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利用锁核酸化学偶联fokⅰ核酸酶靶向切割HBV基因的体外实验

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遗传 2016年第4期38卷 350-359页

作者：马丽陈红岩朱化星李威卢大儒复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室上海200433 上海近岸科技有限公司上海201203 生工生物工程(上海)股份有限公司上海201611

乙肝病毒（HBV）是有缺口的双链DNA病毒,侵入人体肝细胞后形成共价闭合环状DNA（ccc DNA）持续复制,并在逆转录过程中随机整合入宿主基因组。慢性乙型肝炎感染者平均每个细胞中含有33个ccc DNA拷贝,半衰期长达35~57 d,很难从体内彻底清... 详细信息

乙肝病毒（HBV）是有缺口的双链DNA病毒,侵入人体肝细胞后形成共价闭合环状DNA（ccc DNA）持续复制,并在逆转录过程中随机整合入宿主基因组。慢性乙型肝炎感染者平均每个细胞中含有33个ccc DNA拷贝,半衰期长达35~57 d,很难从体内彻底清除。利用锁核酸抑制HBV转录,是乙肝治疗的新策略。此外,利用基因组编辑技术靶向切割HBV基因组,有望从源头治愈乙型肝炎。基于锁核酸与双链DNA形成三股螺旋的能力、抵御核酸酶及聚合酶的稳定性以及对单碱基错配的敏感性,本研究以靶向切割乙型肝炎病毒为例,设计构建锁核酸修饰的寡核苷酸作为DNA结合域,有效增强对靶基因的特异性识别;同时利用fokⅰ核酸酶分子量小、二聚化时才具有酶活等特点,设计构建fokⅰ切割域二聚体重组蛋白作为DNA切割域;进而通过双功能交联剂GMBS,建立了5′端氨基（-NH2）修饰的锁核酸与N端巯基（-SH）修饰的fokⅰ核酸酶定向化学偶联的方法,并在体外验证了新型工具对HBV基因的靶向切割。该方法为此后在体内进行高特异性、无整合风险的抗病毒基因治疗提供了全新的技术思路。

关键词：乙肝病毒基因编辑锁核酸 fokⅰ 化学偶联

维生素D受体fok Ⅰ基因多态性对SLE患者维生素D受体表达的影响

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细胞与分子免疫学杂志 2011年第8期27卷 901-905页

作者：罗雄燕武丽君杨明辉刘宁涛廖涛唐中曾小峰袁国华川北医学院附属医院风湿免疫研究所四川南充637000 新疆维吾尔自治区人民医院风湿科新疆乌鲁木齐830000 遂宁市中心医院风湿科四川遂宁629000 北京协和医院风湿科北京100730

目的:检测维生素D受体(VDR)fokⅰ基因多态性与系统性红斑狼疮(SLE)的相关性,以及对SLE患者VDR mRNA表达的影响。方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测VDRfokI基因位点及基因型在271例SLE患者和130例健康... 详细信息

目的:检测维生素D受体(VDR)fokⅰ基因多态性与系统性红斑狼疮(SLE)的相关性,以及对SLE患者VDR mRNA表达的影响。方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测VDRfokI基因位点及基因型在271例SLE患者和130例健康人中的分布情况;并应用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测VDR mRNA在48例SLE患者和38例健康对照组的表达。结果:VDRfokⅰ多态性等位基因F和f频率在SLE组和健康对照组有统计学差异(P=0.001),携带F等位基因个体发生SLE的相对危险度(OR)为1.630(95%CI=1.210-2.196,P=0.001);FF纯合子基因型频率在SLE组也明显高于健康对照组(42.8%vs25.4%,χ2=11.417,P=0.001)。同时,携带F等位基因的SLE患者(FF基因型和Ff基因型患者),浆膜炎发生率(P=0.001)及抗ds-DNA抗体(P=0.001)、抗Sm抗体(P=0.047)和抗组蛋白抗体(P=0.001)阳性率较F等位基因阴性SLE患者(ff基因型患者)明显升高。VDR mRNA在48例SLE患者表达下调,其?Ct值(?Ct值越大,表达量越小)为9.26±2.37,高于健康对照组的7.82±3.05(P=0.026)。而在SLE患者,携带F等位基因患者的VDR mRNA的?Ct值明显高于F等位基因阴性患者(10.54±1.88vs7.15±3.78,P=0.019)。结论:VDRfokⅰ多态性与SLE发病易感性有关,而且携带F等位基因的患者更容易发生浆膜炎和产生抗ds-DNA抗体和抗Sm抗体等自身抗体,此可能与F等位基因下调SLE患者的VDR mRNA表达有关。

关键词：红斑狼疮系统性维生素D受体 fokⅰ 基因多态性

利用dCas9-fokⅰ编辑大鼠Dnmt1基因

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第7期32卷 841-848页

作者：张旭于磊陈炜高珊潘硕张连峰马元武中国医学科学院&北京协和医学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而,该系统在提供靶向性基因修饰的同时,会产生一些不需要的突变,即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性,我们将野生型fok I核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas... 详细信息

CRISPR/Cas9的发现为多种生物的基因编辑提供了强有力的工具。然而,该系统在提供靶向性基因修饰的同时,会产生一些不需要的突变,即脱靶现象。为提高CRISPR/Cas9的特异性,我们将野生型fok I核酸内切酶的功能结构域与催化功能区失活的Cas9蛋白(dCas9)进行融合,形成融合蛋白用于降低脱靶效应。fokⅰ是一种依赖于二聚化才能行使内切酶活性的核酸酶,在本研究中,通过将fokⅰ功能结构融合到dCas9的N端,构建表达质粒p ST1374-dCas9-fokⅰ。我们前期研究中,发现一个sgRNA在介导Cas9编辑Dnmt1基因建立条件敲除大鼠时,存在显著的脱靶现象。以此为基础,我们利用dCas9-fokⅰ/sgRNA系统编辑大鼠Dnmt1基因,研究该系统是否能够进行基因编辑以及是否能够提高基因编辑特异性。将转录好的dCas9-fokⅰmRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠的受精卵中,用于产生基因编辑大鼠。通过显微注射以及胚胎移植,最终获得43只F0代大鼠,其中两只在靶点位置包含突变,突变效率达4.5%。对脱靶情况进行分析,结果显示,无脱靶现象存在。综上,表明dCas9-fokⅰ/sgRNA可以应用于编辑大鼠基因,并能显著提高特异性。尽管dCas9-fokⅰ/sgRNA系统相比于Cas9/sgRNA系统,基因编辑效率有所下降,但是该技术的发展为基因治疗提供了可供选择的潜在工具。

关键词： Dnmt1 基因编辑大鼠 dCas9 fokⅰ 脱靶

骨化三醇对不同维生素D受体fokⅰ基因型人牙周膜细胞增殖的抑制作用

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上海口腔医学 2009年第4期18卷 422-426页

作者：唐晓琳孟焕新中国医科大学口腔医学院牙周科辽宁沈阳110002 北京大学口腔医学院牙周科北京100081

目的:观察骨化三醇[1,25-(OH)2D3,VD3]对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)增殖的作用并分析维生素D受体fokⅰ多态性位点(rs2228570,T/C)对此作用的影响。方法:原代培养个体来源hPDLCs群,限制性内切酶片段长度多... 详细信息

目的:观察骨化三醇[1,25-(OH)2D3,VD3]对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)增殖的作用并分析维生素D受体fokⅰ多态性位点(rs2228570,T/C)对此作用的影响。方法:原代培养个体来源hPDLCs群,限制性内切酶片段长度多态性法检测细胞群维生素D受体fokⅰ多态性位点基因型。选取第4代具有FF、Ff、ff基因型hPDLCs群,用0.1%无水乙醇(对照组)、10-14～10-8 mol/L VD3分别处理1d、3d、5d、7d,MTT法检测细胞的增殖情况。用SPSS11.5软件包对数据进行单因素方差分析和LSD Post Hoc检验。结果:VD3以时间和剂量依赖性抑制3种基因型hPDLCs群的增殖。与对照组和其他各浓度组相比,10-8mol/L VD3的抑制作用最强,第5天或第7天达到最大抑制效应。与相应的对照组比较,对FF细胞群产生显著抑制效应的最低VD3浓度为10-12mol/L(PFf>ff(Pfokⅰ多态性位点可能对这一过程产生影响。

关键词：人牙周膜细胞骨化三醇增殖维生素D受体 fokⅰ

过敏性紫癜儿童维生素D水平及其受体fokⅰ基因多态性研究

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过敏性紫癜儿童维生素D水平及其受体FokⅠ基因多态性研究

作者：王贝贝青岛大学

学位级别：硕士

目的探讨血清25-羟基维生素D[25-（OH）D]水平及维生素D受体（VDR）fokⅰ基因多态性与过敏性紫癜（HSP）的关系。方法收集2017年2月至2017年12月在青岛大学附属医院儿童医学中心心肾免疫儿科住院治疗的过敏性紫癜患儿107例,作为病例组,... 详细信息

目的探讨血清25-羟基维生素D[25-（OH）D]水平及维生素D受体（VDR）fokⅰ基因多态性与过敏性紫癜（HSP）的关系。方法收集2017年2月至2017年12月在青岛大学附属医院儿童医学中心心肾免疫儿科住院治疗的过敏性紫癜患儿107例,作为病例组,分为HSP无肾损害组（NHSPN,79例）及HSP有肾损害组（HSPN,28例）,同时选取我院儿保科健康查体的同龄儿童76例作为对照组。采用电化学发光法检查外周血25-羟基维生素D水平,采用一代测序技术检测VDR基因fokⅰ单核苷酸多态性。结果***组血清25-（OH）D水平显著低于对照组[t=-19.90,P0.05;t=0.05,P>0.05]。*** fokⅰ基因T/C位点基因型分为野生型TT,突变型TC、CC,在HSP组和对照组内均检测到这三种基因型,但在两组内的分布无明显的差别（X=0.76,P>0.05）,等位基因T、C分布频率在两组中无统计学意义（X=0.63,P>0.05）。*** fokⅰ基因T/C位点TT、CT、CC基因型分布频率在NHSPN组（15.19%,60.75%,20.06%）与HSPN组（17.86%,60.71%,21.43%）比较未见显著性差异（X=0.15,P>0.05）;同样T、C等位基因分布频率在NHSPN组（45.57%,54.43%）与HSPN组（48.21%,51.79%）中也未见显著的统计学差异（X=0.12,P>0.05）。结论1.血清25-羟基维生素D水平低下与过敏性紫癜及紫癜性肾炎发病相关。*** fokⅰ基因位点TT、CT、CC基因型及T、C等位基因多态性可能与过敏性紫癜及紫癜性肾炎的发病无关。

关键词：过敏性紫癜维生素D 维生素D受体 fokⅰ

维生素D受体基因启动密码子fokⅰ位点多态性与泌尿系结石关联性的Meta分析

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中华临床医师杂志(电子版) 2013年第22期 10178-10185页

作者：徐畅曾宪涛肖和罗乐刘同族武汉大学中南医院泌尿外科湖北医药学院附属太和医院循证医学中心武汉大学公共卫生学院

目的探讨维生素D受体(VDR)基因启动密码子fokⅰ位点多态性与泌尿系统结石的关联性。方法计算机检索PubMed、Embase、中国知网、维普中文科技期刊数据库、万方数据库,查找并筛选出研究VDR基因fokⅰ位点多态性与泌尿系结石关系的病例对照... 详细信息

目的探讨维生素D受体(VDR)基因启动密码子fokⅰ位点多态性与泌尿系统结石的关联性。方法计算机检索PubMed、Embase、中国知网、维普中文科技期刊数据库、万方数据库,查找并筛选出研究VDR基因fokⅰ位点多态性与泌尿系结石关系的病例对照研究(case-control study),同时查阅检索结果中所附相似文献及参考文献,检索时限均为建库至2013年10月12日。由两名评价员单独进行文献筛选及资料提取,采用StataSE 12.0软件进行Meta分析及其他统计学分析。结果共纳入文献15篇,结石患者共2422例,健康人2554例。Meta分析结果显示,各模型下整体效应均无统计学意义(P>0.05),亚组分析结果显示,在印度人和伊朗人中fokⅰ位点多态性与泌尿系结石有统计学意义:等位基因模型ORIndian=1.44,95%CI(1.01,2.06),ORIran=0.32,95%CI(0.21,0.48);显性模型ORIran=0.09,95%CI(0.04,0.23);隐性模型ORIndian=2.49,95%CI(1.40,4.42),ORIran=0.46,95%CI(0.26,0.80);共显性模型下ff/FF组ORIran=0.09,95%CI(0.04,0.24),ff/Ff组ORIndian=0.43,95%CI(0.24,0.76),ORIran=0.09,95%CI(0.03,0.24);超显性模型下,ORIndian=0.36,95%CI(0.24,0.53);ORIran=0.49,95%CI(0.27,0.88)。结论 fokⅰ位点多态性可能与印度人泌尿系结石有一定相关性。还不能认为VDR基因启动密码子fokⅰ位点多态性与中国人泌尿系结石的形成存在关联性。fokⅰ位点多态性与伊朗人泌尿系结石的形成可能有关,但尚缺乏充分证据。

关键词：受体,骨化三醇多态性,单核苷酸尿路结石 Meta分析病例对照研究 fokⅰ

维生素D受体fokⅰ基因多态性与内蒙古地区蒙汉人群糖尿病肾病的相关性研究

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医学综述 2012年第8期18卷 1243-1245页

作者：常永丽内蒙古医学院附属医院肾内科呼和浩特010050

目的探讨维生素D受体基因fokⅰ酶切位点多态性与内蒙古蒙汉人群糖尿病肾病之间的关系。方法选择2008年6月至2010年8月在内蒙古医学院附属医院肾内科及内分泌科住院的糖尿病肾病(DN)患者287例,其中蒙古族患者117例,汉族患者170例。分别... 详细信息

目的探讨维生素D受体基因fokⅰ酶切位点多态性与内蒙古蒙汉人群糖尿病肾病之间的关系。方法选择2008年6月至2010年8月在内蒙古医学院附属医院肾内科及内分泌科住院的糖尿病肾病(DN)患者287例,其中蒙古族患者117例,汉族患者170例。分别采静脉血1 mL,运用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析方法测定所有患者维生素D受体fokⅰ基因多态性等位基因频率和基因型频率。结果全部研究对象中共见FF、ff、Ff三种基因型。蒙古族糖尿病肾病患者FF基因型频率为37.8%、ff基因型频率为22.2%,Ff基因型频率为40%,而汉族糖尿病肾病患者的频率分别为55.1%、9%和35.9%。结论内蒙古地区蒙古族与汉族的糖尿病肾病与VDR基因fokⅰ多态性有关联性;F等位基因可能是内蒙古地区蒙古族糖尿病肾病的易感因素。

关键词：糖尿病肾病维生素D受体 fokⅰ 基因多态性 PCR-RFLP

川崎病儿童血清维生素D水平及其受体fok Ⅰ基因多态性研究

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中国妇幼保健 2020年第3期35卷 459-462页

作者：蒋华芳高健韩文宁潍坊市妇幼保健院儿科

目的分析潍坊地区川崎病儿童血清25-羟基维生素D3[25-(OH)D3]水平及其受体fok Ⅰ基因多态性,探讨维生素D水平与川崎病冠脉损伤发生的相关性。方法采用病例-对照的研究方法,以98例川崎病患儿为病例组,根据有无冠状动脉损伤(CAL)分为冠脉... 详细信息

目的分析潍坊地区川崎病儿童血清25-羟基维生素D3[25-(OH)D3]水平及其受体fok Ⅰ基因多态性,探讨维生素D水平与川崎病冠脉损伤发生的相关性。方法采用病例-对照的研究方法,以98例川崎病患儿为病例组,根据有无冠状动脉损伤(CAL)分为冠脉损伤组(CAL组) 24例和非冠脉损伤组(NCAL组) 74例,选择同期80例健康儿童为对照组,通过酶联免疫法检测各组儿童血清25-(OH)D3水平,采用PCR聚合酶链反应和基因测序法对维生素D受体(VDR) fok Ⅰ位点基因多态性进行检测,并对3组儿童的基因型和等位基因频率进行比较。结果 CAL组和NCAL组患儿25-(OH)D3水平低于对照组儿童,以CAL组最低,3组差异均有统计学意义(Pfok Ⅰ位点不同基因型在川崎病组和对照组中的分布差异有统计学意义(P0. 05)。结论维生素D缺乏可能是川崎病发病的危险因素之一,VDR fok Ⅰ多态性与川崎病发病有一定相关性。

关键词：维生素D 受体 fokⅰ 川崎病冠状动脉损伤

长春市汉族人群维生素D受体基因多态性、TGF-β、TRACP与腰椎骨密度的相关性

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中国骨质疏松杂志 2025年

作者：马倩倩毛未贤高远尹纪伟程海涛吉林省一汽总医院

目的研究长春市35～79岁汉族人群维生素D受体基因BsmⅠ、fokⅰ位点多态性的分布特征及其与腰椎骨密度（bone mineral density，BMD）的相关性，分析不同基因型对骨代谢的调节与影响，同时研究血清TGF-β、TRACP水平与腰椎BMD的相关性... 详细信息

目的研究长春市35～79岁汉族人群维生素D受体基因BsmⅠ、fokⅰ位点多态性的分布特征及其与腰椎骨密度（bone mineral density，BMD）的相关性，分析不同基因型对骨代谢的调节与影响，同时研究血清TGF-β、TRACP水平与腰椎BMD的相关性，为骨质疏松预防、早期诊断和治疗提供分子生物学依据。方法应用Hologic Discovery WA型骨密度仪检测腰椎正位（L1-L4）BMD；采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析BsmⅠ和fokⅰ位点多态性；采用酶联免疫吸附分析法检测血清TGF-β、TRACP水平应用；采用SPSS 23.0软件进行统计分析。结果在500名汉族人群中，BsmⅠ位点基因型以bb型为主，占80.2%，Bb型占15.2%，BB型占4.6%；fokⅰ位点ff基因型占18.6%，Ff型占45.8%，FF型占35.6%。BsmⅠ位点各基因型骨质疏松组与非骨质疏松组分布特征组间差异无统计学意义（P＞0.05）；fokⅰ位点ff基因型骨质疏松组所占比例高于非骨质疏松组，差异有统计学意义（P＜0.05）。BsmⅠ位点bb基因型男性、女性BMD值均低于Bb型和BB型，但差异无统计学意义（P＞0.05）；fokⅰ位点ff基因型男性、女性BMD值均低于Ff型和FF型，差异有统计学意义（P＜0.05）。血清TGF-β水平骨质疏松组显著低于非骨质疏松组，而TRACP水平骨质疏松组高于非骨质疏松组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论本研究500名汉族人群中，BsmⅠ位点以bb基因型为主，占80.2%，各基因型骨密度值组间差异无统计学意义；fokⅰ位点ff型BMD值低于Ff型和FF型，骨质疏松组ff基因型所占比例高于非骨质疏松组，差异有统计学意义，提示ff 基因型可能是骨质疏松发生的危险因素；骨质疏松组血清TGF-β水平显著低于非骨质疏松组，而TRACP水平高于非骨质疏松组，差异有统计学意义，表明TGF-β、TRACP是评价骨代谢状态的良好指标。

关键词：维生素D 受体基因 BsmⅠ fokⅰ 转化生长因子-β 抗酒石酸酸性磷酸酶腰椎骨密度