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2株碳青霉烯类耐药g-杆菌的基因组学研究

2株碳青霉烯类耐药G-杆菌的基因组学研究

作者：彭渊南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景与目的碳青霉烯类抗生素具有抗菌谱广和抗菌活性强两大特点,对超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和/或头孢菌素酶（AmpC酶）高度稳定,是预防和治疗重症感染的最主要用药。基于抗生素的选择压力,耐碳青霉烯g-杆菌广泛流行,这无疑限制... 详细信息

研究背景与目的碳青霉烯类抗生素具有抗菌谱广和抗菌活性强两大特点,对超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和/或头孢菌素酶（AmpC酶）高度稳定,是预防和治疗重症感染的最主要用药。基于抗生素的选择压力,耐碳青霉烯g-杆菌广泛流行,这无疑限制了临床用药。在积极寻找对策的同时,多重耐药菌、新的耐药基因不断涌现,给临床治疗带来巨大挑战。为进一步研究耐碳青霉烯g-杆菌的耐药机制,为碳青霉烯酶基因突变、耐药性的水平转移与传播提供更充分的实验依据,为抗生素的合理使用提供实验室指导,对耐药菌株进行基因组学研究显得尤为重要。研究方法1.株菌来源与收集分离自我院检验科微生室2014～2015年接收粪便标本中的2株耐碳青霉烯g-杆菌。在含有4 μg/mL美罗培南（MEM）的麦康凯抗性平板上转种培养。通过纸片法于-80℃保存菌种。2.菌种鉴定与药物敏感性检测通过BD Phoenix 100全自动细菌鉴定仪进行种属鉴定和药物敏感性检测。3.全基因组的提取使用QIAgEN公司的细菌全基因组提取试剂盒获得细菌全基因组DNA。使用微量核酸蛋白浓度测定仪与琼脂糖凝胶电泳评估核酸浓度、纯度及降解程度。4.常见碳青霉烯酶基因的检测采用特异性引物,通过PCR检测常见碳青霉烯酶基因（NDM、KPC、SPM、VIM、IMP、OXA-48）及多粘菌素耐药基因（mcr）,PCR产物测序确认基因亚型。5.高通量测序对细菌全基因组DNA进行高通量测序并组装。6.质粒接合转移试验耐叠氮化钠大肠埃希菌J53（E.J53）为受体菌,进行肉汤接合转移试验。于含有4μg/mL美罗培南（多粘菌素）和150μg/mL叠氮化钠的共筛查平板上筛查接合子,对阳性接合子进行E-test药敏试验以及相关耐药基因验证。7.基因组学分析通过软件预测编码基因,使用各大数据库进行基因注释、蛋白注释及功能注释,重点分析耐药基因。使用NCBI数据库的在线分析工具对核酸序列进行比较基因组学分析以及耐药基因周围环境分析。对新发现的金属β-内酰胺酶基因blaAFM-1进行碱基差异分析、进化分析及蛋白结构预测。8.新型金属酶基因功能验证化学合成目的基因连接到载体质粒上,通过克隆表达及改良Hodge试验进行功能验证。研究结果1.目标菌株分离自我院微生物室2015年粪便标本中1株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌NFYY0065,首次在该菌种中检测到碳青霉烯酶基因blaNDM-5与多粘菌素耐药基因mcr-1共存;分离自我院微生物室2014年粪便标本中1株耐碳青霉烯粪产碱杆菌AN70,检测到新类型金属β-内酰胺酶编码基因,将其命名为blaAFM。2.高通量测序在肺炎克雷伯菌中分离得到1条染色体、1条blaNDM-5阳性质粒、1条mcr-1 阳性质粒;在粪产碱杆菌中分离得到1条染色体、1条blaAFM阳性质粒。所有序列均已提交至genBank数据库。3.质粒接合转移试验对疑似阳性接合子进行药敏试验以及耐药基因检测,表明耐药基因blaNDM-5、mcr-1与AFM及其质粒具有水平转移的能力。4.基因组学分析这2株g-杆菌均携带多种耐药基因。肺炎克雷伯菌中,blaNDM-5 基因形成基因簇“tnpA-IS3000-IS30-IS5-blaNDM-5-bleMBL-trpF-TAT-IS6-ISKox3”,位于IncX3型质粒;mcr-1基因由可移动元件ISAPl1介导,位于IncHI2型质粒。粪产碱杆菌中,新类型金属β-内酰胺酶基因blaAFM位于广寄主质粒IncW上,蛋白空间结构预测提示AFM酶活性中心双金属位点。5.新型金属酶基因功能验证阳性克隆菌株改良Hodge实验阳性,提示blaAFM转录翻译碳青霉烯酶。研究结论本课题对两株耐碳青霉烯g-杆菌进行基因组学研究,首次发现blaNDM-5与mcr-1共存于肺炎克雷伯菌,两质粒为不同的不相容群质粒,可稳定共存且具备水平转移与传播的能力;另外,本课题发现新类型金属β-内酰胺酶,将其编码基因命名为blaAFM,已提交至NCBI数据库,获得genBank检索号MK143105。为探讨耐药基因进化、流行提供了新的实验室依据,凸显了规范应用抗菌药、监测耐药菌、防控院内感染的重要性。

关键词： g-杆菌金属β-内酰胺酶碳青霉烯耐药基因多粘菌素耐药基因高通量测序基因组学分析

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1287株下呼吸道感染g-杆菌的耐药监测

中国医药导报 2009年第20期6卷 70-71页

作者：罗昌明王项锋孙嘉璐文杰河南省周口市中心医院药品科河南周口466000

目的:分析我院下吸道感染g-杆菌的菌群分布和耐药现状,为临床合理使用抗生素提供依据。方法:对我院2006～2008年呼吸内科病房下呼吸道感染g-杆菌患者送检的痰标本进行致病菌培养鉴定,按K-B琼脂扩散法进行常规药敏试验。结果:共分离g-杆... 详细信息

目的:分析我院下吸道感染g-杆菌的菌群分布和耐药现状,为临床合理使用抗生素提供依据。方法:对我院2006～2008年呼吸内科病房下呼吸道感染g-杆菌患者送检的痰标本进行致病菌培养鉴定,按K-B琼脂扩散法进行常规药敏试验。结果:共分离g-杆菌1287株,铜绿假单胞菌307株(23.9%)居首位,大肠埃希菌271(21.1%)次之,肺炎克雷伯菌218株(16.9%)。铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦、头孢吡肟较为敏感,嗜麦芽窄食单胞菌对多种抗生素的耐药率均较高。结论:下呼吸道感染g-杆菌的耐药性日益严重,应加强监测,有利于临床有效使用抗生素。

关键词：下呼吸道感染 g-杆菌耐药监测

2009～2011年茂名地区常见g-杆菌耐药率变化与抗菌药物使用量关系的研究

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中国当代医药 2012年第21期19卷 199-201页

作者：杨华林焕泽吴秀荣杨成密杨伟业李斌覃琼英张伟广东省茂名市人民医院药剂科广东茂名525000 广东省茂名市人民医院检验科广东茂名525000 广东省电白县人民医院药剂科广东电白525400 广东省茂名市中医院检验科广东茂名525000 广东省信宜市人民医院检验科广东信宜525300

目的通过分5个时间段统计2009年7月~2011年12月期间茂名地区4家医院感染常见的g-杆菌耐药变化及抗菌药物使用量,探讨抗菌药物使用量与常见g-杆菌耐药率之间的相关性,为制定茂名地区的抗菌药物管理措施提供依据.方法对2009年7月~2011... 详细信息

目的通过分5个时间段统计2009年7月~2011年12月期间茂名地区4家医院感染常见的g-杆菌耐药变化及抗菌药物使用量,探讨抗菌药物使用量与常见g-杆菌耐药率之间的相关性,为制定茂名地区的抗菌药物管理措施提供依据.方法对2009年7月~2011年12月间用于治疗常见g-杆菌感染的7 种抗菌药物使用量与医院感染常见g-杆菌耐药率进行统计,计算各药的用药频度（DDDs）,以细菌耐药率与目标抗菌药物的DDDs进行相关性分析.结果 2009年7月~2011年12月期间常见g-杆菌耐药率呈波动变化,大多数抗菌药物DDDs的变化与治疗目标菌的耐药率变迁呈显著正相关;三、四代头孢的大量使用与肠杆菌科细菌产ESBLs率之间呈正相关.结论抗菌药物的广泛大量使用与加速细菌耐药的产生和发展可能有着密切联系,加强抗菌药物的应用管理,规范抗菌药物的使用对延缓细菌耐药性的发展有着重要意义.

关键词： g-杆菌耐药率抗菌药物用药频度

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老年g^-杆菌性肺炎68例临床分析

海南医学 2001年第4期12卷 38-39页

作者：韩洁冯俊英郑州铁路局中心医院 450052

为探索老年人肺炎的特点，特将我院１９９４年１月～１９９８年７月收治的６８例６０岁以上老年人肺炎患者发病情况、临床特点和治疗作一回顾性分析。结果其中Ｇ－杆菌性肺炎占同期收住肺炎的１９．７％，占老年性肺炎的９４．４％。症... 详细信息

为探索老年人肺炎的特点，特将我院１９９４年１月～１９９８年７月收治的６８例６０岁以上老年人肺炎患者发病情况、临床特点和治疗作一回顾性分析。结果其中Ｇ－杆菌性肺炎占同期收住肺炎的１９．７％，占老年性肺炎的９４．４％。症状不典型，有“无呼吸道症状肺炎”之称。同时指出，呼吸和脉搏增快是老年性肺炎敏感的特征。痰菌培养以肺炎克雷伯氏杆菌占首位。治疗中要选用两种以上广谱抗菌药物或根据痰菌培养结果选用，注意避免肾毒性。早用、足量、联合、疗程要适当延长，同时注意原发病的治疗。

关键词： g-杆菌老年肺炎抗生素

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临床常见5种g-杆菌体外药敏实验结果分析

中国实验诊断学 2006年第7期10卷 699-700页

作者：孙艳田秀梅齐弋枢吉林省前卫医院检验科吉林长春130012

抗生素广泛使用,甚至滥用,造成耐药的细菌越来越多.药敏实验的作用也就显得愈加重要,我们将2003年3月到2005年9月临床分离出的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌对15种抗生素及铜绿假单胞菌、鲍曼氏不动杆菌对12种抗生素的体外... 详细信息

抗生素广泛使用,甚至滥用,造成耐药的细菌越来越多.药敏实验的作用也就显得愈加重要,我们将2003年3月到2005年9月临床分离出的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌对15种抗生素及铜绿假单胞菌、鲍曼氏不动杆菌对12种抗生素的体外敏感性研究结果,现报告如下.

关键词：体外药敏实验 g-杆菌临床常见肺炎克雷伯氏菌体外敏感性研究鲍曼氏不动杆菌大肠埃希氏菌铜绿假单胞菌阴沟肠杆菌抗生素

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医院内g-杆菌产酶检测及耐药性分析

实用医药杂志 2004年第5期21卷 400-402页

作者：李荣国毕汇文孙恩华济南市妇幼保健院检验科山东济南250001 山东大学齐鲁医院检验科山东济南250012

目的了解医院常见g-杆菌的产酶及耐药情况为临床控制感染提供依据。方法收集2002-01～12住院病人分离的对三代头孢菌素至少有一种耐药的易产酶g-杆菌,采用传统K-B法进行药物监测,并使用改良的三维试验法检测细菌产酶情况。结果所监测大... 详细信息

目的了解医院常见g-杆菌的产酶及耐药情况为临床控制感染提供依据。方法收集2002-01～12住院病人分离的对三代头孢菌素至少有一种耐药的易产酶g-杆菌,采用传统K-B法进行药物监测,并使用改良的三维试验法检测细菌产酶情况。结果所监测大肠埃希菌与肺炎克雷伯杆菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检出率为94.0%、100%,大肠埃希菌AmpC的检出率为3.0%;易产诱导酶阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、粘质沙雷菌、奇异变形杆菌ESBLs检出率分别为47.0%、86.0%、80.0%、100%、40.0%。其中阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌AmpC酶的检出率为29.0%、14.0%、13.0%;鲍曼不动杆菌AmpC的检出率为33.0%;另外有7.0%的弗劳地枸橼酸杆菌、3.0%的大肠埃希菌产SSBL。亚胺培南是治疗严重易产酶细菌感染的首选药物。结论g-杆菌存在严重耐药,要正确区分细菌产酶机制,为临床控制感染提供正确的依据。

关键词： g-杆菌医院感染 β-内酰胺酶耐药性

251株产ESBLs的g^-杆菌药敏分析及临床意义

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宁夏医学杂志 2012年第8期34卷 791-792页

作者：陆军高占珍王金明宁夏固原市人民医院检验科宁夏固原756000

目的了解革兰氏阴性杆菌产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检出率和耐药性。方法收集不同患者痰、尿、伤口分泌物等标本379株,用法国梅里埃公司生产ATBBLSE试剂条,检测超广谱ESBLs,并同时进行药敏试验。结果在379株革兰氏阴性(g-)杆菌中,... 详细信息

目的了解革兰氏阴性杆菌产生超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检出率和耐药性。方法收集不同患者痰、尿、伤口分泌物等标本379株,用法国梅里埃公司生产ATBBLSE试剂条,检测超广谱ESBLs,并同时进行药敏试验。结果在379株革兰氏阴性(g-)杆菌中,有251株革兰氏阴性杆菌产超广谱ESBLs,产酶率66.23%;在123株大肠埃希菌、126株肺炎克雷伯菌、54株肠杆菌、76株其它肠杆菌中ESBLs检出率分别为70.73%、74.60%、62.96%、47.37%,感染部以呼吸道为主(主要是肺炎克雷伯菌),其次为泌尿生殖道和伤口渗液(主要是大肠埃希菌),产ESLBs菌对亚胺培南、美洛培南敏感,阿米卡星较敏感。结论革兰氏阴性菌是感染的主要致病菌,及时、准确地检测出耐药菌株及其耐药机制,指导临床合理使用抗生素,延缓细菌耐药性的产生、控制耐药菌株的播散,以降低院内感染。

关键词： g-杆菌 β-内酰胺酶超广谱耐药性

临床常见五种g^-杆菌体外药敏试验结果分析

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医学信息（中旬刊） 2010年第9期5卷 2385-2386页

作者：王艳秋张巧梅内蒙古包头市北方重工医院检验科内蒙古包头014000

抗生素广泛使用,甚至滥用,造成耐药的细菌越来越多,药敏试验的作用也就显得愈加重要.我们将2007年3月到2009年5月,临床分离出的大肠埃希氏菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌对15种抗生素及铜绿假单胞菌、鲍曼氏不动杆菌对12种抗生素的体... 详细信息

抗生素广泛使用,甚至滥用,造成耐药的细菌越来越多,药敏试验的作用也就显得愈加重要.我们将2007年3月到2009年5月,临床分离出的大肠埃希氏菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌对15种抗生素及铜绿假单胞菌、鲍曼氏不动杆菌对12种抗生素的体外敏感性研究结果,现报告如下:

关键词： g-杆菌体外药敏试验结果分析

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头孢吡肟对g^-杆菌的药物敏感率的分析

重庆医学 2001年第2期30卷 165-166页

作者：李童王晶白俊华重庆市第三人民医院 400014

头孢吡肟(Cefepime)是一种半合成第四代广谱注射用头孢菌素，对g＋菌和g－杆菌都具有良好的抗菌活性。本文就我院1999年3月～2000年5月住院患者痰培养g－杆菌对头孢吡肟的药敏试验与其它6种抗生素的药敏试验进行比较，并作如下分析。1... 详细信息

头孢吡肟(Cefepime)是一种半合成第四代广谱注射用头孢菌素，对g＋菌和g－杆菌都具有良好的抗菌活性。本文就我院1999年3月～2000年5月住院患者痰培养g－杆菌对头孢吡肟的药敏试验与其它6种抗生素的药敏试验进行比较，并作如下分析。1　资料与方法1.1　临床资料　系1999年3月～2000年5月住院患者共100例，年龄26～88岁，平均年龄70岁。其中慢支炎、肺气肿67例，肺心病38例，气胸3例，肺炎27例，肺癌5例，支气管扩张4例，心血管疾病31例，糖尿病7例，震颤麻痹1例。

关键词：头孢吡肟 g-杆菌药物敏感染