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聊城大学学报（自然科学版） 2022年第3期35卷 78-85页

作者：张秀飞李清平孙雯雯陈新王璐文赵庆臻聊城大学生命科学学院山东聊城252059

gid/CTLH复合体是真核细胞中特有的具有E3泛素连接酶活性的大分子量蛋白复合体,深入分析其结构与功能具有重要的生物学意义。酵母gid复合体能帮助细胞快速应对微环境中营养状态的改变,同时在糖代谢调控中发挥重要作用;哺乳动物中的CTLH... 详细信息

gid/CTLH复合体是真核细胞中特有的具有E3泛素连接酶活性的大分子量蛋白复合体,深入分析其结构与功能具有重要的生物学意义。酵母gid复合体能帮助细胞快速应对微环境中营养状态的改变,同时在糖代谢调控中发挥重要作用;哺乳动物中的CTLH复合体能够迅速接收细胞外的不同信号,协调细胞发生可逆的变化,从而适应不断变化的环境,同时该复合体也涉及细胞内多个不同的生理途径的调控。本文综述了gid/CTLH复合体蛋白亚基的结构域、组成及功能的研究进展,旨在为该蛋白复合体的深入研究提供理论基础。

关键词： gid复合体 CTLH复合体泛素连接酶亚基组成生物学功能

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拟南芥GCIA2调节碳水化合物合成及ABA响应的功能分析

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作者：张秀飞聊城大学

学位级别：硕士

泛素蛋白酶体系统(UPS)是真核生物选择性降解蛋白质的快速调控机制,UPS在调节植物生长发育和非生物胁迫响应中具有重要作用。RING类型泛素连接酶E3是该系统的关键组分之一。果糖1,6-二磷酸酯酶(FBPase)是糖代谢的关键酶。已知酵母中的FB... 详细信息

泛素蛋白酶体系统(UPS)是真核生物选择性降解蛋白质的快速调控机制,UPS在调节植物生长发育和非生物胁迫响应中具有重要作用。RING类型泛素连接酶E3是该系统的关键组分之一。果糖1,6-二磷酸酯酶(FBPase)是糖代谢的关键酶。已知酵母中的FBPase会通过UPS降解,gid复合体是负责其泛素化修饰的E3;该复合体中具有RING结构域的gid2和gid9亚基承担其E3活性。同源分析表明酵母gid2/gid9在拟南芥中有四个同源基因(GCIA1/2/3/4),本论文主要从体内和体外两个方面对GCIA2的基因功能进行分析。首先利用原核系统表达纯化GCIA2蛋白,并进行体外泛素化反应分析其E3活性,但未出现阳性结果,这可能是原核细胞中缺乏翻译后修饰的原因;随后又在烟草中瞬时表达并纯化GCIA2蛋白,但仍未检测到E3活性。由于已报道的酵母及人细胞中gid2/gid9的E3活性均是在gid复合体形式下检测到的,因此拟南芥GCIA2也可能需要与gid复合体的其他亚基结合在一起才能检测到活性,我们将会继续进行这方面的实验分析。亚细胞定位分析表明GCIA2主要定位在细胞核和细胞质中;表达模式分析发现GCIA2在茎生叶和成熟角果中的表达量明显高于其他组织,且ABA和高盐胁迫能够诱导GCIA2表达。为了分析GCIA2在植物体内的功能,我们首先鉴定了该基因的三个T-DNA插入突变体gcia2、gcia2-2和gcia2-3;为了避免基因冗余对基因功能分析的影响,我们以gcia2单突变体为基础,通过常规植物杂交等方法创建了gcia1 gcia2、gcia2 gcia3和gcia2 gcia4的纯合双突变体;同时构建了GCIA2高表达和功能互补的纯合转基因拟南芥。利用这些遗传材料来初步解析拟南芥GCIA2基因功能。已知酵母gid2作为gid复合体中的关键E3活性组分来调控FBPase的泛素化修饰及其降解。拟南芥有两个功能性的FBPase:胞质FBPase(cyFBPase)和叶绿体FBPase(cp FBPase),均是植物碳水化合物合成的关键酶,对植物的生长发育具有极其重要的作用。为了验证在拟南芥中GCIA2是否参与FBPase的泛素化降解,我们首先对gcia2突变体进行糖相关的表型分析,发现gcia2突变体在无糖条件下能正常萌发,但部分幼苗萌发后出现生长停滞,此表型说明GCIA2的基因功能可能确实与植物体内糖的代谢或信号调控相关;Pull-down及Co-IP结果也显示GCIA2与cyFBPase和cp FBPase均有相互作用;但幼苗中两种FBPase的蛋白含量和降解速率在野生型与gcia2中均无明显差异,说明GCIA2突变并未影响两种FBPase的蛋白水平及其稳定性。综合以上结果,拟南芥中GCIA2基因的功能与其酵母同源基因gid2有所差别,其主要功能可能并不是调控拟南芥两种FBPase的泛素化降解。不过也有可能是由于基因冗余导致未能检测到gcia2与野生型中的两种FBPase的差别,未来工作中将利用相关双突变体及多突变体材料继续进行分析。由于ABA和高盐胁迫均能诱导GCIA2基因的表达,而且糖信号与ABA信号转导有明显的crosstalk;ABRC网站信息显示GCIA2的同源基因GCIA1与ABA信号通路关键调节因子SnRK2.3共表达,因此推测GCIA2可能也会影响ABA信号通路,进而影响干旱响应。表型分析发现gcia2突变体对ABA更加敏感,且GCIA2的突变主要影响萌发后幼苗根的伸长;另外,相对于野生型,gcia2对干旱胁迫的耐受性明显降低。GST pull down实验证明GCIA2与SnRK2.3有相互作用,因此GICA2很可能通过调节SnRK2.3的作用来影响ABA信号传导及干旱胁迫的响应。另外,已知SnRK1是拟南芥胁迫和能量转导的中心整合者,其过表达拟南芥也与gcia2突变体相似对ABA更加敏感,因此推测GCIA2的功能也许与SnRK1.1的功能也有关系,对GCIA2与SnRK1.1的体外GST pull-down分析表明两者之间确实存在相互作用。综上所述,拟南芥GCIA2可能会通过调控SnRK1.1和SnRK2.3进而影响植物对ABA和干旱的响应以及能量代谢过程。

关键词： gid复合体 GCIA2 果糖1,6-二磷酸酯酶脱落酸 SnRK2

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