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民猪foxn1基因的表达规律及对低温应答反应

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中国兽医学报 2017年第8期37卷 1589-1593,1604页

作者：张冬杰李苓王鑫鑫汪亮杨国伟刘娣黑龙江省农业科学院畜牧研究所黑龙江哈尔滨150086 东北农业大学动物科学技术学院黑龙江哈尔滨150030

胸腺是哺乳动物的一个重要免疫器官,foxn1在调节胸腺上皮细胞发育中起着重要作用。猪既是一种肉用型家养动物,同时也是一种新型的实验动物模型。为了更好的了解和掌握猪自身免疫的发展特点,本试验采用Realtime PCR结合Western blot技术... 详细信息

胸腺是哺乳动物的一个重要免疫器官,foxn1在调节胸腺上皮细胞发育中起着重要作用。猪既是一种肉用型家养动物,同时也是一种新型的实验动物模型。为了更好的了解和掌握猪自身免疫的发展特点,本试验采用Realtime PCR结合Western blot技术对2,4,6,8月龄民猪胸腺内foxn1的表达变化进行了检测,同时也分析了冷应激后foxn1基因在耐冷型民猪和非耐冷型大白猪胸腺内的表达变化情况。结果表明,foxn1基因在4月龄民猪胸腺内的表达水平最高,从6月龄开始出现下降,与已知人、小鼠的foxn1表达变化趋于一致。冷应激会促进民猪胸腺foxn1基因的转录与表达,但对大白猪无效。

关键词：民猪大白猪胸腺 foxn1基因

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猪foxn1基因转录变异体亚细胞定位研究

东北农业大学学报 2016年第8期47卷 55-59页

作者：张冬杰李苓汪亮刘娣黑龙江省农业科学院畜牧研究所哈尔滨150086 东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030

Fox N1基因主要表达于胸腺上皮细胞和皮肤角质细胞,在胸腺发育、T细胞增殖、毛发生长、指甲发育等方面发挥重要作用。Fox N1基因存在多种转录变异体,人类Fox N1基因已发现18种转录变异体。转录变异体的存在使基因差异表达和蛋白质多样... 详细信息

Fox N1基因主要表达于胸腺上皮细胞和皮肤角质细胞,在胸腺发育、T细胞增殖、毛发生长、指甲发育等方面发挥重要作用。Fox N1基因存在多种转录变异体,人类Fox N1基因已发现18种转录变异体。转录变异体的存在使基因差异表达和蛋白质多样性存在可能。为深入研究转录变异体生物学功能,研究将前期发现的猪Fox N1基因3种转录变异体分别连入p EGFP-N1载体内,构建各自融合蛋白,转入猪PK15细胞,利用荧光显微镜观察转录变异体亚细胞定位情况。结果表明,p EGFP-N1空载体转染表达绿色荧光蛋白在PK15细胞核和细胞质均匀分布,而重组载体p EGFP-N1-Fox N1(a/b/c)表达的融合蛋白仅在细胞核内均匀分布。结果可为3种转录变异体后续功能研究奠定基础。

关键词：猪 foxn1基因转录变异体细胞定位

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民猪foxn1基因启动子核心区的鉴定及对冷应激的应答研究

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民猪FoxN1基因启动子核心区的鉴定及对冷应激的应答研究

作者：王鑫鑫东北农业大学

学位级别：硕士

应激反应通常是在动物受到较大频率、较长时间或较短时间但变化剧烈的刺激时产生的,这种应激反应会改变动物机体内环境稳定性、生理和行为等。冷应激是最常见的一种应激反应,会造成机体免疫力下降,生长缓慢,严重的可导致死亡。胸腺是动... 详细信息

应激反应通常是在动物受到较大频率、较长时间或较短时间但变化剧烈的刺激时产生的,这种应激反应会改变动物机体内环境稳定性、生理和行为等。冷应激是最常见的一种应激反应,会造成机体免疫力下降,生长缓慢,严重的可导致死亡。胸腺是动物机体一个重要的免疫器官,是T淋巴细胞的发生场所。叉头蛋白N1(Forkhead box protein N1,foxn1)作为翼状螺旋/叉头型转录因子家族的一员,它的突变或缺失都会引起胸腺发育出现严重障碍或缺失的现象,因此该转录因子在维持胸腺细胞、支持T细胞发育中扮演重要角色。本研究针对猪的foxn N1基因,采用分子生物学方法,对该基因的转录调控以及冷应激对该基因的调控机理进行了研究。主要内容包括:克隆了民猪foxn1基因5’侧翼的1 001bp序列;通过生物信息学方法预测猪foxn1基因5’侧翼区1 001bp内潜在转录因子的结合位点;构建不同长度缺失片段猪foxn1基因5’侧翼序列调控的报告基因荧光表达载体,利用双荧光素酶报告系统分析猪foxn1基因核心启动子区域位置,利用过表达技术对筛选出的转录因子进行验证。采用定量PCR检测民猪和大白猪的foxn1基因冷应激后在转录水平上的变化;采用Western-blot检测民猪和大白猪的foxn1基因冷应激后在翻译水平上的变化。主要结果如下:(1)克隆了猪foxn1基因5’侧翼的1 001bp序列,经测序及序列比对,该基因与Gen Bank中猪foxn1序列(NC10454)同源性达到93.63%。(2)启动子活性检测过程中,第一轮构建了3个系列缺失载体,将起始密码子ATG中的A定义为+1,分别命名为p A(-973/+28)-foxn1、pB(-620/+28)-foxn1和pC(-224/+28)-foxn1。第二轮构建3个质粒,分别命名为p D(-332/+28)-foxn1、p E(-438/+28)-foxn1和p F(-530/+28)-foxn1。以上各质粒经Nhe I和HindⅢ双酶切鉴定并测序后证明构建成功。(3)克隆了猪GATA-1基因完整编码区1 239bp,经测序及序列比对,该基因与Gen Bank中猪GATA-1序列(NC10461)同源性达到99%。克隆了猪SP1基因完整编码区2 361bp,经测序及序列比对,该基因与Gen Bank中猪SP1序列(NC10447)同源性达到99%。上述两个基因分别连入pcDNA3.1(+)载体,经Eco R I和Xba I双酶切鉴定及测序,成功构建了GATA-1和SP1的真核表达载体。(4)经双荧光素酶检测发现ATG上游-298bp291bp处的GATA-1及SP1转录元件是影响foxn1基因启动子活性的关键区域,分别单独缺失该转录元件结合区域会显著影响foxn1基因的启动子活性。过表达SP1转录因子可以显著促进foxn1基因的表达,证实SP1转录因子是foxn1基因转录的关键因子。(5)Real-time PCR和Western-blot结果均表明,冷应激后,民猪胸腺中foxn1基因的表达量显著上升(pfoxn1基因的表达呈下降趋势。

关键词：民猪 foxn1基因转录因子冷应激

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民猪foxn1基因序列及组织表达特征分析

民猪FoxN1基因序列及组织表达特征分析

作者：李芩东北农业大学

学位级别：硕士

叉头蛋白N1(Forkhead box protein N1,Fox N1)是翼状螺旋/叉头(Forkhead)转录因子家族成员,在胸腺遗传网络上占据重要位置。Fox N1基因是一个与胸腺发育及毛发生长相关的重要基因,它的缺失会导致严重的胸腺发育不健全,甚至是免疫缺陷。... 详细信息

叉头蛋白N1(Forkhead box protein N1,Fox N1)是翼状螺旋/叉头(Forkhead)转录因子家族成员,在胸腺遗传网络上占据重要位置。Fox N1基因是一个与胸腺发育及毛发生长相关的重要基因,它的缺失会导致严重的胸腺发育不健全,甚至是免疫缺陷。目前,针对民猪Fox N1基因序列的研究尚未出现报道。试验旨在对民猪Fox N1基因的功能进行初步探究。利用常规PCR技术对民猪Fox N1基因进行克隆,包括foxn1基因组序列的克隆以及完整编码区序列的克隆。利用生物信息学手段对所获得Fox N1基因完整编码区序列进行分析,对民猪和大白猪的foxn1基因编码区序列进行比对,进而对遗传变异位点进行分析。采用RT-PCR方法检测Fox N1基因在所采集的各类组织样品中的表达情况。以2月龄、4月龄、6月龄和8月龄的民猪为实验材料,采用定量PCR检测foxn1在mRNA水平的转录情况,采用Western-blot检测foxn1在蛋白水平的翻译情况。本实验的研究结果如下:(1)成功克隆了民猪foxn1基因组序列14 730bp。包括8个外显子和7个内含子。外显子的位置从1到8分别是从1-123,518-976,3 732-3 842,5 512-5 642,7 800-7 896,11 390-11 597,11 746-12 237,14 411-14 730。(2)成功克隆了民猪foxn1基因完整编码区序列,大小为1 941 bp,编码646个氨基酸,分子质量为68.64 k Da,理论等电点为5.81。Fox N1蛋白位于细胞核内,不存在信号肽,不是分泌性蛋白质,不存在跨膜区,在第269-347氨基酸处有1个叉头结构域,该蛋白在不同的物种间有高度的保守性。利用BLAST比对的方法获得了42个物种的foxn1基因编码区序列,利用MEGA6.0软件构建了基于Fox N1基因序列的分子进化树,发现民猪与牛、水牛、绵羊、藏羚羊等偶蹄目动物聚为一类,亲缘关系较近其余物种也都符合物种进化规律,聚在不同的分支上。(3)成功构建了pEGFP-N1-foxn1-a/b/c质粒,瞬时转染PK15细胞,用荧光倒置显微镜观察到Fox N1蛋白主要表达于细胞核中。(4)通过克隆发现了民猪Fox N1基因在胸腺组织的3种转录剪切变异体,符合可变剪切体的几种形式。与变异体1相比,变异体2在第124-387核苷酸位置处发生缺失,序列大小为1 677bp,变异体3在581-582核苷酸位置处发生GCA插入,序列大小为1 944bp。(5)将民猪与大白猪的Fox N1基因完整编码区序列进行比较,发现存在4个明显突变位点,其中3个是同义突变,1个是错义突变,并导致第108位的氨基酸发生了改变。(6)对民猪foxn1基因在13个组织中进行表达检测,结果表明其仅在皮肤、胸腺和舌上有显著表达。(7)foxn1基因在不同月龄的民猪胸腺组织进行荧光定量PCR操作,在4月龄的表达量显著提高。(8)Fox N1基因在不同月龄的民猪胸腺组织进行Western-blot操作,在4月龄的表达量显著提高。

关键词：民猪 foxn1基因基因克隆序列分析表达

Ghrelin对非洲雏鸵鸟胸腺生长发育的影响

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中国家禽 2024年

作者：蒋金凤李白涛周峰王家乡李鹏长江大学动物科学技术学院松滋市畜牧兽医服务中心

为探明注射外源性生长素释放肽（Ghrelin）对非洲雏鸵鸟胸腺生长发育的影响，试验将16只7日龄非洲雏鸵鸟随机分为4组，每组4个重复，饲养33 d后采用趾静脉内注射不同剂量（0、10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg）Ghrelin,取胸腺组织进行石... 详细信息

为探明注射外源性生长素释放肽（Ghrelin）对非洲雏鸵鸟胸腺生长发育的影响，试验将16只7日龄非洲雏鸵鸟随机分为4组，每组4个重复，饲养33 d后采用趾静脉内注射不同剂量（0、10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg）Ghrelin,取胸腺组织进行石蜡包埋、切片，采用HE染色、TUNEL技术、免疫组织化学染色、qPCR技术，对雏鸵鸟胸腺形态学、胸腺细胞凋亡及胸腺中foxn1基因进行研究。结果显示：(1)与对照组相比，注射10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg Ghrelin后，非洲雏鸵鸟胸腺指数和胸腺重量都会降低（Pfoxn1阳性细胞主要分布在髓质中，皮质部和皮髓交界处也有少量分布；各剂量组胸腺内foxn1阳性细胞MD值均低于对照组，以100μg/kg剂量组显著降低（Pfoxn1 mRNA表达水平均低于对照组（Pfoxn1基因表达，从而抑制胸腺的正常发育，影响雏鸵鸟的免疫调节能力。

关键词：非洲鸵鸟 Ghrelin 胸腺 foxn1基因细胞凋亡

Visfatin对脂多糖(LPS)诱导的大鼠胸腺内foxn1及相关基因表达的调节作用研究

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Visfatin对脂多糖(LPS)诱导的大鼠胸腺内Foxn1及相关基因表达的调...