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人源诺如病毒衣壳蛋白抗原库构建及GⅡ.17型变异株进化机制研究

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人源诺如病毒衣壳蛋白抗原库构建及GⅡ.17型变异株进化机制研究

作者：左月婷华南理工大学

学位级别：硕士

诺如病毒(Norovirus,NoV)是引起非细菌性胃肠炎的重要病原。由于一直缺乏完善的细胞培养系统与小动物感染模型,极大地限制了疫苗和抗病毒药物的研究。NoV有丰富的遗传多样性,但不同型别毒株间难以形成免疫交叉保护效果。因此,解析不同... 详细信息

诺如病毒(Norovirus,NoV)是引起非细菌性胃肠炎的重要病原。由于一直缺乏完善的细胞培养系统与小动物感染模型,极大地限制了疫苗和抗病毒药物的研究。NoV有丰富的遗传多样性,但不同型别毒株间难以形成免疫交叉保护效果。因此,解析不同基因型间免疫交叉的分子机制将为病毒疫苗设计提供重要理论支持。在过去几十年里,gⅡ.4型一直是造成暴发的主要流行基因型,然而在2014/2015年冬天,GⅡ.17 Kawasaki变异株的出现一度超过gⅡ.4引发了新的流行高峰。因此,探究NoV新现变异株流行性的分子机制将为病毒防控提供新思路。本论文以NoV常见基因型代表株为研究对象,通过表征各基因型毒株VP1蛋白的免疫原性特点,分析表征了病毒免疫原性与遗传多样性的关联。此外,还针对衣壳蛋白变异影响GⅡ.17型新现变异株流行性的分子机制展开研究,具体工作做如下:1.人源NoV衣壳蛋白抗原库的构建。收集整理NoV基因组数据库信息,选择9株gI型(gI.1-gI.9)和19株gⅡ型(gⅡ.1-gⅡ.22,不包括猪源的gⅡ.11、gⅡ.18和gⅡ.19)代表毒株。通过大肠杆菌原核表达系统制备了28个不同基因型的病毒衣壳P蛋白。2.人源NoV衣壳P蛋白的免疫多样性。将制备的P蛋白免疫小鼠制备抗血清,ELISA结果显示每个抗血清效价均达10以上。在此基础上评价不同基因型病毒抗血清的结合广谱性。结果显示73.9%的抗血清广谱性较弱;gⅡ.5型抗血清可与7种病毒衣壳蛋白产生免疫交叉反应。初步显示gⅡ.5具有作为多价疫苗的潜力。此外,病毒P蛋白序列比对及进化分析显示仅16.5%的位点是保守的,保守位点423-431 aa、462-474 aa和517-531 aa可能是基因型间产生免疫交叉反应的原因。3.基于交叉免疫反应的GⅡ.17型NoV进化机制研究。选择GⅡ.17型NoV四个基因簇(A-D)的代表毒株制备衣壳P蛋白,免疫小鼠获得抗血清。唾液受体结合实验显示新现变异株(GⅡ.17 C和GⅡ.17 D)与A/B/O型HBgA及PgM的结合能力强于早先毒株(GⅡ.17 A和GⅡ.17 B),表明GⅡ.17在进化过程中受体结合位点出现改变。不同基因簇间的血清抗体交叉反应显示早期毒株抗血清与新现变异株免疫应答较高,OD 450值在0.8-1.16之间;新现变异株株抗血清与早期毒株免疫应答较低,OD 450值在0.26-0.56之间。受体阻断实验显示早期毒株抗血清无法阻止新现变异株与受体结合。最后,突变分析显示353-363 aa、373-384 aa、394-404 aa和444-454 aa片段是影响GⅡ.17型内免疫交叉反应的重要位点。以上数据表明,最新的大流行变异株GⅡ.17 C和GⅡ.17 D通过受体结合能力的改变和抗原变异逃避了早先GⅡ.17 A和GⅡ.17 B毒株的群体免疫。本论文以NoV常见基因型代表株衣壳蛋白VP1为研究对象,系统性表征其免疫多样性,阐明基因型间免疫交叉反应的分子机制,为疫苗研制提供理论基础。同时以GⅡ.17型病毒衣壳蛋白的进化过程为切入点,理性设计衣壳蛋白突变体以解析关键氨基酸突变对免疫原性的影响,系统阐释了不同基因簇变异株受体结合功能的差异及免疫原性的变化,为病毒防控策略提供了新思路。

关键词：诺如病毒衣壳蛋白免疫反应 GⅡ.17 进化机制

一起诺如病毒GⅡ.17引起的成人腹泻病原学基因诊断研究

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环境与健康杂志 2016年第7期33卷 614-616页

作者：陆翌禹秦萌董晓根尉秀霞封慧茹汤旭武清锐李洁北京市丰台区疾病预防控制中心微生物检验科北京100071

目的针对一起北京市丰台区2014年10月暴发的急性胃肠炎进行病原基因研究,鉴定其病原体,并对其基因分型做进一步分析。方法应用实时荧光定量PCR对疫情中采集的50份样品进行诺如病毒检测,检测后的阳性样本经逆转录RT-PCR扩增,对其产物测序... 详细信息

目的针对一起北京市丰台区2014年10月暴发的急性胃肠炎进行病原基因研究,鉴定其病原体,并对其基因分型做进一步分析。方法应用实时荧光定量PCR对疫情中采集的50份样品进行诺如病毒检测,检测后的阳性样本经逆转录RT-PCR扩增,对其产物测序,进行基因数据库比对,应用Mega 5.0软件构建序列进化树分析。结果 50份疫情样品中,诺如病毒阳性18份。阳性样本基因扩增后测序所得序列与基因数据库比对发现,18份阳性样本均为GⅡ.17型,阳性率为36%。结论本次北京市丰台区暴发的急性胃肠炎疫情是由罕见的诺如病毒GⅡ.17引起。

关键词：诺如病毒 GⅡ.17 基因分型

大连地区在食源性腹泻病例中检出GⅡ.17诺如病毒

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中国卫生检验杂志 2019年第13期29卷 1561-1563页

作者：栾明春郎兴莹于蕾薄志坚大连市疾病预防控制中心

目的了解大连地区流行的gⅡ型诺如病毒基因特征及其分布,为预防控制诺如病毒流行提供依据。方法采用荧光定量RT-PCR方法对2015年大连地区哨点医院上送的1 253份食源性腹泻病例粪便标本进行gⅡ型诺如病毒检测,对部分阳性标本进行亚型检... 详细信息

目的了解大连地区流行的gⅡ型诺如病毒基因特征及其分布,为预防控制诺如病毒流行提供依据。方法采用荧光定量RT-PCR方法对2015年大连地区哨点医院上送的1 253份食源性腹泻病例粪便标本进行gⅡ型诺如病毒检测,对部分阳性标本进行亚型检测和基因特征分析。结果 1 253份标本中,检出gⅡ诺如病毒20份,阳性率为1.6%,其中8株gⅡ型诺如病毒经ORF1和ORF2连接区扩增和测序,发现5株为GⅡ.17,3株为gⅡ.4。进化树分析发现,本次大连地区检出的GⅡ.17和gⅡ.4分别与2015年韩国株和2015年中国台湾株亲缘关系密切。结论大连地区存在GⅡ.17和gⅡ.4诺如病毒流行,GⅡ.17诺如病毒在大连地区首次被检出。GⅡ.17是否是大连地区的优势流行株,还有待进一步跟踪监测。

关键词：诺如病毒 GⅡ.17 基因特征

一种高灵敏度的GⅡ.17型诺如病毒基因组扩增方法

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一种高灵敏度的GⅡ.17型诺如病毒基因组扩增方法

2015年-2017年湖州诺如病毒感染的流行特征研究

中国食品科学技术学会第十三届年会

作者：薛亮吴清平蔡伟程陈港吴浩明张菊梅广东省微生物研究所华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省微生物应用新技术公共实验室

目的:本研究拟根据"4+1+1"扩增策略,建立一种快速、灵敏的gII.17型诺如病毒基因组扩增方法。方法与结果:首先根据genBank中已有gII.17型诺如病毒基因组序列的多重比对结果,理性设计了6对病毒基因组扩增引物,用于扩增获得可覆盖病毒基因... 详细信息

目的:本研究拟根据"4+1+1"扩增策略,建立一种快速、灵敏的gII.17型诺如病毒基因组扩增方法。方法与结果:首先根据genBank中已有gII.17型诺如病毒基因组序列的多重比对结果,理性设计了6对病毒基因组扩增引物,用于扩增获得可覆盖病毒基因组的6条重叠片段。同时,还设计了2条测序引物II.17-Seq1R和II.17-Seq6F,用于补充基因组的两端序列。通过采用终点稀释RT-PCR方法,证实了新设计引物均可达到常规检测引物g2SKF/g2SKR的灵敏度水平。最后,应用新建立方法在一个工作日内就成功获得了9条广州地方的gII.17型诺如病毒毒株基因组。9条基因组全长均为7495bp,并通过系统发育分析对其基因型进行了验证。结论:根据一种新颖的"4+1+1"扩增策略,本文成功建立了一种快速、灵敏的gII.17型诺如病毒基因组扩增方法。意义:本文建立的新方法可作为gII.17型诺如病毒基因组信息收集的重要工具,同时已获得的9株广州地区gII.17型诺如病毒基因组序列也将为病毒的进化研究提供重要参考数据。

关键词：诺如病毒 GⅡ.17 基因组测序理性设计系统发育分析

来源： cnki会议评论

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中国卫生检验杂志 2020年第6期30卷 666-668,672页

作者：陈莉萍纪蕾沈月华徐德顺湖州市疾病预防控制中心浙江湖州313000

目的研究湖州地区诺如病毒(NoV)的流行病学模式和遗传特征。方法2015年1月-2017年12月,收集急性胃肠炎患者的粪便标本,进行实时RT-PCR(qPCR)检测NoV。RT-PCR用于基因组扩增和序列测定。病毒基因型别使用在线NoV分型工具(http://www.rivm... 详细信息

目的研究湖州地区诺如病毒(NoV)的流行病学模式和遗传特征。方法2015年1月-2017年12月,收集急性胃肠炎患者的粪便标本,进行实时RT-PCR(qPCR)检测NoV。RT-PCR用于基因组扩增和序列测定。病毒基因型别使用在线NoV分型工具(http://www.***.nl/mpf/norovirus/typingtool)分型。结果NoV感染的总体流行率为23.7%(414/1757)。在414个NoV阳性标本中,393个被鉴定为NoV gⅡ,11个属于NoV gⅠ,10个是NoV gⅠ和gⅡ共同感染。共235份标本成功测序,这3年的主要流行型别是gⅡ.Pe-gⅡ.4 Sydney2012和gⅡ.P17-GⅡ.17,2017年还出现新的流行优势株gⅡ.P16-gⅡ.2。全年均检测到NoV感染,流行高峰发生在每年的冬春期间。结论在2014年10月GⅡ.17首次在湖州出现后,稳步取代了以前流行的gⅡ.4 Sydney 2012菌株。但在2016年gⅡ.4 Sydney 2012又回到主导地位,2017年出现新的流行优势株gⅡ.P16-gⅡ.2。

关键词：诺如病毒 GⅡ.17 急性胃肠炎 gⅡ.P16-gⅡ.2