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陆军军医大学学报 2024年第11期46卷 1254-1264页

作者：张忠意唐于广代金雨谢宗义重庆医科大学附属第二医院神经外科重庆400010

目的探究激活g蛋白偶联受体39(g-protein-coupled receptor 39,gPR39)对小鼠脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后神经炎症和脑损伤的影响及其作用机制。方法176只雄性C57/BL6小鼠按随机数字表法分成8组:Sham组(n=42)、ICH组(n=34)、ICH+Vehicle组(n=32)、ICH+TC-g 1008组(n=44)、ICH+gPR39 siRNA组(n=6)、ICH+Scramble siRNA组(n=6)、ICH+TC-g 1008+666-15组(n=6)、ICH+TC-g 1008+Vehicle 2组(n=6)。通过小鼠自体血建立ICH模型。在小鼠ICH建模后1 h和25 h灌胃gPR39特异性激动剂TC-g 1008治疗。在ICH建模前24 h,通过侧脑室注射gPR39 siRNA、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)抑制剂666-15分别抑制内源性的gPR39和p-CREB的表达。小鼠ICH后48 h,通过改良的加西亚实验、前肢置放实验、转角实验评估小鼠短期的神经功能缺陷,脑组织湿/干法测定脑含水量;免疫荧光检测血肿周围脑组织gPR39与神经元、小胶质细胞共定位和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)在神经元中的表达情况;ELISA检测血肿周围组织中的白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的含量;TUNEL检测血肿周围凋亡神经元的数量;尼氏染色评估血肿周围神经元损伤情况;Western blot检测血肿周围脑组织中gPR39、p-CREB、CREB、NRLP3、裂解型半胱天冬酶1(Cleaved caspase-1,C-caspase-1)、gasdermin-D蛋白(gSDMD)的表达。结果gPR39在小鼠ICH后48 h达到表达高峰(Pg 1008(24 mg/kg)激活gPR39后显著改善了小鼠ICH后改良的加西亚实验评分,左前肢放置成功率和左转次数增加(Pganglia,Bg)和皮层(cortex,CX)的脑水肿显著减轻(PgSDMD的表达和炎症相关因子IL-1β、TNF-α、MPO的水平降低(PgPR39和下调p-CREB的表达显著增加了小鼠ICH后血肿周围脑组织焦亡相关分子的表达和炎症相关因子的含量(PgPR39激活可能部分通过CREB信号通路抑制小鼠ICH后的神经炎症和脑损伤,gPR39可能是ICH后减轻神经炎症和脑损伤潜在的治疗靶点。

关键词：脑出血细胞焦亡脑损伤 g蛋白偶联受体39

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胞磷胆碱钠对大鼠发育期惊厥性脑损伤的保护作用

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中国临床药理学杂志 2024年第17期40卷 2528-2532页

作者：章波赵晓冬许铖宋磊南通市第一人民医院/南通大学第二附属医院儿科江苏南通226000

目的探究胞磷胆碱钠对大鼠发育期惊厥性脑损伤的保护作用及其机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、模型组和实验组,每组10只,用腹腔注射氯化锂+氢溴酸东莨菪碱+毛果芸香碱的方法建立大鼠发育期惊厥模型。造模成功后实验组大鼠腹腔注射胞... 详细信息

目的探究胞磷胆碱钠对大鼠发育期惊厥性脑损伤的保护作用及其机制。方法将SD大鼠随机分为对照组、模型组和实验组,每组10只,用腹腔注射氯化锂+氢溴酸东莨菪碱+毛果芸香碱的方法建立大鼠发育期惊厥模型。造模成功后实验组大鼠腹腔注射胞磷胆碱钠(500 mg·kg^(-1)),每日1次,连续给药1周。对照组和模型组在相同时间点腹腔注射等量0.9%NaCl。用griess法检测血清中一氧化氮(NO)浓度,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测脑组织中白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL^(-1)β)含量,用生化法检测脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测脑组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的水平,用蛋白质印迹(Western blot)法检测大鼠脑组织中g蛋白偶联受体39抗体(gPR39)、蛋白激酶B(AKT)和细胞外信号调节激酶(ERK)的蛋白水平。结果对照组、模型组和实验组大鼠脑组织IL-6含量分别为(37.16±6.34)、(119.31±19.26)和(74.52±12.37)pg·mL^(-1),IL^(-1)β含量分别为(7.46±1.25)、(42.73±8.41)和(24.18±4.62)pg·mL^(-1),SOD活性分别为(384.51±34.72)、(229.16±27.42)和(218.47±33.59)U·gp^(-1),MDA含量分别为(1.06±0.15)、(1.82±0.21)和(1.24±0.17)U·gp^(-1),血清NO含量分别为(13.62±2.06)、(29.34±5.37)和(16.55±3.15)μmol·L^(-1),iNOS mRNA相对表达水平分别为1.00±0.15、2.19±0.24和1.62±0.18,gPR39蛋白相对表达水平分别为0.41±0.05、1.03±0.19和0.74±0.08,p-AKT/AKT分别为0.46±0.07、0.13±0.04和0.36±0.05,p-ERK/ERK分别为0.37±0.11、0.11±0.03和0.42±0.05。对照组的上述指标与模型组比较,在统计学上差异均有统计学意义(PgPR39/AKT/ERK信号通路的激活有关。

关键词：胞磷胆碱钠蛋白激酶B 发育期惊厥 g蛋白偶联受体39 细胞外信号调节激酶脑损伤

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齐墩果酸激活gPR39对发育期惊厥性脑损伤大鼠神经发育的影响

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中国临床药理学杂志 2024年第10期40卷 1468-1472页

作者：李振宏纪剑清许运琳南昌大学附属赣州医院儿科江西赣州341000

目的研究齐墩果酸(OA)对发育期惊厥性脑损伤大鼠神经发育的改善作用及其作用机制。方法将SD大鼠随机分为RS组(青霉素诱导大鼠模型)、RS+OA组(青霉素+20 mg·kg^(-1)OA)、RS+OA+gPR39 CRISPR组[青霉素+20 mg·kg^(-1)OA+5×10^(8)PFU的g... 详细信息

目的研究齐墩果酸(OA)对发育期惊厥性脑损伤大鼠神经发育的改善作用及其作用机制。方法将SD大鼠随机分为RS组(青霉素诱导大鼠模型)、RS+OA组(青霉素+20 mg·kg^(-1)OA)、RS+OA+gPR39 CRISPR组[青霉素+20 mg·kg^(-1)OA+5×10^(8)PFU的g蛋白偶联受体39(gPR39)CRISPR质粒]、RS+OA+EX527组[青霉素+20 mg·kg^(-1)OA+10 mg·kg^(-1)的沉默信息调节因子1(SIRT1)抑制剂EX527],每组均为10只大鼠。通过神经发育实验、旷场实验及新异物实验检测大鼠神经发育、学习记忆能力;用免疫荧光染色检测小胶质细胞gPR39表达水平;用试剂盒检测氧化应激相关表达;用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)实验检测相关基因mRNA表达水平。结果RS组、RS+OA组、RS+OA+gPR39 CRISPR组和RS+OA+EX527组的gPR39 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.05、1.29±0.14、0.97±0.11和1.05±0.09,SIRT1 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.10、1.33±0.20、1.05±0.09和1.01±0.06,受体γ辅激活因子1α(PgC-1α)mRNA相对表达水平分别为1.00±0.16、1.34±0.15、1.03±0.07和0.93±0.11,核因子E2相关因子2(Nrf2)mRNA相对表达水平分别为1.00±0.08、1.45±0.21、0.89±0.10和0.96±0.08。RS组的上述指标与RS+OA组比较,RS+OA+gPR39 CRISPR组、RS+OA+EX527组的上述指标分别与RS+OA组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均PgPR39激活SIRT1/PgC-1α/Nrf2通路抑制氧化应激途径,改善青霉素诱导的发育期惊厥性脑损伤大鼠神经发育及学习记忆能力的影响。

关键词：齐墩果酸发育期惊厥性脑损伤神经发育学习记忆能力 g蛋白偶联受体39 沉默信息调节因子1/受体γ辅激活因子1α/核因子E2相关因子2信号

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gPR39mRNA在糖尿病大鼠不同组织中的表达变化

GPR39mRNA在糖尿病大鼠不同组织中的表达变化

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作者：张鑫山东大学

学位级别：硕士

目的：采用相对定量实时荧光定量PCR法检测正常大鼠与糖尿病大鼠胰腺组织、胃组织及肾脏中gPR39mRNA表达变化情况,探讨其在糖尿病发生发展中的作用和机制。方法：体重110～130g的健康雄性Wistar大鼠30只,取15只作为正常对照组,其余15... 详细信息

目的：采用相对定量实时荧光定量PCR法检测正常大鼠与糖尿病大鼠胰腺组织、胃组织及肾脏中gPR39mRNA表达变化情况,探讨其在糖尿病发生发展中的作用和机制。方法：体重110～130g的健康雄性Wistar大鼠30只,取15只作为正常对照组,其余15只造模。普食喂养一周后造模,糖尿病模型采用腹腔注射链脲佐菌素60mg／kg(STZ),溶于0.1mol·L-1枸橼酸盐缓冲液中配制为6g／L(pH值4.15),对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液。48h后尾尖取血,血糖≥16.7mmol／L者确定为糖尿病模型。各组均喂养两周后处死,大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取胰腺、胃组织及肾脏放入离心管,经液氮速冻后保存于-80℃冰箱。液氮研磨,Trizol reagent提取总RNA,1%甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性,一步法合成第一链cDNA后保存于-20℃冰箱。实时荧光定量PCR仪构建标准曲线,控制目的基因及内参基因的扩增效率在95-105%,自动绘制扩增动力曲线熔解曲线,5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。采用相对定量法检测正常大鼠与糖尿病大鼠胰腺组织、胃组织及肾脏中gPR39mRNA相对表达变化情况。所有数据均以x±s表示,并采用SPSS11.1统计软件进行数据整理和统计,两组间比较采用两样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,PgPR39mRNA在正常大鼠各组织中均有表达,胰腺组织相对表达量为1,与胃组织相对表达量0.23,肾脏相对表达量0.62相比,差异有统计学意义(PgPR39mRNA在糖尿病大鼠胰腺组织中表达上调(P0.05)。结论：①在糖尿病大鼠中胰腺中,gPR39可能通过多种机制影响代谢功能,并在需求增加时刺激胰岛素分泌。②gPR39可能具有抑制摄食、延缓胃排空的作用,提示Obestatin可能是gPR39的配体。③gPR39在肾脏代谢中可能不发挥作用。意义：gPR39可能与内分泌功能及代谢功能有关,并参与了糖尿病的发生发展。gPR39可能是在糖尿病的发生发展中起保护作用的一个因子,作为一个治疗靶点,其激动剂在治疗糖尿病中可能具有重要的意义

关键词： g蛋白偶联受体39 肥胖抑制素糖尿病荧光定量PCR

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锌敏感受体gPR39对产肠毒素大肠杆菌ETEC F4ac诱导仔猪肠道细胞凋亡的影响

锌敏感受体GPR39对产肠毒素大肠杆菌ETEC F4ac诱导仔猪肠道细胞凋...

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作者：吴云平扬州大学

学位级别：硕士

g蛋白偶联受体39（gPR39）,是一种锌离子敏感受体,它能感知细胞外锌离子（Zn2+）的变化,介导Zn2+的信号传递,并参与调控生物体内众多的生理活动。例如,促进上皮细胞的增殖与分化,调节离子转运等。近年来,随着研究的深入,gPR39的结构和... 详细信息

g蛋白偶联受体39（gPR39）,是一种锌离子敏感受体,它能感知细胞外锌离子（Zn2+）的变化,介导Zn2+的信号传递,并参与调控生物体内众多的生理活动。例如,促进上皮细胞的增殖与分化,调节离子转运等。近年来,随着研究的深入,gPR39的结构和功能被逐渐挖掘,其在胃肠道、神经系统、骨骼等组织中的作用引发越来越多的关注。产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia Coli,ETEC）是导致人类和幼畜腹泻的重要病原体,其引起的新生及断奶仔猪腹泻发病率较高,能够给养猪业造成巨大的经济损失。前期研究发现,ETECF4ac感染IPEC-J2细胞后会诱导细胞凋亡。有报道称,gPR39可以在神经细胞、巨噬细胞中抑制不良刺激引起的细胞凋亡。那么gPR39是否能够抑制F4ac感染所引起的肠道细胞凋亡?为了验证这一假设,本研究探索了gPR39对F4ac诱导仔猪肠道细胞凋亡的影响,以期进一步阐明F4ac的致病机理,为F4ac的预防和治疗提供新思路。同时,本研究首次探索了不同Zn2+浓度条件下,Zn2+结合位点对gPR39功能的影响,为进一步研究gPR39的功能奠定基础。研究一为了进一步研究gPR39的结构和功能,根据genBank上猪gPR39 mRNA序列设计合成特异性引物,提取猪肠道组织的RNA,并以反转录获得的cDNA为模板,PCR扩增gPR39-C端基因片段,构建原核表达系统。重组质粒测序和酶切结果显示,gPR39-C端基因已正确插入pET28a（+）原核表达载体;SDS-PAgE结果证明重组蛋白为包涵体,且纯化产物在20 kDa处有目的蛋白条带出现;ELISA和Western blot结果显示,成功制备gPR39-C端蛋白的多克隆抗体。gPR39-C端蛋白的成功表达和多克隆抗体的成功制备,为进一步探索gPR39的功能奠定了基础。研究二为了探索不同浓度Zn2+对gPR39基因表达量的影响,根据genBank上猪gPR39 mRNA序列设计合成特异性引物,提取猪肠道组织RNA,并反转录成cDNA第一链,RT-PCR扩增猪gPR39全长基因,构建pcDNA3.1-3flag-gPR39重组质粒。之后将重组质粒中gPR39的Zn2+结合位点进行定点突变。pcDNA3.1-3flag-gPR39及其突变体质粒瞬时转染至IPEC-J2细胞后,加入不同浓度的Zn2+进行刺激,通过实时荧光定量PCR检测gPR39的基因表达。重组质粒测序和酶切结果显示,gPR39基因已正确插入pcDNA3.1-3flag载体中;重组质粒测序和琼脂糖凝胶电泳结果显示,重组质粒中gPR39的Zn2+结合位点已被成功突变;荧光定量结果显示,25 μM Zn2+能够较好的刺激IPEC-J2细胞中gPR39的基因表达,且Zn2+关键位点的突变使gPR39丧失了感知Zn2+刺激的能力,同时His17位点可能在gPR39感知Zn2+浓度变化中更为重要。研究三为了探索gPR39在F4ac诱导仔猪肠道细胞凋亡中的功能,将pcDNA3.1-3flag-gPR39及其Zn2+结合位点突变体质粒转染到IPEC-J2细胞中,构建稳定表达细胞系;在有无TC-g 1008刺激和有无F4ac感染条件下,测定稳定细胞系中cAMP、cgMP的含量和CERB、SRE的活性,以及细胞中凋亡相关基因和蛋白的表达。结果表明:1.成功构建gPR39及其Zn2+结合位点突变的稳定表达细胞系。***3.1-3flag-gPR39-IPEC-J2细胞中表达的gPR39具有生物活性,且可能通过gα s和gα 12/13的活化激活下游信号分子,同时Zn2+结合位点的突变会抑制gPR39蛋白的活性。***39刺激剂TC-g 1008,可以刺激IPEC-J2细胞和gPR39及其突变体稳定表达细胞中gPR39的基因表达,但能抑制gPR39及其突变体稳定表达细胞中gPR39的活性。4.在F4ac感染条件下,gPR39能够在一定程度上抑制细胞凋亡。***2+结合位点突变后,与正常gPR39相比,gPR39突变体倾向于促进F4ac诱导的肠道细胞凋亡,但凋亡相关蛋白的表达情况还需进一步验证。

关键词： g蛋白偶联受体39 锌离子产肠毒素大肠杆菌F4ac 细胞凋亡 IPEC-J2细胞

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