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柑橘FhRWP基因互作蛋白的筛选及验证

柑橘FhRWP基因互作蛋白的筛选及验证

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作者：曹榛华中农业大学

学位级别：硕士

柑橘具有独特的多胚现象,即位于胚囊外的珠心组织细胞发育成胚的过程,属于孢子体无融合生殖。这种多胚特性使得柑橘常规杂交育种受到阻碍,制约了柑橘的育种进程。前人研究表明CitRWP可能控制柑橘珠心胚的形成,并在多胚的哈姆林甜橙(Haml... 详细信息

柑橘具有独特的多胚现象,即位于胚囊外的珠心组织细胞发育成胚的过程,属于孢子体无融合生殖。这种多胚特性使得柑橘常规杂交育种受到阻碍,制约了柑橘的育种进程。前人研究表明CitRWP可能控制柑橘珠心胚的形成,并在多胚的哈姆林甜橙(Hamlin)上干涉CitRWP表现出多胚性状消失,成为单胚类型,产生了有性生殖的子代;同时推测,因基因上游133 bp处存在一个微小型转座子(MITE)激活了CitR WP基因的表达。该基因是如何调控多胚性状的尚不清晰。本实验室前期利用童期较短的金柑属植物山金柑(Fortunella hindsii)(最短至8个月开花)为材料建立多胚和单胚杂交的F1代分离群体,并验证了同一个染色体区段的FhRWP基因与多胚也存在共分离,FhRWP基因启动子上同样存在一个MITE转座子,并命名为FhpMITE,推测与CitRWP基因上的MITE为同一调控机制。本研究以山金柑为实验材料,取多胚山金柑的胚珠构建酵母文库,利用酵母单杂交系统筛选出互作蛋白fharid,并结合双荧光素酶实验进行验证,利用生物信息学分析fharid的结构与功能,并在山金柑上进行基因编辑,以期获得相关表型,探究其与柑橘多胚表型之间的联系,以解析柑橘单/多胚形成机制。主要研究结果如下:1.利用多胚山金柑胚珠构建酵母文库,基于FhpMITE序列构建诱饵菌株,通过酵母单杂交筛选出5个相关的转录因子,分别为fharid、FhDUF155、FhSP1L1、FhATG8f以及FhTFIIB1。根据基因功能注释以及文献报道选择fharid作为候选转录因子进行进一步实验验证;2.通过点对点酵母单杂和双荧光素酶实验,验证转录因子fharid可以特异性结合FhpMITE上一段91 bp序列,结合区域具有明显AT-rich结构,对下游FhRWP具有转录激活作用;亚细胞定位分析表明fharid定位于细胞核;qRT-PCR结果显示fharid在胚珠组织中高表达;3.通过氨基酸保守性和家族聚类分析发现候选转录因子fharid具有ARID和HMG-box结构域,属于典型的ARID-HMG亚家族成员,其在山金柑中具有另外2个同源基因;氨基酸序列分析显示ARID蛋白在柑橘上没有明显的结构差异;启动子分析结果发现fharid启动子区域有20种顺式元件,其中以光响应元件最多;结合蛋白互作数据库预测表明fharid参与形成染色质重塑蛋白复合体,能调控染色质结构,进而影响基因的表达;利用CRISPR/spCas9技术和山金柑遗传转化体系敲除fharid基因,获得了 6株基因编辑的山金柑阳性株系,以期获得相关表型。综上所述,本研究筛选到了调控柑橘多胚关键基因FhRWP的上游转录因子fharid,初步解析了 fharid激活FhRWP的相关调控机制;利用柑橘遗传转化体系进行相关功能验证。

关键词：柑橘山金柑多胚 fharid

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