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基于碘离子协同纳米模拟酶催化在比色传感中的应用及苝二酰亚胺检测多种microRNA

基于碘离子协同纳米模拟酶催化在比色传感中的应用及苝二酰亚胺检...

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作者：刘嘉丽云南师范大学

学位级别：硕士

纳米模拟酶与天然酶相比具有合成所需费用廉价、催化活性可调控、生物相容性良好、苛刻条件下的超高稳定性以及可大规模生产等优点,使其在生物传感领域中展现出巨大的潜在应用前景。多孔材料由于具有自身固有的多孔结构、超高的比表面... 详细信息

纳米模拟酶与天然酶相比具有合成所需费用廉价、催化活性可调控、生物相容性良好、苛刻条件下的超高稳定性以及可大规模生产等优点,使其在生物传感领域中展现出巨大的潜在应用前景。多孔材料由于具有自身固有的多孔结构、超高的比表面积、超高的孔隙率、孔隙可调性并具有过氧化物纳米模拟酶催化活性等优点,可用于生物催化领域。本论文合成Zn-共价三嗪骨架(Zn-Covalent triazine framework,Zn-CTF)材料,并充分应用其超高的比表面积、易于制备、较大的孔隙率、较好的稳定性、良好的生物相容性等的特点;合成g-四链体/hemin DNA酶(g4/hemin)并使用Zn-CTF和g4/hemin两者构建无标记可视化比色传感。此外,还合成了具有广谱和无标记优势的猝灭剂苝二酰亚胺(PDI)用于多目标检测。本文的工作具体分为以下四个部分:(1)以具有类似过氧化物纳米模拟酶性质的Zn-CTF作为催化活性物质,构建一种无标记型可视化的生物比色传感体系用于HO和乙酰胆碱脂酶活性(ACh E)的定量检测。当碘离子(I)嵌入Zn-CTF后,Zn-CTF的催化能力显著提升。I可协同Zn-CTF催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB),使体系颜色先由无色被氧化变为为蓝色,提高传感器的灵敏度。采用紫外可见分光光度计(UV-Vis)检测氧化态TMB(Ox TMB)在652 nm波长处的吸光度变化情况。TMB在氧化状态下的产物Ox TMB因具有良好的光热效应,可作为光热探针进行光热能量之间的转换,通过体系的温度变化进行分析检测。吸光度值和温度变化值随HO浓度在1nmol/L～2 mmol/L范围内的增大而增大。建立信号减小型的比色传感方法检测ACh E,巯基乙酰胆碱(ATch)水解产生的巯基胆碱可抑制TMB显色,在0.01U/L～60 U/L范围内,吸光度随ACh E浓度增大而降低,检测限为2 m U/L(S/N=3)。(2)合成富含鸟嘌呤碱基(g碱基)序列的赭曲霉素(OTA)适配体,当加入目标物OTA时,适配体可自组装成反平行g-四链体(g4)结构,将氯化血红素(hemin)标记在g4上可形成过氧化物模拟酶g4/hemin,I也可增强hemin过氧化物纳米模拟酶活性,由此构建了一种信号放大型可视化比色传感体系用于OTA的定量检测。I协同g4/hemin催化HO产生大量羟基自由基(·OH),氧化TMB由无色变成蓝色。采用紫外可见分光光度计(UV-Vis)检测Ox TMB在652 nm处的吸光度变化,吸光度值随OTA浓度在0.005 ng/m L～180 ng/m L范围内的增大而增大,获得的检测限为1 pg/m L(S/N=3)。与商业化的酶联免疫试剂盒(ELISA)相比,该生物传感器的检测限降低了2个数量级。(3)基于上一个的工作,g-四链体与hemin可组装成过氧化物纳米模拟酶,加入I协同g4/hemin催化HO氧化TMB使其从无色变成蓝色。在本实验中,为了进一步提高g4/hemin的催化活性,采用酶级联反应将g4/hemin共同固定在平台上,加入突变型p53基因可启动杂交链式反应(HCR)组装g4并调节hemin模拟酶活性,由此构建了一种以突变型p53基因为单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymophisms,SNP)模型的可视化比色传感器,用于级联信号放大检测,可选择性地检测突变型p53基因片段。采用紫外可见分光光度计(UV-Vis)检测体系在652 nm处的吸光度变化,吸光度值随着目标物突变型p53基因浓度在10 pmol/L～600 nmol/L范围内的增大而增大,获得的检测限为2 pmol/L(S/N=3)。(4)mi RNA的异常表达与许多癌症相关,因此mi RNA的检测在癌症中的诊断占据着极其重要的地位。苝二酰亚胺(PDI)可作为广谱猝灭剂,能猝灭DNA-RNA双链标记的荧光团,从绿色荧光团FAM到红色荧光团Cy5。修饰不同荧光基团的DNA与多种mi RNA特异性杂交形成双链,当双链特异性核酸酶(Duplex-specific nuclease,DSN)加入时可释放出荧光基团,由此构建了一种以PDI为猝灭平台的荧光传感用于多种mi RNA的检测。采用荧光光谱分析仪检测FAM、TAMRA和Cy5的荧光强度变化,当mi RNA-21、mi RNA-141、mi RNA-155这三种mi RNA的浓度不断增大时,荧光强度也会逐渐增大。mi RNA-21检测范围为2 fmol/L～20 pmol/L,检测限为0.67 fmol/L(S/N=3);mi RNA-141检测范围为4fmol/L～25 pmol/L,检测限为1.33 fmol/L(S/N=3);mi RNA-155检测范围为3fmol/L～18 pmol/L,检测限为1 fmol/L(S/N=3)。

关键词：纳米模拟酶 g-四链体/hemin 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺苝二酰亚胺乙酰胆碱酯酶赭曲霉素A 突变型p53基因 microRNA

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