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gad67-gfp基因敲入小鼠三叉上核内向三叉神经运动核投射的gfp阳性神经元表达c-fos的研究

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神经解剖学杂志 2007年第6期23卷 571-576页

作者：葛顺楠郭威刘涛武胜昔李金莲第四军医大学解剖学教研室暨梁銶琚脑研究中心

本文综合应用逆行束路追踪(将四甲基罗达明-TMR注入一侧三叉神经运动核)和免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下对谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(gad67-gfp)基因敲入小鼠在口周部给予伤害性刺激时,三叉上核(Vsup)内向对侧... 详细信息

本文综合应用逆行束路追踪(将四甲基罗达明-TMR注入一侧三叉神经运动核)和免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下对谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(gad67-gfp)基因敲入小鼠在口周部给予伤害性刺激时,三叉上核(Vsup)内向对侧三叉神经运动核(Vmo)投射的呈gfp阳性的GABA能神经元表达c-fos的情况进行了研究。结果显示:(1)Vsup内可观察到许多gfp阳性神经元,细胞较小;(2)也可观察到许多TMR或c-fos单标神经元较密集地分布于Vsup内,其中c-fos阳性产物只见于神经元的胞核,在胞浆内未见表达;(3)在激光共聚焦显微镜下可进一步观察到部分神经元同时呈gfp/TMR、TMR/c-fos、gfp/c-fos双重标记或gfp/TMR/c-fos三重标记。其中gfp/TMR双标神经元分别占gfp或TMR阳性神经元的17.8%和19.2%;TMR/c-fos双标神经元分别占TMR或c-fos阳性神经元的34.9%和31.3%;gfp/c-fos双标神经元分别占gfp或c-fos阳性神经元的21.2%和20.5%;而gfp/TMR/c-fos三标神经元分别占gfp、TMR或c-fos阳性神经元的11.1%、12%和10.8%。以上结果表明小鼠Vsup内部分GABA能神经元可接受来自同侧的口面部伤害性信息,并对这些信息进行整合后,直接发出投射纤维至Vmo;故Vsup内部分GABA能运动前神经元可能参与口面部伤害性反射局部环路的构成。

关键词：三叉上核三叉神经运动核 γ-氨基丁酸 c-fos 逆行束路追踪免疫荧光组织化学 gad67-gfp基因敲入小鼠

gad67-gfp基因敲入小鼠5-羟色胺样和P物质样阳性终末与三叉神经中脑核神经元的联系

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神经解剖学杂志 2008年第2期24卷 166-170页

作者：郭威刘涛刘春然武胜昔李金莲徐礼鲜第四军医大学基础部人体解剖学教研室暨梁銶琚脑研究中心第四军医大学口腔医学院麻醉科西安710032

本研究应用免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下观察了gad67-gfp基因敲入小鼠三叉神经中脑核(Vme)内5-HT样和P物质(substanceP,SP)样阳性终末分别与小白蛋白(parvalbumin,PV)样和gfp阳性神经元之间的联系。结果显示:(1)... 详细信息

本研究应用免疫荧光组织化学三重标记技术,在激光共聚焦显微镜下观察了gad67-gfp基因敲入小鼠三叉神经中脑核(Vme)内5-HT样和P物质(substanceP,SP)样阳性终末分别与小白蛋白(parvalbumin,PV)样和gfp阳性神经元之间的联系。结果显示:(1)Vme内有较多的PV样阳性神经元,这些神经元绝大多数为大、中型的假单极神经元,直径约为18～40μm;也可观察到少量的gfp阳性神经元,多为小的多极神经元,直径约为8～15μm;(2)5-HT样阳性终末广泛分布于Vme内,其中有部分阳性终末分别聚集在PV样或gfp阳性的Vme神经元的胞体周围,计数结果表明:大约有77.7%和22.3%的5-HT样阳性终末分别与PV样或gfp阳性胞体相接触;(3)SP样阳性终末也广泛分布于Vme内,并分别与PV样或gfp阳性神经元的胞体形成密切接触,其中有78.2%和21.8%的阳性终末分别与PV样或gfp阳性胞体相接触。以上结果提示,在口面部本体感觉信息向更高一级中枢传递过程中,5-HT能和SP能神经终末不仅对初级传入发挥直接的调控作用,还可能通过影响Vme内的GABA能神经元的活动,从而间接对该信息的传递发挥调控作用。

关键词： 5-羟色胺 P物质 γ-氨基丁酸小白蛋白绿色荧光蛋白免疫荧光组织化学三叉神经中脑核 gad67-gfp基因敲入小鼠

gad67-gfp基因敲入小鼠谷氨酸能、5-HT能和SP能终末与三叉神经中脑核神经元联系的形态学研究

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GAD67-GFP基因敲入小鼠谷氨酸能、5-HT能和SP能终末与三叉神经中...

作者：郭威第四军医大学

学位级别：硕士

临床上常出现的颞下颌关节紊乱、讷吃和吞咽困难等三叉神经领域的一些功能障碍性疾病都与三叉神经本体感觉信息的传递和调控密切相关。三叉神经中脑核(mesencephalic trigeminal nucleus,Vme)是传递口面部本体感觉信息的初级神经元所在... 详细信息

临床上常出现的颞下颌关节紊乱、讷吃和吞咽困难等三叉神经领域的一些功能障碍性疾病都与三叉神经本体感觉信息的传递和调控密切相关。三叉神经中脑核(mesencephalic trigeminal nucleus,Vme)是传递口面部本体感觉信息的初级神经元所在地,同时也是对该信息进行调控的重要部位。三叉神经中脑核(Vme)是一个较特殊的神经核团,其神经元排列极不集中,呈“散兵线”式排列于上丘至蓝斑与臂旁核之间。Vme由大的假单极细胞和小的多极细胞组成,一般认为前者含有兴奋性神经递质,如谷氨酸(glutamate,Glu),后者则为含有抑制性神经递质,γ-氨基丁酸(GABA)的中间神经元。目前一般认为,Glu能的Vme神经元发挥传递口面部本体感觉信息的作用,而GABA能的Vme神经元则通过局部环路对本体觉信息的传递起抑制性的调控作用。GABA是中枢神经系统内的一种重要的抑制性神经递质,它可与相应的GABA受体结合从而发挥抑制性调控作用。本课题组以往研究结果表明5-HT样、囊泡膜谷氨酸转运体(VGluTs)样和P物质(substance P,SP)样阳性终末与Glu能的Vme神经元胞体之间有密切接触。但这些研究由于无法有效地标记出Vme中GABA能的中间神经元,故有关5-HT样、VGluT1/VGluT2样和SP样阳性终末与Vme内的GABA能中间神经元胞体之间的关系如何,目前尚未见报道。 gad67-gfp基因敲入小鼠是第四军医大学解剖教研室与日本京都大学医学部高级脑形态学研究室合作培育出的一种近年来被广泛用于实验的转基因动物,该小鼠可将脑内表达绿色荧光蛋白(gfp)的GABA能神经元准确地标记出来。gfp在内源性谷氨酸脱羧酶67(gad67)基因启动子的控制下特异性的表达在GABA能神经元内,已有研究表明gfp阳性神经元几乎全为GABA能神经元,同时该小鼠Vme内的GABA能中间神经元都能得到较好的标记。基于此,本研究利用该gad67-gfp基因敲入小鼠,综合运用免疫荧光组织化学三重标记技术和免疫电镜双重标记技术,分别在激光共聚焦显微镜和电子显微镜下观察Vme内5-HT样、VGluT1/VGluT2样和SP样阳性终末分别与大的假单极神经元(Glu能)和小的多级神经元(GABA能)胞体之间的联系。主要结果如下: (1)Vme内有较多的PV样阳性神经元,这些神经元绝大多数为大、中型的假单极神经元,直径约为18～40μm;也可观察到少量的gfp阳性神经元,多为小的多极神经元,直径约为8～15μm。 (2)大量的VGluT1样和VGluT2样阳性终末广泛分布于Vme内,其中有部分终末分别聚集在PV样或gfp阳性的Vme神经元的胞体或树突周围。统计结果表明:在与Vme神经元相接触的VGluT1样阳性终末中,有71.8%的阳性终末与PV样阳性胞体相接触,28.2%的终末与gfp阳性胞体或树突相接触;在与Vme神经元相接触的VGluT2样阳性终末中,与PV样阳性胞体相接触的阳性终末占74.5%,与gfp阳性胞体或树突相接触的阳性终末占25.5%。 (3)5-HT样和SP样阳性终末也分别与PV样和gfp阳性神经元的胞体形成密切接触,其中,分别有77.7%和78.2%的5-HT样和SP样阳性终末与大的PV样阳性胞体相接触,22.3%和21.8%的5-HT样和SP样阳性终末分别与小的gfp阳性胞体或树突相接触。 (4)在电镜下进一步观察到,5-HT样阳性终末与gfp阳性神经元的胞体或树突主要形成非对称性的轴-体或轴-树突触联系。以上结果提示,在口面部本体感觉信息向更高一级中枢传递过程中,5-HT能、Glu能和SP能神经终末不仅对初级传入发挥直接的调控作用,还可能通过影响Vme内的小的GABA能神经元的活动,从而间接对该信息的传递发挥调控作用。

关键词：囊泡膜谷氨酸转运体 5-羟色胺 P物质三叉神经中脑核 γ-氨基丁酸 gad67-gfp基因敲入小鼠

七氟烷对gad67-gfp基因敲入小鼠脑内GABA神经元及GABAA受体的激活作用的研究

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七氟烷对GAD67-GFP基因敲入小鼠脑内GABA神经元及GABAA受体的激活...

一组氯离子转运体KCC2和NKCC1在黑质网状部的表达及其参与肝性脑病的gad67-gfp转基因小鼠的研究

全国第三次麻醉药理学术会议

作者：韩丽春徐礼鲜陕西省肿瘤医院麻醉科第四军医大学口腔医院麻醉科

全身麻醉作用机理研究已有160多年的历史,特别是中枢作用部位,至今仍然是国内外麻醉学界十分关注而又悬而未决的研究课题。研究目的:本研究目的旨在应用分子生物学、免疫组化及免疫荧光双标等多种先进的

关键词： gad67-gfp基因敲入小鼠七氟烷吸入麻醉免疫组织化学激光扫描共聚焦显微镜 GABA Fos GABAA受体

来源： cnki会议评论

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一组氯离子转运体KCC2和NKCC1在黑质网状部的表达及其参与肝性脑...

作者：李俊杰第四军医大学

学位级别：硕士

肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)是肝病患者最常见的并发症和死亡原因之一,尽管关于其发病机制的学说众多,但是至今尚未予以完全阐明,临床上也无特效疗法,使得肝性脑病的实验研究具有十分重要的必要性和紧迫性。近年来发现,中枢神... 详细信息

肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)是肝病患者最常见的并发症和死亡原因之一,尽管关于其发病机制的学说众多,但是至今尚未予以完全阐明,临床上也无特效疗法,使得肝性脑病的实验研究具有十分重要的必要性和紧迫性。近年来发现,中枢神经系统内重要的抑制性神经递质γ-氨基丁酸(Gamma-amino butyric acid,GABA)与肝性脑病的脑细胞功能紊乱有着明显关系,而KCC2和NKCC1是调控GABA状态的一组氯离子转运体。因此,可以此为契入点,研究HE状态下GABA的可塑性变化,从新的角度来阐明HE的中枢机制。目的: 1、观察谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(gad67-gfp)基因敲入小鼠黑质网状部(SNr)内,表达gfp的GABA能神经元与一对功能相反的Cl-共转运体(K+-Cl- cotransporter 2,KCC2;Na+-K+-Cl- cotransporter 1,NKCC1)的共存情况。 2、建立检测正常小鼠及肝性脑病小鼠不同阶段黑质网状部KCC2和NKCC1表达的SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR的方法,并探讨其在肝性脑病发病机制中的作用。方法: 1、分别运用原位分子杂交与免疫组织化学相结合以及gfp与KCC2或NKCC1免疫荧光染色相结合的双重标记方法,在光学显微镜和激光共聚焦显微镜下同时进行观察。 2、采用国际上广泛采用的硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射致肝性脑病动物模型,SYBR荧光实时定量PCR检测正常小鼠及不同阶段肝性脑病小鼠黑质网状部KCC2和NKCC1的表达。结果: 1、SNr内95%以上的gfp阳性神经元同时表达KCC2 mRNA,而50%表达KCC2 mRNA的阳性神经元呈gfp阳性。 2、SNr内80%以上的gfp阳性神经元同时表达NKCC1 mRNA,约35%表达NKCC1 mRNA的阳性神经元呈gfp阳性。 3、SNr内90%以上的gfp阳性神经元同时表达KCC2,双标神经元约占KCC2阳性神经元的50.5%。 4、SNr内80.5%以上的gfp阳性神经元同时表达NKCC1,双标神经元约占NKCC1阳性神经元的42.5%。 5、与正常小鼠相比,肝性脑病小鼠建模成功后第1天黑质网状部KCC2表达降低(P小鼠相比,KCC2仍降低(Pgfp的GABA能神经元大部分与KCC2和NKCC1共存,提示氯离子共转运体可能对SNr内GABA能神经元起重要的调控作用。 2、KCC2和NKCC1的表达与肝性脑病急性发病有关,随着病程的进展,机体作出代偿性调整,导致KCC2和NKCC1的表达逐渐恢复到正常水平。KCC2和NKCC1的表达变化,以及其所引起的GABA状态的改变,可能是肝性脑病的中枢发病机制之一。

关键词：肝性脑病黑质网状部 GABA能神经元 KCC2 NKCC1 gad67-gfp基因敲入小鼠

刺激延髓背角诱发的小鼠脑干网状结构内向Vmo投射的GABA能神经元突触后反应的电生理学研究

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神经解剖学杂志 2008年第6期24卷 597-601页

作者：葛顺楠陈涛牛乐武胜昔李金莲高国栋第四军医大学人体解剖学教研室暨梁銶琚脑研究中心西安710032 第四军医大学唐都医院神经外科西安710032

本实验利用谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(gad67-gfp)基因敲入小鼠制备离体脑片,结合TMR逆行束路追踪技术,在荧光镜和红外镜头下,利用膜片钳全细胞记录的方法对电刺激延髓背角(即三叉神经脊束核尾侧亚核,Vc)诱发的小鼠小细胞网状结构(PC... 详细信息

本实验利用谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(gad67-gfp)基因敲入小鼠制备离体脑片,结合TMR逆行束路追踪技术,在荧光镜和红外镜头下,利用膜片钳全细胞记录的方法对电刺激延髓背角(即三叉神经脊束核尾侧亚核,Vc)诱发的小鼠小细胞网状结构(PCRt)内GABA能和TMR逆标的运动前神经元的突触后反应及其反应类型、药理学特征进行系统的研究。结果显示:(1)高频刺激(20 Hz)Vc,在PCRt内gfp和TMR双标的运动前神经元上可记录到兴奋性的突触后电流(EP-SCs),波形显示为单突触反应;(2)电压钳记录模式下,α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体(AMPA受体)拮抗剂氨基-2-硝基喹啉-2,3-二酮(CNQX)及N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA受体)阻断剂D,L-2-氨基-5-磷酸基戊酸(AP-5)均可显著降低刺激Vc所诱发的小鼠PCRt内gfp和TMR双标神经元的EPCSs的幅值;(3)电流钳模式下,刺激Vc,在PCRt内gfp和TMR双标的神经元上记录到兴奋性突触后电位,其幅度与刺激强度在一定范围内呈正相关。以上结果提示,小鼠PCRt内向三叉神经运动核(Vmo)发出投射的GABA能运动前神经元可通过其细胞膜上AMPA受体或NMDA受体的介导,对口面部伤害性信息发挥整合和调控作用,以实现对口面部伤害性反射活动的精确调节。

关键词： γ-氨基丁酸膜片钳全细胞记录运动前神经元延髓背角网状结构 gad67-gfp基因敲入小鼠

GnRH神经元表达gad67及性激素对其影响的研究

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GnRH神经元表达GAD67及性激素对其影响的研究

作者：朱姣第二军医大学

学位级别：硕士

促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)神经元在前脑散在分布,其在生殖过程中有着极其重要的作用。GnRH的脉冲式释放受神经递质或神经调质调控。γ-氨基丁酸(Gamma-amino butyric acid,GABA)是中枢神经系统(central ... 详细信息

促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)神经元在前脑散在分布,其在生殖过程中有着极其重要的作用。GnRH的脉冲式释放受神经递质或神经调质调控。γ-氨基丁酸(Gamma-amino butyric acid,GABA)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中最主要的抑制性神经递质,但是在大多数发育成熟的GnRH神经元中,则起着相反的作用,即兴奋作用。谷氨酸(glutamic acid)在谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,gad)的作用下,脱羧成GABA。GABA通过作用于GnRH神经元上的GABAa和GABAb受体,使GnRH神经元表现出兴奋或者抑制现象。我们利用免疫荧光组织化学方法和gad67-gfp基因敲入小鼠(gad67-gfp knock-in mice,gad67-gfp)进行研究,首次发现在成年小鼠的前脑中部分GnRH神经元表达gad67,即这一细胞亚群是GABA能的。在我们的工作中,首先利用原位杂交和免疫荧光组织化学联合方法验证gad67-gfp基因敲入小鼠gfp表达的特异性。结果显示gad67在中枢神经系统中广泛分布,如大脑皮层、丘脑网状核、苍白球等区域,并且绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,gfp)免疫反应阳性的神经元与gad67 mRNA完全共标,说明gad67-gfp基因敲入小鼠中gfp的表达具有特异性,可以用gfp代替gad67来显示gad67的表达。运用免疫荧光组织化学法,发现在成年小鼠的前脑中部分GnRH神经元表达gad67。经统计学分析,结果显示雌鼠和雄鼠前脑中gad67和GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元的百分比分别为62%±7%、34%±5%,即雌鼠前脑中gad67与GnRH共表达的神经元所占百分比明显高于雄鼠。为了研究不同性别之间的差异,我们对雌鼠和雄鼠进行了去势手术及性激素的替代治疗。发现雌鼠在摘除卵巢7天后,gad67和GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元的百分比是40%±4%,明显低于正常雌鼠,而摘除卵巢后用雌二醇(17β-estradiol,E2)治疗的雌鼠前脑中该种神经元所占百分比为64%±5%,基本恢复到正常雌鼠的水平。但是,在雄鼠对照组、摘除双侧睾丸以及摘除睾丸后用睾酮丙酸盐(testosterone propionate,TP)治疗的实验结果显示,gad67与GnRH共表达的神经元所占的百分比分别是34%±5%、36%±5%、35%±4%,并没有明显的差异。说明gad67在GnRH神经元中的表达受雌激素的影响。因此,我们又对雌鼠的动情周期进行了相应的研究。首先利用阴道脱落上皮细胞涂片法辨别小鼠的动情期和非动情期,然后进行免疫组织化学实验。我们发现出生后30天(postnatal day 30,P30)和45天(P45)的雌鼠在动情期时,gad67和GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元的百分比分别是71%±4%、75%±4%,明显高于非动情期(P30:34%±5%;P45:34%±5%)。再次证明了GnRH神经元表达gad67受雌激素的调节。成年小鼠前脑中,部分GnRH神经元表达gad67。而在胚胎发育过程中,胚胎12天(Embryo day 12,E12)时,犁鼻器(vomeronasal organ)和GnRH神经元的迁移路径中基本所有的GnRH神经元都表达gad67;随着时间的推移,在迁移路径以及中枢神经系统中,gad67与GnRH共表达的神经元数目均是越来越少。而且在P1和P10,均未看到GnRH神经元表达gad67。直到P15时,才看到有GnRH神经元表达gad67;P30时(通常认为是性成熟阶段),雌鼠和雄鼠前脑中gad67和GnRH共表达的神经元占总GnRH神经元的百分比开始出现明显的差异。总之,我们的研究数据表明:1、在成年小鼠前脑中,部分GnRH神经元表达gad67。2、在GnRH神经元中,gad67的表达受雌激素的调节。3、结果提示:GnRH神经元合成和分泌γ-氨基丁酸,并通过作用于GnRH神经元上的受体调节自身的功能活性。

关键词：促性腺激素释放激素神经元谷氨酸脱羧酶-67 γ-氨基丁酸 gad67-gfp基因敲入小鼠雌激素