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Igf2甲基化及其信号通路在典型生殖毒物致gc-2细胞凋亡中的作用

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Igf2甲基化及其信号通路在典型生殖毒物致GC-2细胞凋亡中的作用

作者：李晓青杭州师范大学

学位级别：硕士

目的:1.探讨典型生殖毒物AsO和二氯二苯基二氯乙烷(p,p’-dichlorodiph enoxydichloroethylene,p,p’-DDE)对小鼠精母细胞(gc-2细胞)凋亡的影响。2.明确胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2,Igf2)差异甲基化区域(d ifferentially methylated region,DMR)甲基化在AsO和p,p’-DDE致gc-2细胞凋亡中的作用。3.阐明IGF2信号通路在AsO和p,p’-DDE致gc-2细胞凋亡中的作用。方法:用不同浓度的AsO(3、4、5μmol/L)或p,p’-DDE(6、12、18μmol/L)对gc-2细胞染毒24h,分别用50μmol/L叶酸或10mmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)、25μg/L IGF2蛋白、40μg/ml磷脂酰肌醇-3激酶激活剂(740Y-P)、4μg/ml Akt磷酸化激活剂(SC79)预处理1h,然后与5μmol/L AsO或18μmol/L p,p’-DDE共暴露24h。采用CCK8法测定细胞活性,用Hoechst染色法和流式细胞术检测细胞凋亡水平,用重亚硫酸盐测序检测gc-2细胞Igf2 DMR2甲基化水平;Western blot检测DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)、IGF2、IGF1R蛋白水平和磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)磷酸化水平。数据以均值±标准差表示,计数资料采用单因素方差分析进行检验,计量资料采用卡方检验。结果:***和p,p’-DDE可下调gc-2细胞活力,诱导gc-2细胞凋亡。***和p,p’-DDE可下调DNMT1蛋白表达和Igf2 DMR2甲基化水平,叶酸和NAC可拮抗AsO和p,p’-DDE所致的gc-2细胞Igf2 DMR2甲基化水平下降、细胞凋亡。***和p,p’-DDE可下调IGF2蛋白表达及PI3K和Akt蛋白磷酸化水平,上调IGF1R蛋白表达;IGF2蛋白、740Y-P和SC79可拮抗AsO和p,p’-DDE处理gc-2细胞的活力降低和细胞凋亡。结论:Igf2甲基化及其信号通路在典型生殖毒物AsO和p,p’-DDE致gc-2细胞凋亡中发挥重要作用。

关键词： As2O3 p,p’-DDE IGF2信号通路 Igf2 甲基化 gc-2细胞细胞凋亡

IGF2信号通路在As_(2)O_(3)致gc-2细胞凋亡中的作用

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毒理学杂志 2023年第5期37卷 452-454,F0003页

作者：李晓青王烁吴京京王莉军吴威李淑祺慎恬吴誉黄珂昕宋杨杭州师范大学浙江杭州311121

砷是一种天然类金属化学元素,广泛存在于自然界中,是世界卫生组织公布的引起重大公共关注的10种危害环境与健康的化学品之一^([1])。砷也是一种雄性生殖毒物,可以下调精子质量^([2])。流行病学报告显示,饮用水中砷含量超标导致男性血液... 详细信息

砷是一种天然类金属化学元素,广泛存在于自然界中,是世界卫生组织公布的引起重大公共关注的10种危害环境与健康的化学品之一^([1])。砷也是一种雄性生殖毒物,可以下调精子质量^([2])。流行病学报告显示,饮用水中砷含量超标导致男性血液和精液中砷含量明显升高,并造成男性精子数量和精子存活率的下降[3-4]。动物实验也发现,慢性砷暴露降低小鼠精子质量[5-6]。IGF2(胰岛素样生长因子2)信号通路是与男性生殖关系密切的信号通路.

关键词： As_(2)O_(3) IGF2/IGF1R信号通路 gc-2细胞细胞凋亡

磷酸三苯酯和磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯对小鼠精母细胞DNA损伤和细胞周期的影响

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环境卫生学杂志 2024年第3期14卷 226-232,246,F0003页

作者：丰一兴段鹤君崔霞北京市疾病预防控制中心/食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室北京100013

目的探讨不同剂量的磷酸三苯酯(TPhP)和磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)对小鼠精母细胞DNA损伤和细胞周期的影响。方法选取小鼠精母细胞(gc-2)为细胞模型,经TPhP和TDCPP(0、3、10、30和50μmol/L)染毒48 h后,利用CCK-8方法检测gc-2... 详细信息

目的探讨不同剂量的磷酸三苯酯(TPhP)和磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(TDCPP)对小鼠精母细胞DNA损伤和细胞周期的影响。方法选取小鼠精母细胞(gc-2)为细胞模型,经TPhP和TDCPP(0、3、10、30和50μmol/L)染毒48 h后,利用CCK-8方法检测gc-2的细胞存活率,采用高内涵分析系统检测TPhP和TDCPP对细胞核碎片化程度、磷酸化组蛋白(pH2AX)、DNA同源重组修复蛋白(Rad51)及细胞周期等参数的影响。实时荧光定量PCR法分析精母细胞生长发育关键调控基因,包括环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB-1)、抑制素-α (inhibin-α)、粘连蛋白2(nectin-2)和增殖标记蛋白(Ki67)mRNA的表达水平。结果与对照组相比,30和50μmol/L TPhP和TDCPP均显著降低gc-2细胞存活率(P细胞核碎片化程度加剧(P2AX在10、30和50μmol/L TPhP组及TDCPP组均显著升高(P细胞周期分析显示,TPhP主要将细胞阻滞在G0/G1期,而TDCPP主要将细胞阻滞在G0/G1期和G2/M期。荧光定量PCR结果可见,与对照组相比,TPhP(30和50μmol/L)和TDCPP(10、30和50μmol/L)抑制精母细胞生长发育关键基因(CREB-1、inhibin-α、nectin-2和Ki67)的表达(Pgc-2细胞DNA损伤和细胞周期阻滞,并最终影响精母细胞的生长发育。

关键词：磷酸三苯酯磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯 gc-2细胞 DNA损伤细胞周期

双酚A致雄性生殖损害毒性通路的富集分析及关键凋亡信号通路的实验研究

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第三军医大学学报 2021年第1期43卷 38-44页

作者：袁文博刘文斌陈洪强柴子力张光辉曹佳新乡医学院公共卫生学院河南新乡453001 陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系毒理学研究所重庆400038

目的探讨低剂量双酚A(bisphenol A,BPA)暴露导致的雄性生殖损伤中可能涉及的关键毒性通路。方法利用比较毒理基因组学数据库(Comparative Toxicogenomics Database,CTD)筛选BPA毒性相关基因,对其进行功能富集,探索可能的作用通路,确认... 详细信息

目的探讨低剂量双酚A(bisphenol A,BPA)暴露导致的雄性生殖损伤中可能涉及的关键毒性通路。方法利用比较毒理基因组学数据库(Comparative Toxicogenomics Database,CTD)筛选BPA毒性相关基因,对其进行功能富集,探索可能的作用通路,确认相关通路中的关键基因。采用终浓度为0(DMSO对照组)、20、40、80μmol/L BPA处理小鼠精原细胞株gc-2细胞72 h,观察细胞形态并检测凋亡发生率,采用RT-qPCR和Western blot检测关键基因mRNA和蛋白表达水平。结果通过对CTD数据库中BPA相关的疾病进行筛选,得到1460个相关基因,GO富集分析发现这些基因在生殖系统发育、生殖结构发育等分子生物过程中有明显富集,KEGG富集分析发现其在HIF-1和PI3K-Akt等信号通路中有明显富集(P2。BPA染毒gc-2细胞,发现凋亡率上升,且存在剂量-效应关系(P2上调(P2的蛋白水平下调,P53则上调(Pgc-2细胞凋亡过程中可能发挥重要作用。

关键词：双酚A 比较毒理基因组学数据库 gc-2细胞细胞凋亡 PI3K-Akt信号通路男性泌尿生殖系统疾病

RNA甲基化在双酚S致雄性生殖损伤中的作用研究

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RNA甲基化在双酚S致雄性生殖损伤中的作用研究

作者：李景芝新乡医学院

学位级别：硕士

研究背景近年来,全球广泛使用的增塑剂双酚A对人类健康的危害已引起高重度视,并被许多国家全面禁用。目前市场上已有BPS、BPF等新兴增塑剂开始作为替代品使用,其中BPS应用最广泛,在人群中的暴露水平及检出率也较高。研究发现动物以及人... 详细信息

研究背景近年来,全球广泛使用的增塑剂双酚A对人类健康的危害已引起高重度视,并被许多国家全面禁用。目前市场上已有BPS、BPF等新兴增塑剂开始作为替代品使用,其中BPS应用最广泛,在人群中的暴露水平及检出率也较高。研究发现动物以及人类接触BPS对生殖系统都有许多不良影响,但具体作用机制尚未明确。我们前期的研究表明暴露于环境毒物可使N6甲基腺苷RNA甲基化的总体水平发生变化,并改变RNA甲基化调节基因的表达。FTO/YTHDF1作为一种非常重要的RNA去甲基化酶/RNA甲基化识别蛋白,与生殖发育多种生物学过程密切相关。结合最新文献报道,我们拟探索BPS暴露致小鼠生殖细胞损伤过程中,FTO/YTHDF1是否通过调控下游关键分子的动态平衡而潜在地影响男性生殖功能。为此,本研究采用生信分析结合小鼠生殖系统的小鼠睾丸精母细胞gc-2、间质细胞TM3细胞进行实验研究,探讨BPS暴露诱导雄性生殖细胞损伤过程中RNA甲基化介导的下游调控通路关键分子的表观遗传调控作用及其具体机制。本研究将从表观遗传调控的角度为寻找更敏感的雄性生殖损伤分子标志物提供新思路。研究目的1.探索BPS导致雄性生殖细胞损伤的关键通路和基因。2.明确RNA去甲基化酶FTO调控细胞凋亡和细胞周期信号通路在BPS致小鼠精母细胞毒性中的作用及分子机制。3.明确RNA甲基化识别蛋白YTHDF1调控细胞凋亡和细胞周期信号通路在BPS致小鼠间质细胞毒性中的作用及分子机制。材料方法1.使用CTD数据库筛选出与BPA、BPS所致雄性泌尿生殖系统毒性相关的基因,并对相关基因进行交集,在R语言中将上述基因集进行GO功能富集分析、KEGG信号通路富集分析以及可视化分析(Enrichment Map、cnetplot)。2.采用终浓度为0μmol/L(DMSO对照组)、10-10mol/L BPA和BPS处理gc-2/TM3/TM4细胞72 h,通过CCK-8法测定细胞活力。采用终浓度为0、20、40、80μmol/L BPS处理TM3细胞72 h,通过q RT-PCR、Western blot技术检测关键基因的m RNA和蛋白表达水平。3.采用终浓度为0、20、40、80、160、320μmol/L和0、20、40、80μmol/L的BPS分别处理gc-2和TM3细胞72 h,镜下观察细胞形态并拍照;采用CCK-8法检测细胞活力;通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期;采用比色法检测RNA甲基化的总体水平;通过Western blot技术检测METTL3、FTO、YTHDF1和细胞凋亡以及周期相关分子的蛋白表达水平。建立FTO/YTHDF1基因差异表达细胞模型,采用上述方法分析FTO/YTHDF1对gc-2/TM3细胞功能表型及关键分子的影响。通过RIP试剂盒检测YTHDF1与细胞凋亡和周期关键分子结合情况。4.采用的统计软件是SPSS 25.0软件。结果为三次实验结果的平均值,数据用平均值±标准偏差表示,采用t检验或单因素方差分析进行组间比较,分析对照组与实验组差异。P细胞损伤的作用通路和基因研究不同剂量BPA和BPS染毒gc-2、TM3和TM4细胞,随着染毒剂量增加,细胞凋亡率显著升高(Pgc-2细胞损伤过程中的作用及机制当BPS染毒浓度为160、320μmol/L时gc-2细胞存活率显著下降(P细胞凋亡率显著升高,凋亡相关分子P53、P21、Caspase9和Caspase3蛋白水平显著增加,BCL2的蛋白水平显著下调(P细胞周期阻滞在G1/S期,其相关分子Cyclin D1、CDK4、CDK2的蛋白水平显著下调(Pgc-2细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高,P53的蛋白水平显著上调和BCL2的蛋白水平显著下调(P细胞损伤过程中的作用及机制TM3细胞存活率随着BPS染毒浓度的升高呈下降趋势,细胞凋亡率显著升高,凋亡相关分子Caspase9、Caspase3和BAX蛋白水平显著增加,BCL2的蛋白水平显著下调(P细胞周

关键词：双酚S RNA去甲基化酶FTO RNA甲基化识别蛋白YTHDF1 gc-2细胞 TM3细胞

RNA m6A甲基化在DEHP暴露致小鼠精母细胞发生DNA损伤反应中的作用研究

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RNA m6A甲基化在DEHP暴露致小鼠精母细胞发生DNA损伤反应中的作用...

作者：付浩伟东南大学

学位级别：硕士

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)暴露可以导致雄性生殖毒性,影响精子发生过程。但目前关于DEHP暴露致雄性生殖毒性的研究主要集中在DEHP暴露对睾丸组织及生精细胞的氧化应激、凋亡的影响和对精子质量等的研究,对于DEHP致精子发生障碍的... 详细信息

邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)暴露可以导致雄性生殖毒性,影响精子发生过程。但目前关于DEHP暴露致雄性生殖毒性的研究主要集中在DEHP暴露对睾丸组织及生精细胞的氧化应激、凋亡的影响和对精子质量等的研究,对于DEHP致精子发生障碍的机制认识尚浅,不能深刻揭示DEHP暴露对生精细胞的影响,例如,减数分裂作为精子发生过程的重要一环,DEHP暴露对精母细胞生理过程有何影响尚不明确。N6-甲基腺苷(m6A)作为转录后修饰对调节基因表达至关重要,且已有研究表明m6A调控精子发生过程的正常进行,对精子发生而言不可或缺。但m6A在DEHP暴露致精母细胞损伤中的调控作用仍有待探索。本研究拟通过体外细胞实验,从表观遗传角度探讨m6A在DEHP诱导小鼠精母细胞基因毒性中发挥的作用,从而深入研究DEHP致精子发生障碍的毒作用机制。通过建立小鼠精母细胞gc-2的DEHP暴露模型,观察DEHP对gc-2细胞的DNA复制活性的影响,并结合对细胞周期、细胞内活性氧(ROS)检测,以了解DEHP对gc2-细胞的基因毒性,并探讨相应毒性机制;在此基础上,检测了gc-2细胞内DNA双链断裂(DSBs)的水平及细胞对DSBs的可能修复途径,进一步探索DEHP对gc-2细胞基因组的影响;并通过观测DEHP暴露gc-2细胞模型中总RNA的m6A甲基化修饰水平的改变,DEHP暴露对gc-2细胞内m6A相关蛋白表达的影响,分析DNA损伤相关RNA的m6A修饰水平变化与DEHP诱导DNA损伤反应(DEHP-induced DDR)之间的关系,以探讨RNA表观遗传在DEHP致gc-2细胞基因毒性中的作用机制。本研究的主要内容如下:一、DEHP暴露诱发gc-2细胞DNA双链断裂本研究使用小鼠精母细胞gc-2模型,给予50μM、100μM、200μM、300μM和400μM的DEHP暴露24h,通过对细胞增殖、活力的检测,探究DEHP对gc-2细胞的一般毒性效应;结合Ed U实验分析DEHP暴露对gc-2细胞的DNA复制活性的影响;进一步通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测DEHP暴露gc-2细胞内ROS水平;通过q PCR实验检测与细胞周期、DNA损伤反应(DDR)相关基因的m RNA表达量;通过Western Blot及细胞免疫荧光实验检测DDR相关的蛋白表达量及细胞内定位。实验结果表明,DEHP暴露显著抑制gc-2细胞的增殖能力,且经流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测,发现DEHP诱导gc-2细胞内产生大量的ROS,表明细胞内氧化应激水平升高。Ed U实验发现DEHP暴露导致gc-2细胞的DNA复制活性被显著抑制,表明DEHP可能对gc-2细胞的基因组稳定性及完整性有损害作用,基于此,本研究进一步通过流式细胞术检测了细胞周期,发现DEHP暴露导致gc-2细胞周期被阻滞在G0/G1期,过渡至S期的细胞量明显减少,表明gc-2细胞为了防止DEHP诱导的基因组损伤被传递下去,通过自身调节细胞周期,将细胞周期阻滞于G0/G1期对受损DNA进行修复。在进一步检测DEHP对基因组的损害后,发现gc-2细胞出现了DEHP暴露诱导的DSBs(DEHP-induced DSBs),并且RAD51及XRCC5两种修复因子由于DEHP的暴露而表达上调,并与DSBs标志物γH2AX出现共定位,表明在DEHP-induced DDR中同源重组(HR)和非同源末端结合(NHEJ)两种修复途径参与gc-2细胞对DEHP-induced DSBs的修复过程中。二、m6A参与gc-2细胞内DEHP-induced DNA损伤反应已有研究表明环境内分泌的干扰物暴露可影响组织细胞内m6A甲基化修饰水平,且m6A在DEHP及其代谢物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)致雄性生殖毒性中发挥作用,但具体作用机制仍不清楚。本研究通过Dot Blot实验检测DEHP暴露gc-2细胞的总RNA的m6A甲基化修饰水平;q PCR和Western Blot检测m6A相关调节因子的m RNA及蛋白表达水平;经免疫荧光实验检测m6A修饰的RNA、METTL3和YTHDC1与γH2AX的细胞内定位情况等来分析m6A在gc-2细胞内DEHP-induced DDR中发挥的作用。研究结果表明,100μM和200μM的DEHP暴露显著上调了gc-2细胞内总RNA的m6A甲基化修饰水平,m6A甲基转移酶METTL3及m6A结合蛋白YTHDC1的表达量亦因DEHP暴露而显著上调。提示METTL3由于DEHP暴露而被募集至DNA损伤位点,这表明METLL3可能参与了gc-2细胞对DEHP-induced DSBs的修复过程。而METTL3作为m6A甲基化修饰的调节因子,我们推测m6A甲基化修饰可能参与对DEHP-induced DS

关键词： DEHP gc-2细胞 m6A DNA损伤 DNA损伤反应

低剂量双酚A致男（雄）性生殖损伤及TET1在其中的作用及机制研究

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低剂量双酚A致男（雄）性生殖损伤及TET1在其中的作用及机制研究

作者：袁文博新乡医学院

学位级别：硕士

背景研究发现动物和人类接触BPA对生殖系统都有许多不良影响。课题组前期已经证实BPA暴露可引起小鼠gc-2细胞总甲基化水平升高。TET1作为一种非常重要的去甲基化酶,与多种生物学过程密切相关。结合最新文献报道,我们推测TET1可能通过调... 详细信息

背景研究发现动物和人类接触BPA对生殖系统都有许多不良影响。课题组前期已经证实BPA暴露可引起小鼠gc-2细胞总甲基化水平升高。TET1作为一种非常重要的去甲基化酶,与多种生物学过程密切相关。结合最新文献报道,我们推测TET1可能通过调控下游关键分子DNA去甲基化/甲基化的动态平衡参与BPA暴露致小鼠生殖损伤,其具体机制有待深入研究。本研究采用小鼠生殖系统相关的三种细胞探索在BPA暴露致雄性生殖细胞损伤过程中TET1介导下游调控通路关键分子的表观遗传调控作用及其具体机制,将为从表观遗传角度寻找雄性生殖损伤更为敏感的分子标志物提供新思路。目的1.基于CTD数据库筛选BPA毒性相关基因,探索可能的作用通路。2.探索TET1在低剂量BPA致男(雄)性生殖损伤中的作用及调控机制。方法1.使用CTD数据库筛选BPA毒性有关的基因,进行富集分析。2.采用终浓度为0μM、20μM、40μM、80μM的BPA处理小鼠gc-2细胞、TM3细胞、TM4细胞72h,采用CCK-8法检测细胞存活率。3.采用激光共聚焦显微镜观察BPA对gc-2细胞内钙离子浓度的影响,采用qRT-PCR和Western blot技术检测染毒后分子的表达水平。4.建立TET1基因过表达/干扰gc-2细胞模型,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期以及细胞内钙离子水平的变化。5.采用hMeDIP、MeDIP检测TET1基因过表达/干扰后分子的(羟)甲基化水平。6.运用SPSS25.0对TET1基因表达量与人群精液质量参数进行相关性分析。结果***功能富集分析结果发现富集的基因参与生殖系统发育、生殖结构发育等分子生物过程,这些基因涉及HIF-1、PI3K-AKT等信号通路(Pgc-2细胞,PI3K和JAK的mRNA表达水平显著下调,P53、BCL2则显著上调,PI3K、BCL2的蛋白水平显著下降,而P53显著上升(P细胞,PI3K、HIF1-αmRNA表达水平显著下调,BCL2、BAX的mRNA表达水平显著上调(P细胞,P53 mRNA表达水平显著下调,HIF1-α、P300/CBP、BAX mRNA表达水平均显著下调(P细胞损伤中显著下调:(1)随着染毒剂量增大,三种细胞存活率均明显下降(P2)gc-2、TM3细胞染毒72h后TET1的表达水平显著下调;而TM4细胞染毒TET1的表达水平上调尤为显著(Pgc-2细胞内钙离子水平显著下降(P细胞增殖、升高钙离子浓度参与BPA致小鼠生殖损伤过程:(1)TET1基因过表达后,gc-2细胞的增殖速率明显上升(P2)与对照组相比,TET1过表达组中细胞凋亡受到抑制(P细胞内Ca显著上升(P细胞损伤过程:(1)TET1基因过表达后,Catsper1和Catsper3发生羟甲基化变化;TET1基因低表达后,Catsper2和Catsper4的甲基化水平改变(P2)80μM BPA染毒组中,TET1基因过表达组细胞相对增长速度较对照组高(P细胞相对增长速度较对照组低(P2)前向运动比例合格组的精子浓度、快速前向运动比例、精子总活力等精液参数均明显升高(Pgc-2、TM3、TM4细胞出现不同程度的损伤,PI3K-AKT信号通路可能在该过程中发挥重要作用。2.低剂量BPA暴露后可导致gc-2细胞凋亡,细胞内钙离子水平下降,Catsper1-4表达水平显著下调。3.首次发现TET1基因通过其羟基化修饰调控Catsper钙离子信号通路相关分子的表达影响钙离子水平,从而参与低剂量BPA致雄性生殖毒性发生过程。

关键词：双酚A TET1基因生殖毒性表观遗传调控 gc-2细胞

miR-322对生精细胞的调控机制及其对高DFI男性不育患者的诊断意义

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miR-322对生精细胞的调控机制及其对高DFI男性不育患者的诊断意义

作者：车琦华中科技大学

学位级别：硕士

目的:1.了解在下调miR-322后的gc-2细胞中,细胞增殖和凋亡的改变以及凋亡相关因子的表达变化;2.找寻miR-322影响gc-2细胞增殖和凋亡的靶基因位点并验证;3.评估在高DFI男性不育患者精浆中,miR-424(后统一称为同源miR-322)及其靶基因的表... 详细信息

目的:1.了解在下调miR-322后的gc-2细胞中,细胞增殖和凋亡的改变以及凋亡相关因子的表达变化;2.找寻miR-322影响gc-2细胞增殖和凋亡的靶基因位点并验证;3.评估在高DFI男性不育患者精浆中,miR-424(后统一称为同源miR-322)及其靶基因的表达水平共同作为病因诊断和治疗的价值。方法:1.增殖率的检测:根据向gc-2细胞中转染的miRNA的模拟物(Mimic)、抑制物(Inhibitor)及相应阴性对照物(NC,Negative Control)的不同分为7组。A组为转染 miR-29c mimic 组;B 组为转染 miR-29c inhibitor 组;C 组为转染 miRNAmimic NC组;D组为转染miR-322 mimic组;E组为转染miR-322 inhibitor组;F组为转染miRNA inhibitor NC组;G组未转染的空白对照组。用MTT法和CCK8法检测各组细胞的增殖率并比较各组结果的差异。2.凋亡率的检测:分别将向gc-2细胞中转染miR-322 inhibitor,inhibitor NC以及空白对照细胞定为H～J组,使用流式细胞术法检测各组细胞凋亡率,并对组间结果进行比较。3.凋亡相关因子(Caspase3,Caspase9,Caspase8,Bax,Bcl-2)表达的检测:提取上述H～J组细胞的RNA和蛋白,用real-time PCR以及western blot的方法检测凋亡相关因子的核酸以及蛋白表达水平,并进行组间结果的比较。4.基因位点的预测和验证:利用生物信息学方法,通过比对在线靶基因预测库数据,对miR-322的靶基因作用位点进行预测,通过比对H组、I组的预测靶基因的表达水平确定候选靶基因位点。构建含有候选靶基因位点3’UTR的野生型和突变型质粒,根据共转染上述野生型或突变型载体及miR-322 mimic或miRNA mimic NC的不同,将gc-2细胞分为4组:K组共转染野生型质粒及miR-322 mimic(作为实验组);L组为共转染野生型质粒及miRNA mimic NC;M组为共转染突变型质粒及miR-322 mimic;N组为共转染突变型质粒及miRNAmimic NC。用双荧光素酶法检测各组荧光素酶活性,验证候选靶基因位点的正确性。5.对人标本的对比检测:将DFI大于30%和DFI小于10%定义为高DFI男性不育组O组(实验组)和正常男性组P组(对照组)。依照分组标准为各取30例标本,用real-time PCR方法检测各组各标本精浆中同源miR-322的表达水平,再在实验组中抽取6名患者和对照组抽取3名男性的精浆使用western blot方法,检测及其可能的靶基因Ddx3x的蛋白表达变化,并对组间结果进行比较。结果:1.相比于对照组,转染miR-322 inhibitor组中gc-2细胞增殖率有明显降低(*P0.05)。2.同对照组相比,转染miR-322 inhibitor组中gc-2细胞凋亡率有明显升高(*P细胞凋亡因子:Caspase3,Caspase9,Caspase8,Bax的表达有明显增加(O细胞凋亡因子:Bcl-2的表达则明显减少(*P22的直接作用的位点。4.高DFI不育男性精浆中人同源miR-322的表达明显低于对照组(*P22后,gc-2细胞的增殖率明显降低,同时细胞凋亡明显增加***-322通过直接作用于Ddx3x引起gc-2细胞增殖和凋亡的改变3.在高DFI男性不育患者精浆中,同源miR-322及其靶基因Ddx3x的表达水平,可能在共同作为其病因诊断和病因治疗方面有一定的价值和指导意义。

关键词： miR-322 gc-2细胞细胞增殖凋亡靶基因位点病因诊断