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嗜肺军团菌效应蛋白LidE的功能初探

嗜肺军团菌效应蛋白LidE的功能初探

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作者：何达明福建师范大学

学位级别：硕士

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一类可引起被称为“军团病”的重症肺炎的机会致病菌。该细菌侵染人肺泡巨噬细胞后,引起发热伴随脏器损伤进而导致人由于器官衰竭而死亡。嗜肺军团菌的致病性依赖于其独特的IVB型分泌系统（Type ... 详细信息

嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一类可引起被称为“军团病”的重症肺炎的机会致病菌。该细菌侵染人肺泡巨噬细胞后,引起发热伴随脏器损伤进而导致人由于器官衰竭而死亡。嗜肺军团菌的致病性依赖于其独特的IVB型分泌系统（Type IVB Secretion system,T4BSS）,其中IVB分泌系统向宿主细胞内转运的效应蛋白对于细菌侵染宿主以及胞内生长繁殖至关重要。近年来研究人员发现军团菌效应蛋白可介导多种蛋白质翻译后修饰,如腺苷酸化修饰（AMPylation）,以促进细菌感染以及胞内生长。实验室前期解析了效应蛋白LidE（Lpg2406）的晶体结构,尽管其与腺苷酸转移酶fic（Filamentation induced by c AMP）家族的结构高度相似,但LidE却不具有腺苷酸转移酶的活性。为探究效应蛋白LidE的生物学功能,本研究以嗜肺军团菌效应蛋白LidE为研究对象,结合结构生物学、体外生化实验和细胞功能试验等方法解析LidE的功能,阐明LidE在嗜肺军团菌感染过程中发挥的生物学功能。本论文的主要研究结果如下:（1）通过高通量筛选及等温滴定量热实验（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）验证发现LidE特异性结合核苷酸分子UTP及UDP。（2）通过X-射线晶体衍射技术解析了LidE-UTP-Mn以及LidE-UDP的复合物结构,并揭示了其UTP/UDP结合口袋及其关键氨基酸S45、R49、R112、及S301。（3）利用UTP类似物UTPαS和Biotin-16-UTP证明LidE具有催化磷酸尿苷化修饰（UMPylation）的酶学活性,且其活性具有金属离子依赖性,如Mn和Zn。（4）通过分析LidE-UDP以及LidE-UTP-Mn复合物结构及点突变实验验证,发现氨基酸R49、D52、Q294及S301对其酶活性至关重要。其中,在LidE-UTP-Mn复合物结构中,氨基酸D52和S301靠近UTP分子α磷酸基团,推测D52、Q294及S301是LidE的催化位点,其中S301起主要的亲核攻击作用。（5）我们使用免疫荧光实验对效应蛋白LidE的亚细胞定位进行探究发现LidE大量分布于细胞核。总之,我们初步证明嗜肺军团菌效应蛋白LidE具有催化UMPylation的酶学活性,且发现其可能定位于细胞核发挥功能,我们将继续筛选底物蛋白进而阐述其在嗜肺军团菌侵染宿主过程中发挥的生物学机制。

关键词：嗜肺军团菌 LidE fic酶磷酸尿苷酸化修饰

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