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地西他滨对同步化的g0/g1期MDS-L细胞系线粒体功能的影响

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地西他滨对同步化的G0/G1期MDS-L细胞系线粒体功能的影响

作者：邱宗建山东大学

学位级别：硕士

背景骨髓增生异常综合征（myelodysplastic symdrome,MDS）是一种起源于造血干细胞异常克隆的血液系统疾病,主要表现为外周血一系或多系血细胞减少,骨髓活检可见特征性的幼稚前体细胞异常定位病理结构。DNA甲基化转移酶抑制剂（DNA Meth... 详细信息

背景骨髓增生异常综合征（myelodysplastic symdrome,MDS）是一种起源于造血干细胞异常克隆的血液系统疾病,主要表现为外周血一系或多系血细胞减少,骨髓活检可见特征性的幼稚前体细胞异常定位病理结构。DNA甲基化转移酶抑制剂（DNA Methyltransf erase Inhibitor, DNMTI）的出现为MDS患者提供了新的治疗策略。 DNA甲基化转移酶1a（DNA Methyltransferase la,DNMTla）是一种维持DNA甲基化状态的酶,DNA在复制时DNMTla可以甲基化修饰新合成的子链DNA,使DNA维持亲本的甲基化状态。地西他滨（Dectabin,DAC）作为一种DNMTI可通过降解DNMTla,降低基因组DNA5’mC水平。Shock等报道了DNMT1a可以通过N端的一段信号肽序列定位于线粒体中,与线粒体DNA结合。线粒体DNA编码的蛋白参与线粒体氧化呼吸链的电子传递过程,线粒体氧化呼吸复合体功能的异常可以导致线粒体功能的改变。目前国内外关于DAC是否可以通过影响线粒体基因组编码蛋白的表达,从而改变细胞的功能与状态的研究较少。本研究目的在于探讨DAC是否存在除基因组整合以外影响线粒体功能的作用。目的初步探讨地西他滨（DAC）在不整合入基因组DNA的情况下对线粒体生物学功能的影响。方法用阿非迪霉素（APC）将MDS-L细胞同步化在g0/g1期。DCFH-DA检测不同浓度DAC （0,5,10,15μmol/L）处理后的同步化g0/g1期细胞系活性氧（ROS）的产生水平。采用qRT-PCR法检测线粒体DNA拷贝数和线粒体编码基因ND1、ND6（NADH脱氢酶1、6）mRNA改变。结果与对照组相比,DAC在低浓度5μmol/L条件下可以通过不依赖DNA损伤的途径增加细胞ROS的产生（P＜0.05）,同时细胞内线粒体DNA（MtDNA）的拷贝数较对照组明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）。但随着DAC浓度增加，DAC在高浓度15μmol/L可降低ROS的产生（P＜0.05）。此外,在高浓度DAC作用下,ND1、ND6基因的表达较对照组明显升高（P＜0.05）。结论DAC在低浓度下可以通过增加同步化MDS-L细胞ROS产生、而随着DAC浓度的升高,ROS产生明显降低。此外,DAC在低浓度下可以增加同步化MDS-L细胞线粒体DNA的拷贝数,在高浓度下,对线粒体DNA的拷贝数影响不大,同样高浓度DAC还可调控线粒体基因的表达,促进线粒体编码蛋白的转录增加。

关键词：地西他滨 g0/g1期线粒体活性氧离子

Argonaute亚族蛋白对人类肿瘤细胞周期的影响

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生物化学与生物物理进展 2008年第12期35卷 1394-1402页

作者：姜琳潘淑娟葛郁芝殷勤伟中国科学院生物物理研究所计算与系统生物学研究中心北京100101 江西省人民医院南昌330006

Argonaute(Ago)家族蛋白与小的非编码RNAs(siRNAs,miRNAs,piRNAs)生物发生和细胞功能密切相关.它可以结合小RNAs,调控蛋白质的合成或影响mRNA的稳定性,即RNA干扰(RNAi),并且参与Piwi相关RNAs(piRNAs)的生成.人类Argonaute蛋白家族包括8个成员,对其中的4个(Ago1～Ago4)mRNAs进行了实时定量PCR(qRT-PCR)检测,其在许多细胞中共表达,与细胞生长紧密相关.针对人乳腺癌MCF7和子宫颈癌HeLa细胞系,通过下调Ago亚族蛋白表达量,研究其在细胞周期中的调控作用.MTT实验证明,Ago蛋白表达缺失导致细胞增殖活性显著下降(P1),生长受阻.进一步研究揭示,细胞周期在g0/g1期发生停滞,其中Ago1(P1)和Ago4(Pgonaute蛋白可直接或间接地参与细胞周期进程的调控.

关键词： RNA干扰 Argonaute蛋白实时定量PCR 细胞周期 g0/g1期

羊栖菜多糖通过激活Caspase途径或阻滞g0／g1细胞周期抑制人大肠癌细胞增殖

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羊栖菜多糖通过激活Caspase途径或阻滞G0／G1细胞周期抑制人大肠...

子宫内膜癌组织中K-Cl共转运体1的表达及siRNA干扰其表达对子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖的影响

中国细胞生物学学会医学细胞生物学学术大会

作者：严璘璘梁倩李继承浙江大学细胞生物学研究所

羊栖菜多糖(Sargassum Fusiforme Polysaccharides,SFPS)体外作用于人大肠癌 lovo和RKO细胞后,我们研究发现SFPS显著抑制肿瘤细胞增殖。经电镜观察和琼脂糖凝胶电泳分析,SFPS作用后的lovo和RKO细胞,均可观察到细胞突出起泡、染色质边集... 详细信息

羊栖菜多糖(Sargassum Fusiforme Polysaccharides,SFPS)体外作用于人大肠癌 lovo和RKO细胞后,我们研究发现SFPS显著抑制肿瘤细胞增殖。经电镜观察和琼脂糖凝胶电泳分析,SFPS作用后的lovo和RKO细胞,均可观察到细胞突出起泡、染色质边集、DNA ladder等典型的凋亡特征。然而经流式细胞仪进一步分析, 测得SFPS处理后细胞凋亡率有剂量的依赖性;RKO细胞阻滞在g0／g1期:lovo 细胞周期时相的分布无明显改变。进而Western blot法和Caspase-3,8,9活性检测试剂盒观察Caspase-3,8,9的活性改变,发现SFPS处理lovo和RKO细胞后, 发现Caspase-3酶原蛋白表达降低,并在一定范围内具有剂量和时间的依赖性。其中在lovo细胞中,发现Caspase-9被激活进而形成具有活性的片段,经由Caspase 的活性检测也进一步发现Caspase-3,9的活性逐步增高。而在RKO细胞中,发现 Caspase-3,8,9的活性均有逐步升高的趋势。实验结果提示,SFPS在体外诱导人大肠癌细胞凋亡,这可能是SFPS抑制肿瘤增殖的机制之一。其中,在lovo细胞中, SFPS可能通过激活启动Caspase-9,进而激活下游效应Caspase-3的级联反应来实现的;在RKO细胞中,SFPS可能通过激活Caspase途径和阻滞细胞周期g0／g1 期。

关键词：羊栖菜多糖人大肠癌细胞 Casapase途径 g0/g1期

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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肿瘤 2010年第10期30卷 833-837页

作者：孟丽荣尚超鲁艳明张淑兰澳门理工学院高等卫生学校病理生理教研室澳门000853 中国医科大学神经生物学教研室沈阳110001 中国医科大学附属盛京医院妇产科沈阳110004

目的:探讨K-Cl共转运体1(K-Cl cotransporter 1,KCC 1)mRNA在子宫内膜癌组织中的表达及小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)干扰其表达对子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法:应用荧光定量PCR的方法检测正常子宫内... 详细信息

目的:探讨K-Cl共转运体1(K-Cl cotransporter 1,KCC 1)mRNA在子宫内膜癌组织中的表达及小干扰RNA(smallinterfering RNA,siRNA)干扰其表达对子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖能力和细胞周期的影响。方法:应用荧光定量PCR的方法检测正常子宫内膜和子宫内膜癌组织中KCC 1 mRNA的表达。设计并合成KCC 1特异性的siRNA,转染子宫内膜癌HEC-1B细胞后,应用RT-PCR、Western印迹法、MTT法和FCM法分别检测HEC-1B细胞中KCC 1 mRNA和蛋白的表达、细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化。结果:子宫内膜癌组织中KCC 1 mRNA的表达较正常子宫内膜组织明显增加,差异有统计学意义(P期分析显示细胞明显阻滞于g0/g1期,与对照组比较,细胞凋亡增加(P期的调节,具有促进细胞增殖的能力。

关键词：子宫内膜癌内膜癌组织转运体表达 siRNA干扰细胞增殖能力 cells 细胞周期分析 mRNA 细胞凋亡 Western印迹法子宫内膜组织特异性统计学意义荧光定量检测方法蛋白 g0/g1期小干扰

蟾蜍灵在体内外抑制急性红白血病细胞K562增殖及下调WT1表达的研究

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中国药理学通报 2016年第2期32卷 229-233页

作者：汪丽佩李天一高瑞兰杜月光赵燕娜浙江中医药大学基础医学院病理学教研室浙江杭州310053 浙江中医药大学附属第一医院血液病研究所浙江杭州310006

目的研究蟾蜍灵在体内外抗K562细胞增殖及对WT1表达影响。方法半固体集落形成实验检测蟾蜍灵对K562细胞的增殖抑制作用,流式细胞术分析蟾蜍灵对K562细胞周期的影响,Western blot观察蟾蜍灵对WT1表达作用。通过高致瘤性K562细胞制备裸鼠... 详细信息

目的研究蟾蜍灵在体内外抗K562细胞增殖及对WT1表达影响。方法半固体集落形成实验检测蟾蜍灵对K562细胞的增殖抑制作用,流式细胞术分析蟾蜍灵对K562细胞周期的影响,Western blot观察蟾蜍灵对WT1表达作用。通过高致瘤性K562细胞制备裸鼠皮下荷瘤模型,分组为模型组、蟾蜍灵组及高三尖杉酯碱组,比较各组皮下瘤体积与重量、病理形态学改变及WT1蛋白表达情况。结果①半固体集落形成实验、流式及Westem blot结果显示,蟾蜍灵能明显抑制K562细胞增殖,阻滞细胞在g_0/g_1期,并下调其WT1蛋白表达,呈剂量依赖性;②蟾蜍灵组和阳性对照组裸鼠肿瘤的抑瘤率均明显高于模型组(P1蛋白表达水平。结论蟾蜍灵在体外可抑制K562细胞增殖及阻滞细胞周期于g_0/g_1期并下调其WT1蛋白表达,在体内可明显抑制裸鼠K562皮下瘤体积和重量,导致皮下瘤组织坏死、凋亡,并可下调其WT1蛋白的表达。

关键词：蟾蜍灵 WT1 K562 细胞周期 g0/g1期皮下瘤

不同方法处理供核细胞对细胞周期和重构胚发育的影响

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生命科学研究 2012年第2期16卷 125-131,137页

作者：蔡琳琳阮井玲王娟曲立娟李华黄英上海市儿童医院上海医学遗传研究所中国上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市生殖与胚胎工程重点实验室中国上海200040

利用流式细胞仪和细胞染色体核型分析技术,比较奶牛的转基因体细胞和正常细胞经血清饥饿、抑制培养周期同步化处理后的g0/g1期细胞比例;并将同步化处理的核供体细胞进行核移植,然后统计囊胚发育率.结果表明,血清饥饿和抑制培养均能获得... 详细信息

利用流式细胞仪和细胞染色体核型分析技术,比较奶牛的转基因体细胞和正常细胞经血清饥饿、抑制培养周期同步化处理后的g0/g1期细胞比例;并将同步化处理的核供体细胞进行核移植,然后统计囊胚发育率.结果表明,血清饥饿和抑制培养均能获得较高比例的g0/g1期细胞,两组间差异不显著(P>0.05),但均显著高于未处理对照组(Pg0/g1核移植供体细胞和较高的囊胚率,同步化处理时间以不超过4 d为宜.

关键词：供核细胞 g0/g1期同步化体细胞核移植

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天芝草胶囊对肿瘤细胞周期的影响

中国实验方剂学杂志 2011年第19期17卷 226-228页

作者：沈波徐峰何丽钦杨平江苏省肿瘤医院肿瘤内科南京210009 沈阳药科大学沈阳110016

目的:探讨中药天芝草胶囊对肿瘤细胞周期的影响。方法:S180荷瘤小鼠ig天芝草胶囊0.5,1.0,2.0 ***-1,阳性药组ip环磷酰胺0.02 ***-1d-1,连续7 d,流式细胞仪检测动物给药后肿瘤组织细胞周期变化情况。结果:天芝草胶囊可阻滞肿瘤细胞周期... 详细信息

目的:探讨中药天芝草胶囊对肿瘤细胞周期的影响。方法:S180荷瘤小鼠ig天芝草胶囊0.5,1.0,2.0 ***-1,阳性药组ip环磷酰胺0.02 ***-1d-1,连续7 d,流式细胞仪检测动物给药后肿瘤组织细胞周期变化情况。结果:天芝草胶囊可阻滞肿瘤细胞周期的进程,天芝草胶囊高剂量组Sub-g1期,g0/g1期比率由(2.26±0.11)%上升为(2.61±0.04)%,并伴有S期比率下降,由(17.05±0.10)%下降为(12.59±0.30)%。结论:天芝草胶囊可阻滞肿瘤细胞周期在g0/g1期,抑制肿瘤细胞的增殖。

关键词：天芝草胶囊肿瘤细胞周期 g0/g1期 S期

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血清饥饿法对人牙髓细胞周期同步化的研究

牙体牙髓牙周病学杂志 2011年第2期21卷 67-71页

作者：刘斐吴补领高杰黄欣麻丹丹陈婷南方医科大学南方医院口腔科南方医科大学口腔医学院广东广州510515

目的:探讨不同的血清饥饿方法和饥饿时间对人牙髓细胞(HDPCs)细胞周期的影响。方法:血清直接饥饿和梯度饥饿处理人牙髓细胞。倒置显微镜观察细胞形态;CCK-8检测血清饥饿处理对HDPCs增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞周期验证HDPCs同步... 详细信息

目的:探讨不同的血清饥饿方法和饥饿时间对人牙髓细胞(HDPCs)细胞周期的影响。方法:血清直接饥饿和梯度饥饿处理人牙髓细胞。倒置显微镜观察细胞形态;CCK-8检测血清饥饿处理对HDPCs增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞周期验证HDPCs同步化的效果。结果:血清直接饥饿处理或梯度饥饿处理后其g0/g1期HDPCs的比例均显著高于一般培养组(P0.05)。用含5 mL/L FBS的DMEM培养基培养48 h能获得较满意的结果,g0/g1期细胞百分比达85.95%。结论:血清饥饿法能有效地使人牙髓细胞同步于g0/g1期;5 mL/L FBS血清饥饿处理细胞48 h可取得较好的细胞周期同步化效果。

关键词：血清饥饿法人牙髓细胞细胞周期同步化 g0/g1期

豆类凝集素FRIL体外维持造血干/祖细胞过程中对细胞周期调控分子的影响

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豆类凝集素FRIL体外维持造血干/祖细胞过程中对细胞周期调控分子...

作者：李锦中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

造血干细胞移植已广泛应用于治疗恶性血液疾病，骨髓增生异常综合症以及那些因接受了大剂量化疗而需要造血支持的恶性肿瘤病人。但造血干细胞数量极其稀少，因此许多人都试图通过离体的手段扩增造血干细胞，而研究发现造血干细胞体外扩... 详细信息

造血干细胞移植已广泛应用于治疗恶性血液疾病，骨髓增生异常综合症以及那些因接受了大剂量化疗而需要造血支持的恶性肿瘤病人。但造血干细胞数量极其稀少，因此许多人都试图通过离体的手段扩增造血干细胞，而研究发现造血干细胞体外扩增与保持其多向分化潜能之间往往产生矛盾。造血干细胞在体外培养时进入细胞周期使其其归巢能力及长期重建造血能力明显降低。造血干细胞的体外维持，即使造血干细胞处于细胞周期之外，从而保持其自我更新及多向分化潜能，对于造血干细胞移植等临床应用至关重要。最近发现的一种植物凝集素FRIL(Flt3 receptor-interacting lectin)，能够于离体条件下长期维持造血干细胞的自我更新能力。FRIL能够特异地结合造血干／祖细胞上的Flt3受体，通过RTK信号传导途径，调整细胞周期相关蛋白的表达及作用方式，在一定程度上将造血干／祖细胞滞留于g0／g1期，达到体外长期维持造血干／祖细胞自我更新和多向分化潜能的效果。我们研究小组从眉豆(Dolichos lablab)中分离得到凝集素FRIL，其具有凝集特性和糖结合特异性。体外维持培养脐血CD细胞的实验证实，FRIL具有延长造血干细胞的细胞周期，减少进入分裂和增殖过程的细胞数，抑制前体细胞分化，长期维持造血干／祖细胞多向分化潜能特征。但是其维持造血干祖细胞静息的机制目前还不清楚，因此本文从细胞周期调控的角度对这一问题进行了探讨。FL(Flt3 ligand)具有和FRIL相同的受体Flt3，是目前最常用的体外维持造血干细胞的细胞因子之一，但它同样可诱导静息的干细胞进行增殖与分化，导致具重建功能的干细胞减少。在实验中，我们选择以FL为对照研究FRIL维持造血干／祖细胞过程中的细胞周期调控机制。参与细胞周期g0／g1期调控的因子大致可以分为三类：Cyclin(细胞周期素)、CDK(细胞周期素依赖性激酶)、CKI(细胞周期素依赖性激酶抑制剂)。其中Cyclin和CDK是细胞周期g0／g1期进程的正向调节子，Cyclin呈周期时相性表达，Cyclin与相应的CDK形成复合物激活CDK，当复合物的活性达到一定程度时就能够通过g1／S期限制点，推动细胞周期向S期转换。而CKI通过在g1／S期限制点抑制CDK的活性，从而对细胞周期进程起到负调控作用。为了探讨FRIL体外维持造血干／祖细胞的可能机制，本实验对参与细胞周期调控，尤其是参与g0／g1期细胞周期调控的多种因子进行了mRNA水平及蛋白水平的研究。其中包括参与g0／g1期细胞周期调控的CDK4、CKD6;CyclinD1、CyclinD2、CyclinD3和CyclinE;CKI如P21、P27、硕士学位论文英文摘要 P16等，以及其它一些与细胞周期调控密切相关的因子，够通过激活PZI或其它CKI 的表达引起细胞周期停滞，调节细胞周期进程。分别以FRIL、FL和不添加因子的空白对照3组培养脐血CD34十细胞，于培养的不同时间提取细胞的总RNA和总蛋白，以RT-PCR方法检测目的mRNA的表达，以W七stem Blot方法检测培养0d、3d时三组细胞中目的蛋白的表达。结果显示F班L维持培养的CD34+细胞Cychn、CDK的 mRNA及蛋白的表达与对照组有差异，同添加FRJL、FL维持培养的CD34+细胞的增殖及细胞周期分析结果相吻合:F租L组增殖速度最慢，其Cyclln的mRNA表达量最低，高峰时相出现最晚;FL组增殖速度最快，Cychn的mRNA表达量最高，高峰时相出现最早;空白对照组增殖速度居中，Cyclin的mRNA表达量及时相也居中。Westem Blot实验证明，在0d 时，即静止的CD34+细胞中未检测到eyeli山l、Cyeli心3、Cn以、eoK6蛋白的表达，3d时F租L组Cyclin D3、CDK6蛋白表达低于两个对照组，这也与细胞增殖分析结果相吻合，并且同文献报道的造血细胞中主要表达CyclinD3、CDK6相符。推测 F租L调节了参与造血干/祖细胞gO/gI期调控的Cyclin及CDK，使其处于较低表达水平，从而抑制细胞周期进程。 P21可抑制造血干细胞进入细胞周期，维持干细胞的稳定。P27缺陷对造血干细胞的数量，细胞周期及自我更新均没有影响，但是造血祖细胞的增殖和数量明显升高。同时，PZI和P27在造血细胞的分化过程中也发挥重要作用，参与诱导分化过程中的周期阻滞。在培养开始的8h，p21 mRNA就出现了一个明显上调，反映了Flt3表达阳性的细胞受其配体F班L的刺激，激活了下游的信号通路，而某些或某个转录因子的激活上调了pZI mRNA的表达。培养3d时FRJL组p27蛋白表达量低于空白对照组，FL组的表达量最高，又因为三组细胞的分化研

关键词：造血干细胞 FRIL 细胞周期 g0/g1期