,存在5种亚单位(girk1-5),它们与神经兴奋性和心率的调节有关,特别在维持神经元的静息电位及慢突触后抑制中起重要... 详细信息

G蛋白门控的内向整流钾离子通道(G protein gated inwardly rectifying K channels, girk)是内向整流钾通道家族中的一员,存在5种亚单位(girk1-5),它们与神经兴奋性和心率的调节有关,特别在维持神经元的静息电位及慢突触后抑制中起重要作用。girk通道的分子组成已经得到鉴定,是Kir3.x钾通道家族的成员。girk通道的功能除了受G蛋白的调节外,另外还受到磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)、细胞内的钠、乙醇及机械性牵张作用的调节。girk1和girk4主要分布在心房和窦房结细胞中,在调节心脏兴奋性中起重要作用,由迷走神经释放的递质乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)通过兴奋Ⅱ型毒蕈碱样受体(M2)以及下游的PTX敏感的Gi蛋白激活girk通道,引起膜动作电位超极化,减少动作电位的频率,减慢心率。girk2主要分布在中枢神经系统,许多神经递质如γ-氨基丁酸、多巴胺、5-羟色胺和阿片肽类等通过激活PTX敏感的Gi蛋白激活girk通道,调节神经细胞的兴奋性。已有研究表明,Gi/o偶联的受体激活后能够激活而Gq及Gs G蛋白偶联的受体激活后却不能激活girk通道,表明G蛋白偶联的受体在调节girk功能中有特异性。例如,在心肌组织中,只有与PTX敏感的G蛋白(Gi/Go)偶联的受体如M2毒蕈碱样受体,A1嘌呤能受体及EDG家族的神经鞘脂类受体能够激活girk通道,而与PTX不敏感的G蛋白(Gs)偶联的受体如β肾上腺素能受体却不能激活girk通道。研究表明Gi蛋白是通过激活后释放的Gβγ亚单位激活girk通道的,目前已发现了至少5种β亚单位和12种γ亚单位,然而,几乎所有不同组合形式的Gβγ亚单位均能激活girk通道,所以受体激活girk通道的选择性不能用Gβγ二聚体的不同组合类型来解释。我们前期工作表明Gα亚单位在受体激活girk通道的选择性中可能起重要的作用。本研究重点观察了Gα亚单位与girk通道的直接结合情况。在本实验中以非洲爪蟾卵母细胞为表达系统,研究了内源性Gα亚单位以及过表达Gα亚单位后Gα与girk4通道结合在一起。结果表明,爪蟾卵母细胞内源性Gαi/o亚单位确实与girk4通道相结合,而Gαq及Gαs亚单位却未与girk4通道结合。但当过表达Gαq及Gαs亚单位时,过表达的Gαq及Gαs能与girk4结合,本研究结果表明Gα亚单位可能是决定受体调节girk通道特异性的决定因素。一、FLAG标记的girk4通道的构建、表达及其对通道功能的影响目的:在girk4通道蛋白中加入FLAG标记短肽,表达于爪蟾卵母细胞。应用双电极电压钳技术检测标记有短肽的girk4的功能是否受到影响;应用免疫印迹技术进一步确认FLAG短肽是否成功加入girk4通道蛋白。方法:(1)构建重组质粒DNA:运用聚合酶链式反应(PCR)技术合成带有FLAG标记的girk4通道片段,产物大小约1300个碱基。使用限制性核酸内切酶SmaⅠ和EcoRⅠ对FLAG-girk4 DNA片段及pGEMHE载体质粒DNA分别进行双酶切,酶切产物经纯化后,按照插入片段(FLAG-girk4 DNA片段)与载体(pGEMHE质粒DNA)的摩尔比为10:1的比例进行连接。将连接产物转化Top 10大肠杆菌感受态细胞后铺于氨苄抗性阳性的LB琼脂平板上,之后将挑取的数个单克隆提取质粒DNA并使用SmaⅠ和EcoRⅠ对其进行双酶切鉴定。挑取双酶切产物片段大小正确的多个克隆送测序公司测序,最后得到一个测序结果完全正确的克隆。(2)FLAG-girk4表达于爪蟾卵母细胞:使用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems-T7 Kit体外转录得到FLAG-girk4、girk4和M2受体的cRNA,根据其表达情况按每个卵母细胞1-2ng/50nl注射,注射后的细胞在含2.5mM丙酮酸钠的ND96中19-20℃培养。使用双电极电压钳(two-microelectrode voltage clamp,TEVC)检测通道的表达情况。通道表达后,使用M2R激动剂乙酰胆碱(ACh)灌流,来检测其对girk4通道电流的激活程度。(3)验证FLAG标记确实与girk4通道蛋白融合: FLAG标记的girk4通道表达于爪蟾卵母细胞后,提取细胞膜蛋白并进行SDS-PAGE,通过使用抗-FLAG短肽的特异性抗体进行免疫印迹确认FLAG短肽已与girk4通道蛋白成功融合。结果:(1)成功构建重组质粒DNA,经过测序鉴定,确认FLAG标记短肽所对应的DNA碱基序列已经插入到girk4-pGEMHE的

关键词： girk G蛋白 Gα Gβγ 结合

钾通道girk4中G蛋白βγ亚基结合区的研究

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中国神经科学杂志 2001年第3期17卷 205-208页

作者：郑兴东张勇陈哲宇黄爱军由振东路长林 Diomedes E Logothetis 何成第二军医大学神经生物学教研室上海200433 美国纽约大学MountSinai医学院生理学与生物物理学系纽约10029

G蛋白激活的内向整流型钾通道 (girk)在调节心肌房室细胞和神经元的兴奋性中具有重要作用。为了深入阐明G蛋白βγ亚基激活钾通道的分子机制 ,运用系统缺失突变和重组蛋白体外结合方法 ,研究girk4分子中能够与G蛋白βγ亚基结合的区域... 详细信息

G蛋白激活的内向整流型钾通道 (girk)在调节心肌房室细胞和神经元的兴奋性中具有重要作用。为了深入阐明G蛋白βγ亚基激活钾通道的分子机制 ,运用系统缺失突变和重组蛋白体外结合方法 ,研究girk4分子中能够与G蛋白βγ亚基结合的区域。结果表明 ,girk4N端膜内域中的 4 192区和C端膜内域中的 2 5 334 8区分别是G蛋白βγ亚基的最小结合区域。这一研究为进一步确定Gβγ激活girk通道的调节位点。

关键词：钾通道 G蛋白结合域 girk 心肌房室细胞神经元

G蛋白偶联受体调节girk通道的特异性研究

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G蛋白偶联受体调节GIRK通道的特异性研究

作者：李芳河北医科大学

学位级别：硕士

G 蛋白门控的内向整流钾离子通道(G protein gated inwardly rectifying K channels, girk)是内向整流钾通道家族中的一员(Kir3),表达于心血管和神经组织中,它的特点是功能受G 蛋白的调节。某些G 蛋白偶联受体可通过影响其功能影响心肌... 详细信息

G 蛋白门控的内向整流钾离子通道(G protein gated inwardly rectifying K channels, girk)是内向整流钾通道家族中的一员(Kir3),表达于心血管和神经组织中,它的特点是功能受G 蛋白的调节。某些G 蛋白偶联受体可通过影响其功能影响心肌细胞、神经细胞和神经内分泌细胞的兴奋性。girk1 和girk4 主要分布在心房和窦房结细胞中,在调节心脏兴奋性中起重要作用,由迷走神经释放的递质乙酰胆碱(Acetylcholine, ACh) 通过兴奋II型毒菌碱样受体(m2)以及下游的PTX 敏感的Gi 蛋白激活girk 通道,引起膜动作电位超极化,减少动作电位的频率,减慢心率。girk2 主要分布在中枢神经系统,许多神经递质如γ-氨基丁酸、多巴胺、5-羟色胺和阿片肽类等通过激活PTX 敏感的Gi 蛋白激活girk 通道,调节神经细胞的兴奋性。已完成的研究结果清楚地表明,girk 可直接被Gi 蛋白释放的Gβγ激活,是Gβγ直接的效应噐。然而正常生理条件下只有PTX 敏感的Gi 家族G 蛋白激活后可激活girk 通道,而PTX 不敏感的G 蛋白如Gq 和Gs 激活后却不能激活girk 通道。因此G蛋白调节girk 通道存在有特异性。虽然到目前为止已发现了5 种β亚单位和12 种γ亚单位但近来研究表明几乎所有不同组合形式的G 均能直接激活girk 通道,显然用不同G蛋白含有不同Gβγ的组合类型不能解释G 蛋白调节girk通道的特异性。在本实验中,以非洲爪蟾卵母细胞为表达系

关键词： G 蛋白偶联受体 girk G 蛋白 Gα Gβγ

G蛋白偶联内向整流钾通道亚基2在海人酸致痫大鼠海马内的表达变化

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G蛋白偶联内向整流钾通道亚基2在海人酸致痫大鼠海马内的表达变化

作者：王煜中南大学

学位级别：硕士

目的：G蛋白偶联内向整流钾通道(girk)在哺乳动物中枢神经系统内广泛分布，在脑内由girk1和girk2形成四聚体，并且与多种受体偶联，通过突触后抑制维持神经元静息电位和调节神经元兴奋性。Weaver小鼠由于girk2基因点突变产生自发性癫痫;... 详细信息

目的：G蛋白偶联内向整流钾通道(girk)在哺乳动物中枢神经系统内广泛分布，在脑内由girk1和girk2形成四聚体，并且与多种受体偶联，通过突触后抑制维持神经元静息电位和调节神经元兴奋性。Weaver小鼠由于girk2基因点突变产生自发性癫痫;girk2基因敲除鼠对致痫剂的敏感性大大提高。本研究应用海人酸颞叶癫痫大鼠模型，在国内外首次观察了癫痫急、慢性期girk2 mRNA和蛋白在海马表达的时空变化，初步探讨了girk通道在癫痫发生发展中的作用。方法：1．随机将体重为180～220g的6～8周龄健康雄性SD大鼠112只分为：模型组(n=70)、对照组(n=42)，应用海人酸(KA，14mg/kg)腹腔注射法制作颞叶癫痫模型。选取腹腔注射后3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、7天、30天为研究的时间点。 2．原位杂交检测不同时间点海马齿状回(DG)、CA3、CA1区girk2 mRNA的表达。 3．免疫细胞化学检测不同时间点DG、CA3、CA1区girk2蛋白的表达。结果：1．本实验海人酸颞叶癫痫模型的制作成功率为80％，与文献报道的模型制作成功率(84％)相符。模型制作成功的大鼠均出现癫痫持续状态和慢性自发发作;未引出癫痫持续状态的大鼠没有慢性自发发作;对照组未出现癫痫发作。中肉人。’／湘徘卜ital颀卜。y付沦义中义仰片 *** mRNA和蛋白在大鼠海马内分布广泛，表达丰富;不同解剖结构表达强弱小同。 3．癫痈模型组海人酸腹腔注射后，girkZ mRNA在海马DG区表达逐渐增多，在12小时和24小时到达高峰，与对照组比较差异有显著性意义（尸＜***人此后逐渐下降，但仍高于对照组，无显著。叶差异;在3O大时间点又达至高峰（尸＜O．01）。 4．海人酸致痫大鼠海马内的girkZ蛋白表达差异不明显，仅DG区在盼大时间点与对照组比较增高有显著性意义（／O．01入结论：girkZI。NA和蛋白在正常大鼠海马内分布广泛，表达丰富;在海人酸致痈大鼠海马内的表达增高，尤以齿状回为甚，提示GIAnZ 的增高是机体对神经元网络过度兴奋的代偿或适应性反jk，其合成增加将降低神经元的兴奋性，阻止海马内过度兴奋的扩散。

关键词：颞叶癫痫 girk 海马

G蛋白偶联内向整合钾通道在自发癫痫大鼠模型和震颤大鼠海马内的表达

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G蛋白偶联内向整合钾通道在自发癫痫大鼠模型和震颤大鼠海马内的...

作者：王丽娜中国医科大学

学位级别：硕士

前言研究表明有30-40%的癫痫病因与遗传因素有关,随着人类基因组计划的实施完成和研究手段的不断进步,对遗传性癫痫与基因变异关系的研究逐渐增多,研究显示至少有18个不同基因位点的突变与癫痫病的发生有关。 girk通道(G蛋白调节的内... 详细信息

前言研究表明有30-40%的癫痫病因与遗传因素有关,随着人类基因组计划的实施完成和研究手段的不断进步,对遗传性癫痫与基因变异关系的研究逐渐增多,研究显示至少有18个不同基因位点的突变与癫痫病的发生有关。 girk通道(G蛋白调节的内向整合钾通道)作为IRK(内向整合钾通道)家族的成员,对神经兴奋的调节起重要作用。girk通道至少由5个亚型构成,依次为girk1-girk5(Kir3.1-Kit3.5)。有证据显示girk通道由同源四聚体或异源四聚体构成的络合物,动物体内girk1-girk4亚型在中枢神经系统(CNS)和心肌组织中有不同的表达。其中,girk1/2主要分布在CNS,它对维持突触后神经元的静息电位和神经兴奋性起重要作用。已经有研究证实girk2蛋白基因点突变可能与癫痫的自发性发作有关。有人在Weavor鼠中发现girk2蛋白的点突变导致构成非选择性激活离子通道,突变的通道可能通过影响膜的静息电位而改变细胞的电生理活性。另外,在1997年Signorini和助手培养了缺乏girk2的突变鼠。与Weavor鼠相似的是,它们对自发性或药物诱导癫痫发作更敏感,表现为girk1和girk2表达的显著减少。证明girk2蛋白的缺失可引起自发性癫痫。以上证据说明girk蛋白的基因变异与girk通道功能异常和癫痫发作有密切关系。本实验应用RT-PCR法在基因水平检测tremor鼠和SER海马组织中girk1和girk2的表达,分析girk1及girk2的表达变化与大鼠癫痫发作的关系,探讨其在癫痫发生发展中的作用。

关键词：癫痫 girk 海马逆转录聚合酶链反应

小鼠心肌细胞中的G蛋白门控内向整流钾通道及其功能

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小鼠心肌细胞中的G蛋白门控内向整流钾通道及其功能

作者：杨冀杰河北医科大学

学位级别：硕士

G蛋白门控内向整流钾离子通道(G protein gated inwardly rectifying K channels, girk)是内向整流钾通道家族中的一员(Kir3),它有四个亚型,分别为girk1、girk2、girk3、girk4。girk通道广泛分布于心脏和神经组织中。G蛋白偶联受体可通... 详细信息

G蛋白门控内向整流钾离子通道(G protein gated inwardly rectifying K channels, girk)是内向整流钾通道家族中的一员(Kir3),它有四个亚型,分别为girk1、girk2、girk3、girk4。girk通道广泛分布于心脏和神经组织中。G蛋白偶联受体可通过影响通道的开放与关闭进而影响心肌细胞、神经细胞以及神经内分泌细胞等的功能。在哺乳动物体内,girk1和girk4主要分布于心房肌细胞和窦房结细胞,对调节心脏兴奋性起重要作用,是心肌内向整流钾电流IKACh的分子基础。心脏中分布着交感神经与迷走神经纤维,迷走神经兴奋释放递质乙酰胆碱(Acetylcholine, Ach),与心肌细胞上的M2受体结合,激活相偶联的对PTX敏感的Gi蛋白,GTP与Gα亚基结合,同时Gβγ与Gα?GTP解离,Gβγ直接激活girk导致通道开放,随后具有GTP酶活性的Gα水解GTP,Gβγ再与Gα?GDP结合导致girk的失活。这一系列反应被认为是许多与百日咳毒素(PTX)敏感G蛋白(Gi/Go)相偶联的受体激活girk主要通路。girk兴奋引起窦房结、心房等部分的细胞膜电位发生超极化,使心率减慢,这是心脏迷走神经影响心肌兴奋性的分子基础。对心室肌细胞是否存girk以及girk对心室肌细胞兴奋性的贡献存在争议,有报道在一些动物心室肌细胞中发现有girk通道的表达,而其他报道则持相反的意见,而对心室肌细胞中girk通道的功能则所知甚少。关于调控心肌细胞静息膜电位的IK1电流的分子基础,传统的观点认为是经典的内向整流钾通道IRK,而对于象IRK一样同样具有内向整流特性的girk是否也参与了对心肌细胞静息膜电位的调控则少有报道。因此,本研究将探讨girk在小鼠心室肌细胞中的表达以及其在对包括静息膜电位在内的心肌兴奋性调控中的作用。在上述研究的基础上,我们将进一步研究girk在心衰小鼠心室肌细胞中的改变。目的:研究小鼠心室肌细胞中girk1/4通道的表达及功能;研究心衰时心室肌细胞中girk1/4通道表达及功能的改变;研究小鼠心室肌细胞基础内向整流钾电流对Ba2+的敏感性。方法:利用腺苷激活心肌girk通道。腺苷(adenosine)通过与其A1受体结合,激活相偶联Gi蛋白进而激活girk通道。利用adenosine对girk电流的激活,tertiapin-Q对girk电流特异性阻断,以及Ba2+对内向整流钾电流的阻断作用,对心肌细胞中的内向整流钾电流进行研究。利用全细胞膜片钳技术,记录小鼠心室内外膜下肌细胞中的girk电流;利用Western blot技术观察小鼠心肌细胞中是否表达girk1和girk4蛋白;利用免疫荧光技术观察girk1和girk4在小鼠心房肌细胞、小鼠心室外膜下、内膜下细胞上的表达。通过主动脉弓结扎,制备心衰小鼠模型,然后利用上述方法观察心衰后心肌细胞girk的改变。利用Ba2+对IK1和girk电流的不同敏感性鉴别IK1和girk对内向整流钾电流的相对贡献。结果:(1)应用Langendorff方法分离正常小鼠心肌细胞,用全细胞膜片钳分别记录正常小鼠心室心内膜下、心外膜下肌细胞电流。我们首先观察了胆碱受体激动剂oxo-M的作用,oxo-M可激活M2受体而激活girk通道,但是oxo-M的作用不专一,它还可以与M1受体结合,最终可导致girk的抑制。Adenosine可以通过其A1受体激活girk,本实验主要选用adenosine为激活剂。在分离的小鼠心室肌细胞,膜电位从-40 mV到-120 mV诱发了明显的内向电流,而在-40 mV以上的去极化电位激活了外向电流,此外向电流应为外向钾电流,不是本研究的研究内容。我们首先验证记录到的内向电流是内向整流钾电流,基础背景内向电流曲线呈内向整流电流特征,且可以被500μM Ba2+全部抑制,由此得出的内向电流的翻转电位在-80 mV左右,与通过Nernst方程计算得到的K+平衡电位-82.3 mV相符,说明记录到的基础内向电流是内向整流钾电流。10μM adenosine引起内向整流电流增加,加入girk特异型阻断剂tertiapin-Q 10 nM后,adenosine激活的电流被抑制。500μM Ba2+可以将基础和adenosine激活的电流完全阻断。上述结果表明adenosine可以在小鼠心室肌激活girk电流。统计学结果表明在测试的所有小鼠心室肌细胞中,10μM adenosine使心内膜、外膜下细胞的内向整流电流分别增加了22.3%±3.9和49.6%±23.1 (相对于基础电流)。而将心室内膜、外膜下细胞的电流经细胞体积(电容)计算电流

关键词： G蛋白偶联受体 girk 内向整流钾电流功能表达

G蛋白耦联的内向整流型钾离子通道基因与其相关性疾病的关系

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中华生物医学工程杂志 2012年第2期18卷 166-168页

作者：康永安胡燕荣李南方新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心830001 新疆高血压研究所

目前已知G蛋白耦联的内向整流型钾离子通道（girk）有5个成员（girk1-5），其中girk1-4已在哺乳动物体内发现，并得到相应的克隆体，分别由KCNJ3、6／7、9、5所编码。近年研究发现girk基因在人体内多种组织器官均有表达，并发现girk基... 详细信息

目前已知G蛋白耦联的内向整流型钾离子通道（girk）有5个成员（girk1-5），其中girk1-4已在哺乳动物体内发现，并得到相应的克隆体，分别由KCNJ3、6／7、9、5所编码。近年研究发现girk基因在人体内多种组织器官均有表达，并发现girk基因的异常表达与心血管、神经系统、肿瘤、代谢及内分泌、血液等多个系统性疾病的发生密切相关。

关键词：离子通道基因 G蛋白耦联钾离子通道相关性疾病流型内向动物体内 girk

中枢神经系统G-蛋白激活的内向整流型钾通道

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国外医学（生理病理科学与临床分册） 2002年第2期22卷 165-167页

作者：王永久由振东等第二军医大学神经生物教研室，上海200433

G 蛋白激活内向整流型钾通道 (girk)是内向整流钾通道超家族的七个成员之一 ,是目前发现的唯一能够与G 蛋白的 βγ亚基直接相互作用而被激活的离子通道。girk在中枢神经系统内广泛分布 ,具有维持神经元的静息膜电位、调节神经元的兴奋... 详细信息

G 蛋白激活内向整流型钾通道 (girk)是内向整流钾通道超家族的七个成员之一 ,是目前发现的唯一能够与G 蛋白的 βγ亚基直接相互作用而被激活的离子通道。girk在中枢神经系统内广泛分布 ,具有维持神经元的静息膜电位、调节神经元的兴奋性和神经递质释放的重要作用。girk2通道异常的Weaver小鼠和girk2基因敲除的小鼠均有癫痫发作 ,且Weaver小鼠还表现出神经发育异常 ,因此深入研究girk在中枢神经系统的生理和病理意义。

关键词： girk 中枢神经系统生理学突变