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多头绒泡菌间期细胞核中RNA的转录状况(英文)

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Acta Botanica Sinica 2001年第3期43卷 227-231页

作者：焦明大毕晓辉曾庆华王玉红东北师范大学遗传与细胞研究所长春130024

利用BrUTP免疫标记技术 ,研究了多头绒泡菌 (PhysarumpolycephalumSchw .)间期细胞核中RNA的转录状况。结果表明 :在整个间期核仁中的rRNA都在活跃转录 ;核质中hnRNA的转录呈逐渐上升趋势 ,早S期转录水平很低 ,晚S期转录活性升高 1倍 ,... 详细信息

利用BrUTP免疫标记技术 ,研究了多头绒泡菌 (PhysarumpolycephalumSchw .)间期细胞核中RNA的转录状况。结果表明 :在整个间期核仁中的rRNA都在活跃转录 ;核质中hnRNA的转录呈逐渐上升趋势 ,早S期转录水平很低 ,晚S期转录活性升高 1倍 ,g2 期转录达到最高水平 ;整个间期核质中RNA的转录水平增加了 5～

关键词： rRNA hnRNA 转录 BrUTP S期 g2期多头绒泡菌

靶向细胞周期g2调控点在恶性血液病治疗作用的研究进展

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国际输血及血液学杂志 2013年第4期36卷 455-459页

作者：叶丽(综述) 佟红艳(审校) 浙江大学医学院附属第一医院血液科杭州310003

细胞周期与恶性肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤患者接受反复化疗后，体内有一部分肿瘤细胞通过细胞周期阻滞及自我防御修复机制持续存活，造成化疗耐药、肿瘤复发难治。以细胞周期调控尤其以g2期调控蛋白为靶向的化疗增敏研究成为当今热... 详细信息

细胞周期与恶性肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤患者接受反复化疗后，体内有一部分肿瘤细胞通过细胞周期阻滞及自我防御修复机制持续存活，造成化疗耐药、肿瘤复发难治。以细胞周期调控尤其以g2期调控蛋白为靶向的化疗增敏研究成为当今热点。近年研究表明，g2期靶点抑制剂不仅在实体瘤的体内外治疗中起到重要作用，而且在多种恶性血液病中也显示出重要意义。笔者综述了g2期调控中一些重要靶点蛋白在实体瘤及恶性血液病的研究进展，以期为新治疗策略的提出提供思路。

关键词： g2期 Weel ATR Chk1 ATM p38 MK2 PP2A 抑制剂

纳米银对人肺癌A549细胞增殖的影响及其作用机制

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实用肿瘤杂志 2014年第2期29卷 148-152页

作者：潘晓芳尹红英淮安市淮阴医院肿瘤科江苏淮安223300

目的探讨纳米银对人肺癌A549细胞毒性的影响及其作用机制。方法通过显微镜观察纳米银对A549细胞形态的变化。MTT法检测不同浓度纳米银对A549细胞增殖的影响。流式细胞仪检测纳米银对A549细胞周期阻滞的影响。Western blot和免疫组织化... 详细信息

目的探讨纳米银对人肺癌A549细胞毒性的影响及其作用机制。方法通过显微镜观察纳米银对A549细胞形态的变化。MTT法检测不同浓度纳米银对A549细胞增殖的影响。流式细胞仪检测纳米银对A549细胞周期阻滞的影响。Western blot和免疫组织化学法检测纳米银对A549细胞凋亡蛋白表达的影响。结果与对照组比较,随着纳米银药物浓度的增加,A549细胞抑制率显著增加,其半数抑制率为(74.23±4.17)mg/L。纳米银作用于A549细胞g2/M期,纳米银中、高浓度明显上调细胞周期调控p21、p53基因的表达;纳米银可抑制Bcl-2蛋白的表达,对caspase-3有活化作用。结论体外细胞实验证实,纳米银通过抑制A549细胞g2/M期,使p21、p53基因表达紊乱,诱导凋亡因子表达,通过多靶点作用抑制细胞生长。

关键词：细胞系肿瘤病理学纳米结构治疗应用银治疗应用细胞增殖药物作用细胞凋亡 g2期

二烯丙基二硫对人胶质瘤U251细胞增殖及细胞周期的影响

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实用肿瘤杂志 2014年第2期29卷 126-132页

作者：汪雪菁向姝霖唐海林苏琦南华大学附属第二医院神经内科湖北衡阳421001 湖南省高校肿瘤细胞与分子病理学重点实验室南华大学肿瘤研究所湖南衡阳421001

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人恶性胶质瘤U251细胞增殖及细胞周期的影响。方法采用MTT法、流式细胞术等方法检测DADS对U251细胞的增殖抑制及细胞周期的影响。免疫细胞化学、qRT-PCR与Western blot检测cyclin B1与c-... 详细信息

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人恶性胶质瘤U251细胞增殖及细胞周期的影响。方法采用MTT法、流式细胞术等方法检测DADS对U251细胞的增殖抑制及细胞周期的影响。免疫细胞化学、qRT-PCR与Western blot检测cyclin B1与c-Myc表达。结果 MTT法显示,15、30、45、60 mg/L DADS处理U251细胞48小时后,生长抑制率分别为22.0%、38.8%、49.2%、55.3%,与对照组比较差异有统计学意义(Pg/L DADS作用U251细胞48小时后,g2/M期细胞分别为(14.1±1.2)%、(25.0±0.6)%、(41.2±1.4)%、(53.5±3.3)%,较对照组(9.6±0.9)%差异具有统计学意义(Pg/L DADS处理U251细胞48小时后,cyclin B1与c-Myc蛋白平均光密度值分别从0.52±0.09、0.56±0.08显著下降至0.23±0.02、0.39±0.04(Pg2/M期,机制与下调cyclin B1、c-Myc有关。

关键词：神经胶质瘤病理学二硫化物类药理学烯丙化合物药理学细胞周期药物作用 g2期流式细胞术

百草枯引起非同步化与同步化细胞氧化、凋亡损伤效应的比较研究

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百草枯引起非同步化与同步化细胞氧化、凋亡损伤效应的比较研究

作者：孔德钦第四军医大学

学位级别：硕士

【背景】百草枯(Paraquat,PQ),化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐。PQ作为一种经典的除草剂,在全球范围内的多个国家和地区被广泛地应用。但在长期的使用中发现,PQ对人体有很大的毒性,中毒后死亡率可达90%以上。据美国中毒控制... 详细信息

【背景】百草枯(Paraquat,PQ),化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐。PQ作为一种经典的除草剂,在全球范围内的多个国家和地区被广泛地应用。但在长期的使用中发现,PQ对人体有很大的毒性,中毒后死亡率可达90%以上。据美国中毒控制中心统计,在2008年农药中毒死亡人数中因PQ中毒者居首位。研究表明,PQ进入人体后可通过各种途径产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)。过量的ROS会导致氧化应激,严重者会造成多脏器功能障碍。肝脏是人体进行代谢和解毒的重要器官,也是PQ毒性的重要靶点。PQ中毒可引起严重肝损伤,甚至肝功能衰竭。目前PQ诱导肝细胞损伤的详细机制尚不十分清楚。线粒体是细胞内重要的细胞器,可参与物质代谢、ATP的生成及凋亡等多种过程。在产生ATP的过程中,线粒体电子传递链上传递的电子会有少量电子不可避免地“漏出”,并与氧反应生成超氧阴离子自由基和H2O2,这些线粒体来源的ROS称为线粒体活性氧(mitochondria reactive oxygen species,mt ROS)。研究表明,细胞内ROS呈“隔室化”分布,且不同部位来源的ROS所发挥的生物学作用也往往不同。mt ROS除了与ROS一样可导致氧化损伤外,还有抗衰老等保护性作用。近年的研究发现PQ诱发的细胞内ROS的主要来源在于线粒体,但线粒体来源的ROS是否直接参与PQ导致的肝细胞损伤暂不清楚。研究表明,像PQ这类农药对于机体的细胞属于外源性化学物(xenobiotics)。而外源化合物作用于细胞时往往存在敏感时相和非敏感时相,因为细胞周期分为四个时相,即g1期、S期、g2期和M期,而在体外培养基中生长的细胞,则是处在各个周期时相细胞的混合。所以,在以往的实验中PQ作用于非同步化细胞所产生的生物学效应,是对不同时相细胞综合作用结果。因此,无法反映PQ作用的敏感时相,从而不利于阐明其毒性效应机制。研究PQ的作用敏感时相,不仅对PQ自身毒性效应机制研究有重要意义,也会对其它外源性化学物的毒性机制研究具有示范作用。【目的】1.观察PQ导致肝细胞损伤过程中ROS与mt ROS的变化规律;并探讨PQ诱导的损伤与两者之间的关系。2.建立理想的细胞同步化模型并确定细胞周期时相,在同步化基础上进一步研究PQ导致的细胞损伤与ROS及mt ROS之间的关系。3.通过比较PQ引起非同步化与同步化细胞氧化、凋亡损伤效应,明确同步化对于研究PQ中毒机制的重要作用。【方法】1.探讨在非同步化肝细胞中PQ导致的损伤与ROS、mt ROS之间的关系:分别用0、25、50、100、200和300μmol·L-1的PQ对非同步化肝细胞进行干预,24h后检测以下各项指标:用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度的PQ处理后细胞活力的变化;用Annexin V-FITC/PI双标记法检测PQ对凋亡率的影响;DCFH-DA染色法结合流式细胞术测定ROS水平;使用线粒体靶向的Mito SOX染色经激光共聚焦显微镜观察细胞内mt ROS的变化;JC-1染色法对线粒体膜电位水平进行测定。为了明确导致细胞活力发生损伤和凋亡的原因是ROS还是mt ROS,我们对ROS、mt ROS的变化与细胞活力、凋亡率和膜电位的改变进行了Pearson相关性分析。2.建立同步化细胞模型:使用RO-3306进行同步化方法的筛选,通过同步化率和凋亡率的双向筛选选择最佳的同步化方法。同步化处理完成后,收集细胞后用70%的酒精固定,用PI法结合流式细胞术检测细胞周期时相;建立同步化模型后通过释放不同的时间点,根据细胞周期检测结果及光镜和透射电镜的形态学指标,分别确定细胞周期的g1期、S期、g2期和M期。3.在同步化基础上进一步研究PQ导致的肝细胞损伤与ROS及mt ROS之间的关系:将Hep g2细胞同步化至不同时相之后,用PQ处理2h,之后换成正常培养基继续培养24h,用CCK-8法检测细胞活力的变化,DCFH-DA染色法结合流式细胞术测定ROS水平,使用线粒体靶向的Mito SOX染色法经流式细胞术检测细胞内mt ROS的变化,比较不同时相细胞的PQ损伤程度与ROS及mt ROS的变化。【结果】1.PQ可明显损伤细胞活力,并呈剂量效应关系;300μmol·L-1的PQ处理时,可以明显诱导AML12细胞发生凋亡。低剂量的PQ升高线粒体膜电位水平,而高剂量的PQ降低线粒体膜电位。2.PQ可诱发ROS的产生,导致细胞内氧化还原稳态的失衡,虽然低剂量的PQ可以增加mt ROS的水平,但高剂量的PQ使mt ROS的含量下降。因此,PQ对mt ROS的生成具有量效关系,即不同剂量的PQ对mt ROS的影响不同。3.经相关性分析发现PQ导致的细胞活力损伤、凋亡与细胞总ROS的水平有相关性,而与mt ROS的产生无相关性;细胞内ROS与线粒体膜电位改变无相关性,而mt ROS的变化与线

关键词：百草枯活性氧线粒体活性氧氧化应激凋亡细胞周期 g2期

幽门螺杆菌感染人牙周膜成纤维细胞后对细胞的侵袭作用和增殖的影响

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幽门螺杆菌感染人牙周膜成纤维细胞后对细胞的侵袭作用和增殖的影...

作者：李焕影南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景1989年Krajden等学者首次于口腔菌斑生物膜和唾液中发现了幽门螺杆菌菌株[1],随后1991年Desai等学者也分别从牙菌斑中检测出幽门螺杆菌[2],证实这种病原体可存在于口腔中,并拉开了研究口腔内幽门螺杆菌的序幕。随后学者通过不... 详细信息

研究背景1989年Krajden等学者首次于口腔菌斑生物膜和唾液中发现了幽门螺杆菌菌株[1],随后1991年Desai等学者也分别从牙菌斑中检测出幽门螺杆菌[2],证实这种病原体可存在于口腔中,并拉开了研究口腔内幽门螺杆菌的序幕。随后学者通过不同的检测方法发现幽门螺杆菌在口内可定植在口腔环境中的龈上菌斑、龈下菌斑、唾液、黏膜等部位,并且龈下菌斑中的检出率较高。幽门螺杆菌具有鞭毛、黏附素、毒力蛋白、LPS等毒力因子,可对宿主造成免疫及炎症损伤。现多项研究表明,口腔是幽门螺杆菌定植的胃外最大贮存点。在相关的临床研究及系统分析结果中发现[9,10,12],牙周炎位点的幽门螺杆菌检出率更高,幽门螺杆菌感染与牙周炎有一定的相关关系,口腔中幽门螺杆菌的存在是慢性牙周炎的危险因素之一。而在牙周炎症发生时,牙周袋上皮是细菌生物膜和结缔组织的唯一屏障。袋内上皮通常有表面侵蚀或溃疡,可暴露下面的炎性结缔组织。牙周炎为慢性疾病,胶原纤维的修复在疾病过程中具有重要的作用,牙周结缔组织中的牙周膜成纤维细胞容易受到牙周病原微生物的损伤,导致其增殖能力受抑制或形态的特性改变。故本实验拟探究幽门螺杆菌感染人牙周膜成纤维细胞后对细胞的侵袭作用和增殖的影响,探讨其在牙周组织的病理损伤机制的可能性。材料与方法1.幽门螺杆菌SS1及人牙周膜成纤维细胞的培养及鉴定幽门螺杆菌标准株SS1来源于广州市南方医院消化科孙勇教授,本课题实验组负责复苏保存。配制含6%新鲜羊血的哥伦比亚琼脂血平板,将冻存的幽门螺杆菌标准株SS1接种到哥伦比亚琼脂血平板中,平板置于厌氧罐中,调节罐内气体环境为微需氧环境,湿度＞90%,恒温37℃培养2d后进行革兰染色及菌种测序。从南方医院口腔科收集14-25岁健康无龋的前磨牙,刮取牙周膜进行牙周膜成纤维细胞的原代培养,细胞培养至80%时传代,取第3-6代细胞通过CCK8法测定体外生长情况及免疫荧光染色鉴定来源。2.幽门螺杆菌侵袭模型的建立及其电镜观察通过庆大霉素保护实验建立幽门螺杆菌侵袭人牙周膜成纤维细胞模型。按感染复数MOI=100:1加入相应的菌液量至细胞培养基中,分别共培养2、4、6、8、10 h后用含庆大霉素（100 μg/mL）培养基孵育2h杀死细胞外的幽门螺杆菌,洗涤并消化收集细胞,将细胞裂解液梯度稀释涂板,微需氧培养6 d后菌落计数。通过计算侵袭效能确立本实验侵袭模型,通过电镜观察侵袭情况和细胞形态变化。3.幽门螺杆菌感染对人牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响建立高浓度及低浓度的侵袭模型,并用含庆大霉素（100 μg/mL）培养基孵育2 h杀死细胞外的幽门螺杆菌。细胞用4%福尔马林20 min固定,0.2%Triton X-100渗透、血清阻断、Ki-67、DAPI抗体逐步孵育检测核增殖抗原Ki-67的表达情况,并用CCK8法检测细胞连续7 d的增殖情况。4.幽门螺杆菌感染对人牙周膜成纤维细胞细胞周期的影响及其机制建立高浓度及低浓度的侵袭模型,并用含庆大霉素（100 μg/mL）培养基孵育2 h杀死细胞外的幽门螺杆菌。体外侵袭模型建立后添加70%冷乙醇固定细胞,在-4℃冰箱中存放过夜,次日染色之前,用无菌PBS洗一次,离心弃上层清液,添加酶染色工作液。流式细胞仪上机检测。用总RNA提取试剂盒分离三组样本的总RNA,逆转录成cDNA。使用SYBRPremix Ex Taq检测Cdc25C、CDK1、cyclinB 1的转录情况。提取蛋白后主要抗体探测:Cdc25C、Cdc25C-S216、CDK1、CDK1-Y15、cyclinB1。最后,采用化学发光检测系统。结果1.幽门螺杆菌标准株SS1可侵入至人牙周膜成纤维细胞中,对细胞形态有影响本实验成功对正常人牙周膜成纤维细胞进行原代培养及分离,并构建了幽门螺杆菌标准株SS1侵袭细胞的体外模型。在6 h的侵入模型中,幽门螺杆菌标准株SS1的侵袭效率佳,通过倒置显微镜中观察到幽门螺杆菌感染后部分人牙周膜成纤维细胞形态变圆,幽门螺杆菌黏附于细胞膜表面。透射电子显微镜可见幽门螺杆菌可侵入细胞,并被液泡包裹着定位于细胞质中,细胞内液泡增多,液泡内的幽门螺杆菌呈现杆菌样和球菌样。2.幽门螺杆菌标准株SS1侵袭细胞后可通过Cdc25C/CDK1/cyclinB1级联反应导致g2期阻滞及抑制细胞增殖通过CCK8法和Ki-67蛋白免疫荧光染色的结果中可见,幽门螺杆菌标准株SS1侵袭细胞后可导致细胞的增殖受到抑制,并且幽门螺杆菌标准株SS1感染的浓度越高,抑制细胞增殖的情况越明显。通过流式细胞术检测可见,g2期DNA含量随感染浓度增加而升高,细胞g2期发生阻滞。幽门螺杆菌标准株SS1感染后可导致人牙周膜成纤维细胞的g2期的相关调节蛋白cyclinB1、CDK1、Cdc25C的转录和表达失常,并且CDK1-Y15和Cdc25C-S216磷酸化蛋白增加,导致g2期阻滞。结论1.本实验所构建幽门螺杆菌标准株SS1侵袭

关键词：牙周膜成纤维细胞幽门螺杆菌侵袭细胞增殖 g2期

幽门螺杆菌感染人牙周膜成纤维细胞后对细胞增殖的影响及其机制

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