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红曲菌胞外多糖对U251细胞的促凋亡作用及其软胶囊的工艺设计

红曲菌胞外多糖对U251细胞的促凋亡作用及其软胶囊的工艺设计

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作者：石小怡南昌大学

学位级别：硕士

胶质瘤是全球发病率最高的中枢神经系统原发性恶性肿瘤,耐药性限制了其治疗药物的开发,目前治疗胶质瘤的药物非常有限。因此,探索新型有效的抗胶质瘤药物是当务之急,对相关功能性产品的探索也一直在进行中。红曲菌多糖作为红曲菌的代谢... 详细信息

胶质瘤是全球发病率最高的中枢神经系统原发性恶性肿瘤,耐药性限制了其治疗药物的开发,目前治疗胶质瘤的药物非常有限。因此,探索新型有效的抗胶质瘤药物是当务之急,对相关功能性产品的探索也一直在进行中。红曲菌多糖作为红曲菌的代谢产物,不仅具有较低的毒性和多种生物活性,包括抗氧化、保护肝脏、阻止脂质吸收和免疫调节等,而且能够促进乳腺癌、结肠癌和肺癌等癌细胞凋亡,具有潜在的抗肿瘤特性,但其对胶质瘤癌细胞的作用机制尚不清楚。金雀异黄酮是一种植物雌激素,具有广泛的潜在健康益处,已有研究证明在红曲菌发酵培养基中加入金雀异黄酮可以改变多糖结构,从而提高其免疫调节活性。因此,本研究以经典恶性人脑神经胶质瘤细胞株U251为模型,探究红曲菌两种胞外多糖（emp和g-emp）对胶质瘤的作用效果,旨在为研发治疗胶质瘤的新药物或功能性产品提供新思路。主要研究内容与结果如下:（1）提取emp和g-emp并测定其理化性质、抗氧化活性、抗癌活性。结果表明金雀异黄酮的添加提高了红曲菌胞外多糖的产率、中性糖含量、糖醛酸含量以及对DPPH·、-OH·和ABTS+·自由基的清除率,并改变其单糖组成。流变学结果表明,emp和g-emp均表现出假塑性流体行为,g-emp表现出强凝胶样弹性行为。另外用CCK-8试剂盒检测emp和g-emp对U251细胞、人脐带间充质干细胞HUC-MSCs、巨噬细胞RAW264.7活力的影响,结果显示emp和g-emp均无毒性作用,且显著提高巨噬细胞RAW264.7活力以及降低U251细胞活力,其中g-emp免疫活性优于emp,emp抗癌活性优于g-emp。（2）初步探究了emp和g-emp对U251细胞促凋亡作用的机制。首先通过Annexin V-FITC/PI实验、Hoechst 33258染色、LDH检测结果确定emp和g-emp均显著降低U251细胞活力并促进其凋亡,emp抗癌效果最为显著且呈剂量依赖性。50、100、200、400和800μg/m L emp作用48 h的凋亡率为20.13%、23.83%、34.12%、49.52%和54.68%,g-emp作用48 h后细胞凋亡率依次为13.33%、26.13%、32.12%、28.13%和37.77%,且细胞碎片增多,细胞核以及细胞膜被破坏。其次测定了U251细胞内ROS、gSH-Px、CAT、SOD、MDA、MMP和ATP酶的变化。结果表明emp显著提高细胞内LDH、ROS、MDA含量,降低抗氧化酶gSH-Px、CAT、SOD和Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+/Mg2+-ATP酶活力,降低MMP最终启动线粒体凋亡途径,而g-emp未引起MMP下降,可能不依赖线粒体凋亡途径。最后利用Western blot技术测定Bax、Bcl-2、AKT、caspase 3、NF-κB通路和MAPK通路蛋白表达量的变化,结果显示PI3K/AKT、MAPK、NF-κB通路被激活,进而激活Bax、Bcl-2和caspase3。不同之处为高浓度g-emp会抑制MAPK通路进而抑制Bax蛋白表达。（3）采用RNA-Seq技术探究emp和g-emp对U251细胞促凋亡作用的通路。差异表达基因分析结果显示,对照组vs emp组共有1099个差异基因,其中表达上调的基因为783个,表达下调的基因为316个;对照组vs g-emp组共有285个差异基因,其中上调238个,下调47个;emp组vs g-emp组共有820个差异基因,其中上调289个,下调513个。KEgg富集分析显示,对照组vs emp组共有67条显著富集通路,对照组vs g-emp组共有63条显著富集通路,emp组vs g-emp组共有54条显著富集通路,其中与抗癌相关的显著富集通路主要有MAPK、NF-κB、IL-17和PI3K-Akt信号通路等。（4）最后,初步设计了红曲菌多糖软胶囊的制备工艺,检测了其中桔霉素、霉菌、大肠杆菌含量均符合国家相关标准要求,制备出具有良好抗癌作用的红曲菌多糖软胶囊,拓宽了红曲产品类型,为开发新型功能性产品提供新思路和理论支撑。

关键词：红曲菌金雀异黄酮 emp g-emp U251细胞凋亡 RNA-Seq 分子机制

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