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Theoretical Study on the Mechanism of Aromatic-Ring-Cleavage Activity by Gentisate-1,2-dioxygenase

Theoretical Study on the Mechanism of Aromatic-Ring-Cleavage...

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中国化学会第十二届全国物理有机化学学术会议

作者： Qiuxian Li Qing’An Qiao Lixiang Sun Honglan Cai Xiaofang Qin School of Chemistry and Materials Science Ludong University

Gentisate-1,2-dioxygenase（gdo） is one type of nonheme iron enzyme which belongs to the cupin *** catalyzes a number of oxidative C-C bond cleavage reactions in the biodegradation of toxic and xenobiotic compounds.A biomimetic iron（II） complex,[（hydrotris（3,5-diphenylpyrazole-1-yl）borate）FeII（hydrotris（3,5-diphenylpyrazole-1-yl）borate）],which represents a functional model of gdo was investigated by Density Function Theory（DFT）.The iron（II） 1,4-dihydroxy-2-naphthoate complex combined with dioxygen to generate the corresponding iron（III） species,and then another dioxygen will be added to form an iron（III） superoxide *** superoxide can attack the C1 carbon of the carboxysemiquinonato group to form an alkylperoxide *** p-hydroxy group on the aromatic ring passes by the O-O cleavage of the alkylperoxo intermediate to form an anhydride intermediate through ***,the metal-coordinated hydroxide participates in the hydrolysis of the anhydride species to afford the ring cleavage product.

关键词： gdo Mechanism Aromatic-Ring-Cleavage Activity

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石杉碱甲溶致液晶制剂的研究

石杉碱甲溶致液晶制剂的研究

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作者：郭偲湖北中医药大学

学位级别：硕士

阿尔茨海默症(简称AD)是一种潜伏期长、起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病,临床上症状主要表现为记忆障碍,认知和运动能力受损,人格行为改变的全面性痴呆。通常发病于老年人群体,是当今世界上威胁老年人身体健康的一个重要因素... 详细信息

阿尔茨海默症(简称AD)是一种潜伏期长、起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病,临床上症状主要表现为记忆障碍,认知和运动能力受损,人格行为改变的全面性痴呆。通常发病于老年人群体,是当今世界上威胁老年人身体健康的一个重要因素。目前研究发现,导致AD的主要原因是神经细胞的损失或退化,特征性病理改变为淀粉样斑块和神经纤维缠结[1]。石杉碱甲(Huperzine-A)是1986年由我国科学家首次从中国石杉科植物蛇足石杉所提取的倍半萜天然生物碱,是一种可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChE),常用来缓解疼痛、解毒以及缓解肿胀。石杉碱甲能有效穿过血脑屏障,在治疗AD、改善记忆和认知的作用等方面具有显著疗效[2]。目前市售的石杉碱甲制剂有片剂、胶囊剂和(肌肉内)注射剂等剂型。片剂及胶囊剂均在体内消除较快,而注射剂经肌肉注射会造成一定疼痛感,患者顺应性差,且市售制剂均需每日给药,认知记忆障碍的患者会难以按时服用或注射。为了延长药物在给药部位的滞留性,减少给药次数提高患者顺应性,提高药物的生物利用度达到缓释及局部给药的目的,本课题制备研究了石杉碱甲(Huperzine-A)溶致液晶制剂,即是以高纯度二油酸甘油酯(gdo)和大豆磷脂(SPC)作为液晶材料、少量无水乙醇作为溶剂、石杉碱甲作为主药,研制出石杉碱甲溶致液晶制剂。采用匀速旋转混合法制备石杉碱甲溶致液晶制剂,通过抗稀散性初步筛选处方组成范围,通过通针性实验进一步缩小其处方中各成分的适宜浓度范围,再通过流变学来进行其注射性能的考察,结果发现石杉碱甲溶致液晶制剂和空白溶致液晶制剂其注射性能良好。通过偏光显微镜对不同SPC和gdo比例的石杉碱甲溶致液晶制剂进行刚吸水、吸水溶胀一天及充分溶胀后三个时间点的偏光纹理的观察,结果发现不同SPC和gdo比例的石杉碱甲溶致液晶制剂其偏光纹理并不相同,具有一系列的相变化行为。建立石杉碱甲溶致液晶制剂含量测定的方法,采用高效液相色谱法测定药物含量,通过精密度试验、重复性试验以及回收率试验检测,显示该检测方法精密度好,方法测定结果符合规定。体外释放实验采取pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS7.4溶液)作为制剂溶出的释放介质进行无膜释放,结果表明:SPC:gdo=70:30时的石杉碱甲溶致液晶制剂在168小时体外累积释放率可达93.29%。具有一定的缓释作用,释放曲线符合Ritger-Peppas模型:LnQ=0.50984Lnt-1.0289,r2=0.98771,特征指数n=0.50269,即0.45

关键词：石杉碱甲 SPC gdo 溶致液晶释放质量评价

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中度嗜盐菌Martelella ***-3龙胆酸1，2-双加氧酶的表达、纯化及功能研究

中度嗜盐菌Martelella ***-3龙胆酸1，2-双加氧酶的表达、纯化及...

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作者：黄玲华东理工大学

学位级别：硕士

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是油田污染土壤中广泛存在的“三致”化合物,油田PAHs的污染土壤通常具有高盐,高pH和PAHs浓度高等特点,将非嗜盐的PAHs高效降解菌引入到盐碱环境中去除PAHs的效果往往不理想。针对盐... 详细信息

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是油田污染土壤中广泛存在的“三致”化合物,油田PAHs的污染土壤通常具有高盐,高pH和PAHs浓度高等特点,将非嗜盐的PAHs高效降解菌引入到盐碱环境中去除PAHs的效果往往不理想。针对盐碱土壤PAHs污染生物修复效率较低的现状,采用中度嗜盐PAHs高效降解菌的生物降解方法日益受到关注,阐明中度嗜盐菌降解PAHs的机理及关键降解酶的催化机制是应用该菌实现生物强化修复的前提。本研究以盐碱条件下能够降解多种PAHs的中度嗜盐菌Martelella ***-3为研究对象,在基因组测序基础上,利用特异性引物克隆了龙胆酸1,2-双加氧酶(Gentisatel,2-dioxygenase, gdo)基因,并实现其在大肠杆菌***21(DE3)中成功诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白gdo,并对其进行了酶学性质的分析;同时通过在高盐度下以PAHs为唯一碳源和低盐度下以甘油为唯一碳源的不同条件下培养AD-3菌,结合Label-Free技术分析不同培养条件下菌株中蛋白的差异表达;最后基于CRISPR-Cas9构建菌株AD-3基因敲除体系,并利用该体系敲除gdo基因。主要结论如下：(1)以AD-3菌基因组DNA为模板,PCR扩增获得1,077 bp的gdo基因,该基因在***21(DE3)中成功表达,纯化的gdo经变性凝胶电泳和非变性凝胶电泳结果显示大小分别约为38 kDa和120 kDa,该结果表明gdo为同源三聚体;gdo在pH 7.0,30℃,盐度12%条件下具有最佳活性,该酶对龙胆酸的Km和kcat值分别是26.64μM和161.29 s-1;基于同位素标记方法,首次发现gdo催化龙胆酸的两个氧原子分别来自于H20和02的加氧机制;利用基因定点突变将gdo中高度保守的四个组氨酸分别突变为不携带电荷的赖氨酸,突变体蛋白全部失活,充分证明了四个组氨酸的重要性。(2)基于差异蛋白质组学分析不同培养条件下AD-3菌的蛋白表达差异,共识别出上调的蛋白187个,与PAHs降解相关蛋白16个,与嗜盐相关的蛋白8个。结合AD-3菌全基因组序列和差异蛋白数据,上调蛋白中与PAHs降解相关的关键酶-PAHs起始双加氧酶的a和p亚基,表达量分别上调149.7倍和41倍;嗜盐相关上调蛋白主要包括相容性溶质甘氨酸甜菜碱合成关键蛋白上调19.1倍,以及甘氨酸甜菜碱转运相关关键蛋白Transpotor ABC上调6.6倍。(3)基于CRISPR-Cas9构建gdo基因的敲除质粒pTC-gdo-3580,将该质粒电转至AD-3菌中,用氨苄抗性筛选获得转化子,经过IPTG诱导获得突变菌株AD-3-pCT-gdo-3590。与野生型AD-3菌能够利用龙胆酸为唯一碳源且观察到明显颜色变化相比,突变株未观察到明显生长和颜色变化,初步证明gdo基因敲除成功,该敲除体系为探索AD-3菌中为更多未知基因功能提供有力的工具。

关键词：中度嗜盐菌微生物降解 gdo 差异蛋白质组学 CRISPR/Cas体系

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